一種基于唾液中的雌二醇的核酸適配體及檢測用金標(biāo)試紙條的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及激素檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種基于唾液中的雌二醇的核酸適配體及檢測用金標(biāo)試紙條。
【背景技術(shù)】
[0002]雌二醇(170-estrad1l)屬于內(nèi)源性雌激素，分子量為272.38，在女性各種激素表達(dá)的生物活性中是最強的一種。隨著對雌二醇的深入研究，發(fā)現(xiàn)內(nèi)源性雌激素產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物仍然能發(fā)揮各種各樣的生物效應(yīng)，正常情況下并不具有致癌作用。卵巢分泌雌激素，而且無排卵性功血、多囊卵巢綜合征、功能性卵巢腫瘤等疾病可導(dǎo)致卵巢分泌雌激素增加，子宮內(nèi)膜長期受單一雌激素刺激，無孕激素拮抗，可導(dǎo)致子宮內(nèi)膜增生及癌變。
[0003]隨著社會的發(fā)展，情緒疾病越來越受到社會的重視，而女性更易患各種情緒疾病，尤其是近幾年經(jīng)前焦慮性障礙的患病率明顯提高，逐漸受到國內(nèi)外婦科界的重視。經(jīng)前期綜合征(premenstrua I syndrome，PMS)是指在月經(jīng)周期的黃體期有規(guī)律、反復(fù)發(fā)作的一組癥狀集合，主要包括軀體和心理癥狀。經(jīng)前期煩躁不安征(premenstrual dysphonicdisorder，PMDD)是一種PMS嚴(yán)重狀態(tài)，國外研究表明大約75%的婦女患PMS，而在患PMS者中又有14%患有PMDD。國內(nèi)研究以喬明琦等為代表對PMS流行病學(xué)調(diào)查研究表明，該病的發(fā)生率占成年女性的41.9%。
[0004]女性生理期內(nèi)，體內(nèi)雌激素及孕酮的水平都有所變化，這兩者與情緒變化相關(guān)。
[0005]對于體內(nèi)雌二醇的水平變化的檢測，具有非常重要的臨床意義，然而傳統(tǒng)的各種檢測方法中一般都是基于尿液或者血液來檢測，在取樣的過程中給用戶帶來了不便或痛苦，且檢測過程復(fù)雜，耗時長，成本高，并且不能保證批間的穩(wěn)定性。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]由于雌二醇在唾液中性質(zhì)較為穩(wěn)定，并不影響測定效果，人體的唾液是通過口腔上皮細(xì)胞分泌，唾液中的雌二醇濃度與血液中的雌二醇濃度呈正相關(guān)性。又基于膠體金標(biāo)記適配體識別雌二醇特異性抗原的技術(shù)避免了現(xiàn)有檢測技術(shù)中的缺陷，具有穩(wěn)定性高、易于合成等優(yōu)點，因此，為了解決現(xiàn)有檢測技術(shù)中的上述問題，本發(fā)明基于膠體金標(biāo)記適配體識別雌二醇特異性抗原的技術(shù)原理，提供了一種雌二醇的核酸適配體，其相應(yīng)的互補探針，以及由其組成的金標(biāo)試紙條。
[0007]本發(fā)明提供的一種雌二醇的核酸適配體，其核苷酸序列如SEQID NO:1所示，其中序列5’端經(jīng)過巰基修飾。該核酸適配體能夠識別雌二醇并與其結(jié)合。
[0008]SEQ ID NO:15 ’-SH-TGTTCAATACGAAGGGATGCCGTTTGGGCCCAAGTTCGGCATAGTGTGGTGATAGTAAGAGCAATC-3，。
[0009]本發(fā)明提供的一種互補探針A，與上述雌二醇的核酸適配體互補配對，其核苷酸序列如SEQ ID N0:2所示，其中序列5’端經(jīng)過生物素修飾?；パa探針A與雌二醇競爭性結(jié)合上述核酸適配體。
[0010]SEQ ID N0:25’-b1tin-GATTGCTCTTACTAT-3’。
[0011]本發(fā)明提供的一種互補探針B，與上述雌二醇的核酸適配體互補配對，其核苷酸序列如SEQ ID N0:3所示，其中序列5’端經(jīng)過生物素修飾?；パa探針B能夠與上述核酸適配體的另外一部分結(jié)合，該部分不同于與雌二醇結(jié)合的序列段，也就是說，互補探針B與雌二醇之間沒有競爭關(guān)系。
[0012]SEQ ID N0:35’-b1tin-GATTGCTCTTACTATCACCACACTATGCCG-3’。
[0013]本發(fā)明公開的一種檢測雌二醇的金標(biāo)試紙條，是在塑料襯板上依次搭接樣品玻璃纖維膜、核酸探針金標(biāo)墊、硝酸纖維膜和吸水玻璃纖維膜，并且硝酸纖維膜上劃有檢測線和參照線，參照線靠近吸水玻璃纖維膜一端;其中核酸探針金標(biāo)墊上附著表面經(jīng)修飾的膠體金，檢測線由核酸適配體A溶液劃成，參照線由核酸適配體B溶液劃成；
[0014]所述膠體金的表面經(jīng)過活化了巰基的雌二醇的核酸適配體修飾；
[0015]核酸適配體A溶液包括結(jié)合了鏈霉親和素的互補探針A;
[0016]核酸適配體B溶液包括結(jié)合了鏈霉親和素的互補探針B。
[0017]以上金標(biāo)試紙條，特別適合于唾液中雌二醇的檢測。通過適配體檢測唾液中的雌二醇濃度，利用唾液中微量的雌二醇濃度與血液中的雌二醇濃度存在顯著相關(guān)性，從而推算出人體的雌二醇水平，為一種非侵入式檢測方案，可用于監(jiān)測女性的生理周期及健康狀
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[0018]本發(fā)明的金標(biāo)試紙條，檢測線中的互補探針A與雌二醇是競爭關(guān)系，競爭性結(jié)合核酸適配體。檢測時，將唾液樣品浸潤或滴加到樣品玻璃纖維膜，由于毛細(xì)現(xiàn)象，唾液向樣品玻璃纖維膜的對向端滲透，滲透的過程中雌二醇會與核酸探針金標(biāo)墊的核酸適配體結(jié)合并繼續(xù)一起移動，核酸適配體一端有膠體金顆粒，核酸適配體與膠體金顆粒的結(jié)合體將吸附在檢測線和參照線上，最終顯色的深淺通過與標(biāo)準(zhǔn)色(梯度濃度標(biāo)準(zhǔn)品在金標(biāo)試紙條上的顯色情況)對比就能得到雌二醇的濃度。當(dāng)唾液中含有高濃度的雌二醇時，雌二醇與互補探針A競爭性結(jié)合核酸適配體，從而檢測線顏色就會變?nèi)?。陰性對?空白對照)是有兩條線都顯色，因為當(dāng)唾液中不含有雌二醇，兩條互補探針都會截留雌二醇的核酸適配體。
[0019]優(yōu)選地，上述金標(biāo)試紙條，所述膠體金溶液的制備方法如下:
[0020]將醋酸緩沖液和TCEP溶液混合，再向其中加入雌二醇的核酸適配體，進(jìn)行巰基活化反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后向其中加入金納米粒子溶液，震蕩;再加入dATP，250C震蕩反應(yīng)后靜置30分鐘，再在4°C下靜置6小時;然后離心，沉淀用磷酸緩沖液溶解既得。
[0021 ]優(yōu)選地，上述金標(biāo)試紙條，所述醋酸緩沖液濃度為0.5M，pH值6.5，用量IyL;所述TCEP溶液的濃度為10mM，用量1.5yL;所述dATP濃度ΙΟμΜ，用量85yL;所述金納米粒子粒徑30?40nm，用量10yL;所述磷酸緩沖液濃度0.01M，pH值7.4，用量520yL。
[0022]優(yōu)選地，上述金標(biāo)試紙條，所述互補探針A溶液制備方法為:將40?SOyLI?100D值的生物素修飾的互補探針A溶液和200?300yL I?5mg/mL鏈霉親和素溶液混合后在25°C下靜置I小時，在向其中加入500?600yL 0.001?1.000M pH值6.0?8.0的磷酸鹽緩沖溶液。
[0023]優(yōu)選地，上述金標(biāo)試紙條，所述互補探針B溶液的制備方法為:將40?SOyLI?100D值的生物素修飾的互補探針B溶液和200?300yL I?5mg/mL鏈霉親和素溶液混合后在25°C下靜置I小時，在向其中加入500?600yL 0.001?I.000Μ pH值6.0?8.0的磷酸鹽緩沖溶液得到結(jié)合了鏈霉親和素的生物素修飾的互補探針B溶液。
[0024]本發(fā)明還提供了以上任一所述的金標(biāo)試紙條的制備方法，是將樣品玻璃纖維膜、核酸探針金標(biāo)墊、硝酸纖維膜和吸水玻璃纖維膜依次粘貼到塑料襯板上，相鄰兩粘貼物之間的重疊部分長度為2mm，干燥封裝，在4°C?25°C條件下保存。
[0025]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果:
[0026]1、本發(fā)明將納米粒子比表面積大這一顯著特點應(yīng)用于傳統(tǒng)的金標(biāo)試紙條的建立和相應(yīng)的檢測方法，建立了可用于現(xiàn)場快速超靈敏檢測的基于核酸探針的膠體金標(biāo)記試紙條和相關(guān)的檢測方法，通過肉眼直接觀察實現(xiàn)目標(biāo)檢測物的快速定性檢測和通過檢測條帶上顯色程度的降低對目標(biāo)檢測物進(jìn)行定量檢測。無需其他輔助儀器設(shè)備，檢測工作可在10?15分鐘內(nèi)完成并得到檢測結(jié)果。
[0027]2、本發(fā)明為通用型基于膠體金標(biāo)記適配體的膠體金標(biāo)記試紙條，只需將試紙條中適配體進(jìn)行相應(yīng)替換，即可實現(xiàn)其他目標(biāo)物的檢測。
[0028]4、本發(fā)明還具有特異性高，穩(wěn)定性好，應(yīng)用范圍廣，成本低廉，操作使用方法簡單易于推廣應(yīng)用?？蓱?yīng)用于醫(yī)院、家庭、以及食品安全與檢驗檢疫的海關(guān)、機場等口岸等需要現(xiàn)場快速檢測機構(gòu)。
[0029]5、本發(fā)明中的檢測方法不需要穿刺取血或取尿液，只需要取唾液，取樣簡單，屬于非侵入式檢測，檢測方法簡單，成本低廉。
[0030]6、本方法檢測的靈敏度和高，監(jiān)測濃度可以達(dá)到pmol級別。
【附圖說明】
[0031]圖1為基于膠體金標(biāo)記抗體的金標(biāo)試紙條的側(cè)面結(jié)構(gòu)示意圖，圖中序號:I樣品玻璃纖維膜、2核酸探針金標(biāo)墊、3硝酸纖維膜、4檢測線、5參照線、6吸水玻璃纖維膜、7塑料襯板；
[0032]圖2為基于膠體金標(biāo)記抗體的金標(biāo)試紙條的正面檢測結(jié)果判斷示意圖；
[0033]圖3為金標(biāo)試紙條對陰性、弱陽性、陽性和無效樣品檢測結(jié)果圖；
[0034]圖4為含不同濃度雌二醇的唾液和尿液樣品檢測結(jié)果。
【具體實施方式】
[0035]下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步說明，以使本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以更好的理解本發(fā)明并能予以實施，但所舉實施例不作