一種含氨基酸片段的膦酸酯衍生物的制備方法及抗腫瘤應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ]本發(fā)明涉及一種抗腫瘤藥物，具體為一種含氨基酸片段的膦酸酯衍生物的制備方 法及抗腫瘤應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 腫瘤是當(dāng)今危害人類健康和生命最嚴(yán)重的疾病之一，因此尋找結(jié)構(gòu)新穎、新作用 機(jī)制抗腫瘤藥物有重大意義。膦酸酯類化合物作為有機(jī)磷衍生物，近年來研究極為廣泛，在 藥物設(shè)計(jì)合成中扮演著重要角色，研究表明該類衍生物具有抗腫瘤、抗菌、抗病毒等多種重 要的生理活性，廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥和農(nóng)藥領(lǐng)域。
[0003] 前期我們?cè)O(shè)計(jì)合成了不同系列膦酸酯衍生物，生物活性測(cè)試發(fā)現(xiàn)不同類化合物有 潛在的抗腫瘤活性。分析幾類化合物的構(gòu)效關(guān)系發(fā)現(xiàn):共有的膦酸酯結(jié)構(gòu)可能是其抗腫瘤 藥效團(tuán)。因此，以膦酸酯為骨架的結(jié)構(gòu)修飾、優(yōu)化及其抗腫瘤作用深入研究十分有必要。
[0004] 眾所周知，氨基酸是重要的生理活性物質(zhì)，是生物體內(nèi)合成肽、蛋白質(zhì)、激素、酶及 抗體的原料，參與多種生物化學(xué)過程活動(dòng)。其中類肽類氨基酸衍生物因分子量小，多存在內(nèi) 源性靶點(diǎn)，與細(xì)胞及核酸具有很好的親和性，極易穿透腫瘤細(xì)胞，提高免疫應(yīng)答，抑制腫瘤 血管形成、腫瘤生長和轉(zhuǎn)移等特點(diǎn)，現(xiàn)已成為抗腫瘤藥物研究的新熱點(diǎn)。將氨基酸片段引入 到藥物分子中，更有利于藥物分子與腫瘤細(xì)胞組織結(jié)合，而發(fā)揮抗腫瘤作用。專家認(rèn)為這是 抗腫瘤藥物一個(gè)很有希望的發(fā)展方向。
[0005] 因此，將膦酸酯活性片段與氨基酸片段結(jié)合，采用基于片段的藥物發(fā)現(xiàn)方法，設(shè)計(jì) 一類全新結(jié)構(gòu)的含氨基酸片段的膦酸酯衍生物進(jìn)行抗腫瘤活性研究，獲取有抗腫瘤先導(dǎo)化 合物，具有很好的前景。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明在前期研究工作的基礎(chǔ)上，采用基于片段的藥物發(fā)現(xiàn)方法，將膦酸酯活性 片段與與氨基酸片段結(jié)合，制備一類含氨基酸片段的膦酸酯衍生物，獲得有前景的抗腫瘤 先導(dǎo)物。
[0007] 為達(dá)到上述目的，采用的技術(shù)方案為：目標(biāo)物含氨基酸片段膦酸酯衍生物的結(jié)構(gòu)
，1?為1-5個(gè)碳的烷基或1-5原子的烷氧基；Ri為Η或鹵素或硝 基1-3個(gè)碳的烷基或1-3個(gè)原子的烷氧基；此為Η或1-5碳的烷基或苯甲基或吲哚-2-甲基 或羥甲基或巰甲基或?qū)αu基苯甲基或氨基甲酰甲基或氨基甲酰乙基或CH2CH2CH2SHOCH (CH3);構(gòu)型:與此直接相連的碳原子為R或S構(gòu)型。其合成反應(yīng)式為：
其制備的具體步驟為： 1) 制備中間體1:將氨基酸溶于四氫呋喃中，冰水浴，加入1- 3倍氨基酸量的碳酸氫鈉 或三乙胺，然后加入1-2倍量的（Boc)20,冰水浴反應(yīng)30-60 min，再室溫反應(yīng)15-20 h，反應(yīng) 液用乙酸乙酯萃取，棄去上層，用酸調(diào)節(jié)pH，再用二氯甲烷萃取，合并下層有機(jī)相，用無水硫 酸鈉干燥，濃縮溶劑，即得； 2) 制備中間體2 :將亞磷酸酯與芳香醛（1:1.5摩爾比投料)加入三頸瓶中，然后加入1-2倍量的三乙胺，40-80°C反應(yīng)1.5 h，再在室溫反應(yīng)24 h，除去三乙胺，重結(jié)晶，即得； 3) 制備中間體3:取中間體1和中間體2(1:1摩爾比投料），加入反應(yīng)瓶中，冰鹽浴加入1 倍量的縮合劑(DCC/DMAP或EDCI/DMAP或HBTU/DIPEA，優(yōu)選的EDCI/DMAP)，以二氯甲烷為溶 劑，溶解縮合劑，室溫反應(yīng)10-12 h，除去不溶物，濃縮溶劑，柱層析法分離純化，即得； 4) 制備化合物（I):取反應(yīng)瓶，加入乙酸乙酯作為溶劑，依次加入1倍量的甲醇和1倍量 的乙酰氯，反應(yīng)3-5 h，然后將0.5-1倍量的中間體3溶于乙酸乙酯中，加入反應(yīng)瓶，冰水浴下 反應(yīng)8-10 h，減壓濃縮，得粘稠液體，柱層析法分離純化，真空干燥，即得目標(biāo)物(I)。
[0008] 這類含氨基酸片段的膦酸酯衍生物是采用基于片段的藥物發(fā)現(xiàn)方法設(shè)計(jì)而成，是 對(duì)前期研究的膦酸酯化合物進(jìn)行優(yōu)化。該類衍生物對(duì)腫瘤細(xì)胞有不同增殖抑制作用。在具 有相同氨基酸結(jié)構(gòu)的目標(biāo)物(I)中，L構(gòu)型較D構(gòu)型氨基酸化合物有明顯的抗腫瘤活性。部分 化合物對(duì)腫瘤細(xì)胞A-549、SGC-7901及EC-109有顯著抗增殖作用，與對(duì)照藥順鉑接近，可作 為抗腫瘤先導(dǎo)化合物研究。
【具體實(shí)施方式】
[0009] 下面結(jié)合實(shí)施例進(jìn)一步介紹本發(fā)明，但本發(fā)明不僅限于下述實(shí)施例，可以預(yù)見本 領(lǐng)域技術(shù)人員在結(jié)合現(xiàn)有技術(shù)的情況下，實(shí)施情況可能產(chǎn)生種種變化。
[0010] 目標(biāo)物膦酸酯衍生物的結(jié)構(gòu)通式為
，1?為1-5個(gè)碳的烷基或 1-5原子的烷氧基；心為!1或鹵素或硝基1-3個(gè)碳的烷基或1-3個(gè)原子的烷氧基；此為Η或 1-5碳的烷基或苯甲基或吲哚-2-甲基或羥甲基或巰甲基或?qū)αu基苯甲基或氨基甲酰甲基 或氨基甲酰乙基或〇12〇1 2〇12或!10〇1(〇13);構(gòu)型：與1?2直接相連的碳原子為1?或5構(gòu)型。其合成 反應(yīng)式為：

【具體實(shí)施方式】
[0011] 實(shí)施例1: 二乙基-α-(2-氟苯基)-α- (L-2-氨基苯丙酰氧基）甲基膦酸酯（I a) 的制備。
[0012] 將10 m mol L-苯丙氨酸溶于50 mL四氫咲喃，冰水浴至0°C左右，加入碳酸氫鈉20 m mol。然后將12 m mol (Boc)2〇緩慢滴入至上述溶液。〇°C左右，反應(yīng)40 min，再室溫反應(yīng) 15-20 h，反應(yīng)完畢。反應(yīng)液用乙酸乙酯萃取2 -3次，棄去上層，用酸調(diào)節(jié)pH，再用二氯甲烷 萃取2-3次。合并下層有機(jī)相，用無水硫酸鈉干燥，濃縮溶劑，得中間體1; 將2 mmol亞磷酸二乙酯與3 mmol鄰氟苯甲醛加入50ml三頸瓶中，充分混合，然后將1.1 mmol三乙胺逐滴加入混合液中。10 min后，升高溫度，在60 °C攪拌反應(yīng)3 h。再在室溫?cái)嚢?反應(yīng)24 h。反應(yīng)完畢，減壓除去三乙胺，用乙醚:石油醚=1:1重結(jié)晶，得中間體2。
[0013] 取中間體1(4 mmoL)和中間體2(4 mmol)，加入到50 mL三口瓶中，再加入DMAP(4.1 mmol)，以無水二氯甲烷(15 mL)為溶劑，攪拌溶解，冰鹽浴(-5~0 °C)下，用恒壓滴液漏斗緩 慢滴加 EDCI(4.1 mmol，無水二氯甲烷15 mL溶解），30 min滴加完畢，室溫反應(yīng)10 h，過濾， 除去不溶物，濃縮溶劑，柱層析法(乙酸乙酯:石油醚=1:1)分離純化，得中間體3。
[0014] 在反應(yīng)瓶中加入無水乙酸乙酯(4 mL)，冰鹽浴(-5~0 °C)下充分?jǐn)嚢?，依次加入?醇(0.8 mmoL)和乙酰氯(0.8 mmoL)，維持該溫度，反應(yīng)約3 h。然后將中間體3(0.5 mmoL，用 5 mL無水乙酸乙酯溶解），緩慢加入反應(yīng)體系中，TLC跟蹤，冰水浴下攪拌反應(yīng)8 h，減壓濃 縮，得粘稠液體，柱層析法（氯仿：甲醇=8:1)分離純化，真空干燥，得到化合物（la)，產(chǎn)率 50.5%〇
[0015]
(c= 0.01g/mL， methanol). 4 NMR (400 MHz, CDCh)， δ: 1.05 ~1.14 (m， 6H， CH3), 1.84 (s， 2H， NH2)， 2.80~2.94 (m， 2H， OfeAr), 3.84~4.01 (m， 4H， 0CH2)， 4.58 (s， 1H， NCH)， 6.34 (dd， 1H， J=24 Hz PCH)， 6.86~7.42 (m， 9H， Ar-H); 13C 匪R (100 MHz, CDC13)， δ: 16.1， 16.2， 37.6， 54.3， 63.2， 63.3， 65.0, 115.1, 120.6, 124.3, 128.3, 129.0, 135.5, 135.8, 158.6, 170.1. IR ( KBr )v: 3303，2915，2854，1669，1465，1201, 1030 cm-1。
[0016] 實(shí)施例2: 二乙基-α-(2_氟苯基)-α- (D-2-氨基苯丙酰氧基）甲基膦酸酯（I b) 的制備。
[0017] 將10 m mol D-苯丙氨酸溶于50 mL四氫呋喃，冰水浴至0°C左右，加入三乙胺20 m mol。然后將15 m mol (Boc)2〇緩慢滴入至上述溶液。〇°C左右，反應(yīng)60 min，再室溫反應(yīng)15 h，反應(yīng)完畢。反應(yīng)液用乙酸乙酯萃取2 -3次，棄去上層，用酸調(diào)節(jié)pH，再用二氯甲烷萃取2-3次。合并下層有機(jī)相，用無水硫酸鈉干燥，濃縮溶劑，得中間體1; 將2 mmol亞磷酸二乙酯與2 mmol鄰氟苯甲醛加入50ml三頸瓶中，充分混合，然后將1.5 mmol三乙胺逐滴加入混合液中。10 min后，升高溫度，在80°C攪拌反應(yīng)1.5 h。再在室溫?cái)嚢?反應(yīng)24 h。反應(yīng)完畢，減壓除去三乙胺，用乙醚:石油醚=1:1重結(jié)晶，得中間體2。
[0018] 取中間體1(4 mmoL)和中間體2(4 mmol)，加入到50 mL三口瓶中，再加入DCC (4.1 mmol)，以無水二氯甲烷(15 mL)為溶劑，攪拌溶解，冰鹽浴(-5~0 °C)下，用恒壓滴液漏斗緩 慢滴加 DMAP (4.1 mmol，無水二氯甲烷15 mL溶解），30 min滴加完畢，室溫反應(yīng)12 h，過濾， 除去不溶物，濃縮溶劑，柱層析法(乙酸乙酯:石油醚=1:1)分離純化，得中間體3。
[0019] 在反應(yīng)瓶中加入無水乙酸乙酯(4 mL)，冰鹽浴(-5~0 °C)下充分?jǐn)嚢?，依次加入?醇（1 mmoL)和乙酰氯（1 mmoL)，維持該溫度，反應(yīng)約3 h。然后將中間體3(0.5 mmoL，用5 mL 無水乙酸乙酯溶解），緩慢加入反應(yīng)體系中，TLC跟蹤，冰水浴下攪拌反應(yīng)10 h，減壓濃縮，得 粘稠液體，柱層析法(氯仿：甲醇=8:1)分離純化，真空干燥，得到化合物(Ib)，產(chǎn)率48.0 %。
[0020]
(c= 0.01g/mL， methanol). 4 NMR (400 MHz, CDCh)， δ: 1.06 ~1.15 (m， 6H， CH3), 1.82 (s， 2H， NH2)， 2.85~2.98 (m， 2H， OfeAr), 3.86~4.03 (m， 4H， 0CH2)， 4.59 (s， 1H， NCH)， 6.02 (dd， 1H， J=20 Hz PCH)， 6.86~7.38 (m， 9H， Ar-H); 13C 匪R (100 MHz, CDC13)， δ: 16.0， 16.1， 37.7， 54.4， 63.3， 63.4， 69.4, 115.2, 126.5, 128.1, 129.0, 129.6, 135.5, 135.8, 154.9, 155.1, 170.4. IR ( KBr ) v: 3302, 2981, 2855, 1671, 1538, 1207, 1033 cm-1 〇
[0021 ] 實(shí)施例3: 二乙基-a-(4_氟苯基)-a- (L-2-氨基苯丙酰氧基）甲基膦酸酯（I c)的制備。
[0022] 將10 m mol L-苯丙氨酸溶于50 mL四氫呋喃，冰水浴至0°C左右，加入三乙胺20 m mol。然后將12 m mol (Boc)2〇緩慢滴入至上述溶液。〇°C左右，反應(yīng)40 min，再室溫反應(yīng)15 h，反應(yīng)完畢。反應(yīng)液用乙酸乙酯萃取2 -3次，棄去上層，用酸調(diào)節(jié)pH，再用二氯甲烷萃取2-3次。合并下層有機(jī)相，用無水硫酸鈉干燥，濃縮溶劑，得中間體1; 將2 mmol亞磷酸二乙酯與2 mmol對(duì)氟苯甲醛加入50ml三頸瓶中，充分混合，然后將1.5 mmol三乙胺逐滴加入混合液中。10 min后，升高溫度，在80°C攪拌反應(yīng)1.5 h。再在室溫?cái)嚢?反應(yīng)24 h。反應(yīng)完畢，減壓除去三乙胺，用乙醚:石油醚=1:1重結(jié)晶，得中間體2。
[0023] 取中間體1(4 mmoL)和中間體2(4 mmol)，加入到50 mL三口瓶中，再加入HBTU (4.1 mmol)，以無水二氯甲烷（15 mL)為溶劑，攪拌溶解，冰鹽浴(-5~0 °C)下，用恒壓滴液 漏斗緩慢滴加 DIPEA (4.1 mmol，無水二氯甲烷15 mL溶解），30 min滴加完畢，室溫反應(yīng)12 h，過濾，除去不溶物，濃縮溶劑，柱層析法(乙酸乙酯:石油醚=1:1)分離純化，得中間體3。
[0024] 在反應(yīng)瓶中加入無水乙酸乙酯(4 mL)，冰鹽浴(-5~0 °C)下充分?jǐn)嚢瑁来渭尤爰?醇（1 mmoL)和乙酰氯（1 mmoL)，維持該溫度，反應(yīng)約3 h。然后將中間體3(0.5 mmoL，用5 mL 無水乙酸乙酯溶解），緩慢加入反應(yīng)體系中，TLC跟蹤，冰水浴下攪拌反應(yīng)10 h，減壓濃縮，得 粘稠液體，柱層析法(氯仿：甲醇=7:1)分離純化，真空干燥，得到化合物(Ic)，產(chǎn)率52.3 %。
[0025]
(c= 0.01g/mL， meth