一組特異性結(jié)合結(jié)核分枝桿菌的核酸適配體及其應用
【專利摘要】本發(fā)明公開了一組特異性結(jié)合結(jié)核分枝桿菌的核酸適配體及其應用。本發(fā)明的結(jié)核分枝桿菌標準株H37Rv的ssDNA適配體親和性強、特異性高，該適配體能高特異性地檢測出結(jié)核分枝桿菌，可以為檢測結(jié)核分枝桿菌傳感器的制備、結(jié)核病的實驗室診斷提供有利依據(jù)。
【專利說明】
-組特異性結(jié)合結(jié)核分枝桿菌的核酸適配體及其應用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于分子生物學和醫(yī)學微生物技術(shù)領(lǐng)域，設及兩個特異性結(jié)合結(jié)核分枝桿 菌菌體的核酸適配體及其用途。
【背景技術(shù)】
[0002] 結(jié)核病是嚴重危害人類健康的慢性傳染病，是全球關(guān)注的公共衛(wèi)生問題和社會問 題。近年來，由于缺乏有效、廉價的診斷設備，加上耐藥結(jié)核桿菌菌株的產(chǎn)生、人口流動等因 素影響，使得全世界的結(jié)核病發(fā)病率有明顯的上升，結(jié)核病的形勢更加嚴峻?？焖贉蚀_的早 期診斷是防治結(jié)核病的有效措施和控制結(jié)核病傳播的關(guān)鍵步驟之一。
[0003] 目前X線胸片、涂片鏡檢法、培養(yǎng)法是結(jié)核病診斷最常用的方法。X線胸片是大量結(jié) 核分枝桿菌產(chǎn)生后才能檢測出來，且對HIV病人難W診斷。涂片鏡檢法簡單快速，但檢出率 只有50%。培養(yǎng)法檢出率很高，但耗時費力，而且無法特異性識別結(jié)核分枝桿菌，用于結(jié)核 分枝桿菌的檢測需要4~6周，并需要高水平的技術(shù)能力。而BACTEC MG口 960全自動檢測系 統(tǒng)，將檢測時間縮短到10天，但仍需對結(jié)核分枝桿菌的培養(yǎng)，而且無法對結(jié)核分枝桿菌進行 特異性識別，無法區(qū)分卡介苗和結(jié)核分枝桿菌W及恥垢分枝桿菌。檢測時間無法滿足臨床 要求，且設備和試劑消耗很昂貴。多通道串聯(lián)式壓電石英晶體(MSPQC)傳感器由于具有靈敏 度高、穩(wěn)定性強、成本低、易于操作等優(yōu)點，在細菌的快速檢測領(lǐng)域取得一定進展，主要是依 據(jù)細菌生長代謝引起培養(yǎng)基的電參數(shù)變化，但代謝法對結(jié)核桿菌的檢出時間只能縮短到7 天。與隧菌體裂解法聯(lián)合后檢出時間縮短到30小時。但運兩種方法的檢出時間仍然受限于 細菌的培養(yǎng)時間，同樣無法對結(jié)核分枝桿菌進行特異性識別，無法區(qū)分卡介苗和結(jié)核分枝 桿菌。免疫學方法基于抗原抗體的靈敏反應，大大提高了檢測限，但是抗體在常溫下的不穩(wěn) 定性限制了運些方法的推廣使用。分子生物學法縮短了檢出時間、提高了靈敏度，但由于需 要苛刻的實驗條件和昂貴的成本而無法得到普及。
[0004] 適配體(Aptamers)的研究是一個新的熱點領(lǐng)域，它是能夠與許多目標分子(蛋白， 藥物，無機或有機分子)發(fā)生高親合性和特異性結(jié)合的一類單鏈核酸(DNA or RNA)。至今發(fā) 現(xiàn)高親和特異性適配體的方法是利用配體指數(shù)富集系統(tǒng)展開。由于適配體與目標物(小分 子、蛋白、全細胞、病毒、細菌)結(jié)合的高特異性W及高親和性，在醫(yī)學研究中被廣泛應用于 檢測和藥物研究等方面。結(jié)核分枝桿菌憐酸激酶2(PPK2)為祀標的適配體、結(jié)核分枝桿菌早 期分泌蛋白CFP-10和ESAT-6為祀標的適配體，W及應用于小鼠體內(nèi)結(jié)核分枝桿菌的防治的 結(jié)核分枝桿菌的菌體適配體。但目前用于臨床檢測的結(jié)核分枝桿菌菌體適配體還未見報 道。因此，有必要開發(fā)一種可特異性識別結(jié)核分枝桿菌并用于臨床檢測的適配體。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的第一個目的在于提供可與結(jié)核分枝桿菌特異性結(jié)合的核酸適配體。
[0006] 本發(fā)明特異性結(jié)合結(jié)核分枝桿菌的核酸適配體的核屯、序列如SEQ ID NO: 1和SEQ ID NO:2所示。
[0007] 所述核酸適配體序列如下：
[000引 5' -GGGAGCTCAGAATAAACGCTCAA-N35-TTCGACATGAGGCCCGGATC-3'，其中N35為核屯、 序列，核屯、序列如沈Q ID N0:1和沈Q ID N0:2所示。
[0009] 本發(fā)明所述的特異性結(jié)合結(jié)核分枝桿菌的核酸適配體的核巧酸序列上的某一位 置可W被憐酸化、氧甲基化、甲基化、氨基化、琉基化或同位素化。
[0010] 本發(fā)明所述的特異性結(jié)合結(jié)核分枝桿菌的核酸適配體的核巧酸序列上可W結(jié)合 有生物素、地高辛、巧光物質(zhì)、納米發(fā)光材料、聚乙二醇、膚段、蛋白、酶或葉酸標記。
[0011] 本發(fā)明所述的核酸適配體的核巧酸序列還可W包括W下=種序列中的任意一種：
[0012] (1)與前述的核酸適配體的核巧酸序列的同源性在60% W上；
[0013] (2)與前述的核酸適配體的核巧酸序列進行雜交的序列；
[0014] (3)前述的核酸適配體的核巧酸序列轉(zhuǎn)錄的RNA序列。
[0015] 本發(fā)明的第二個目的在于提供本發(fā)明所述核酸適配體的應用，具體包括在制備結(jié) 核病診斷試劑中的應用、在制備預防或治療結(jié)核病藥物中的應用。W及在制備檢測結(jié)核分 枝桿菌傳感器中的探針的應用。
[0016] 本發(fā)明采用下述方法獲得特異性識別結(jié)核分枝桿菌H37RV的DNA適配體:采用核酸 適配體的體外SELEX篩選技術(shù)，W結(jié)核分枝桿菌為祀標，為了獲得高特異性結(jié)合分枝桿菌的 適配體，W恥垢分枝桿菌、大腸桿菌、綠脈桿菌、金黃色葡萄球菌、腸炎沙口氏菌的混合物為 反篩祀標，從體外合成的隨機寡聚DNA文庫（S^GGGAGCTCAGAATAAACGCTCAA-NSS- TTCGACATGAGGCCCGGATC-S/ ， N35 為核屯、序列 ） 中 篩選出 與結(jié)核分枝桿菌特異結(jié)合的 核酸適 配體，核屯、序列如下：
[0017]
[001引將篩選出來的序列用
[0019] 引物P1 (5' -GGGAGCTCAGAATAAACGCTCAA-3')和
[0020] 引物P2(5/-GATCC GGGCCTCATGTCGAA-3/ )進行擴增。經(jīng)過對稱PCR擴增和不對稱 PCR 擴增，程序為 951：5111111，951：3〇3,651：3〇3,721：3〇3,721：5111111，18-40個循環(huán)；循環(huán)次數(shù) 根據(jù)具體的擴增效果進行調(diào)整。PCR產(chǎn)物通過3%的瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，膠純化試劑 盒進行回收（按照試劑盒產(chǎn)品說明書操作）。將PCR擴增產(chǎn)物純化后取1化，與載體PGM-T在 T4DNA連接酶的作用下連接，再將其轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細胞，取適當體積均勻涂布于含有IPTG、 x-gal、抗生素(Amp)的LA平板，12~16小時后用接種環(huán)挑取篩選平板上的單個白色菌落于 含Amp的LB液體培養(yǎng)基，37°C培養(yǎng)過夜。取菌液ImL于離屯、管中，封膜后送上海生工生物技術(shù) 有限公司下簡稱上海生工)測序。
[0021] 本發(fā)明通過SELEX技術(shù)用不同于現(xiàn)有技術(shù)的反篩祀目標進行了篩選，從新的體外 合成的隨機寡聚DNA文庫中篩選出與結(jié)核分枝桿菌特異結(jié)合的核酸適配體，得到了新的特 異性極強的核酸適配體序列。本發(fā)明所述的核酸適配體序列選自天然存在或人工合成的序 列，或任何其他來源的同樣的序列。
[0022] 本發(fā)明篩選出來的適配體可與結(jié)核分枝桿菌特異性結(jié)合，而且本發(fā)明所提供的核 酸適配體序列與作為祀標的結(jié)核分枝桿菌具有非常強的親和性，具有特異性強的優(yōu)點；因 此能高特異性地檢測出結(jié)核分枝桿菌，可W為檢測結(jié)核分枝桿菌制劑的制備、結(jié)核病的實 驗室診斷，W及制備預防或治療結(jié)核病藥物等提供有利依據(jù)。此外，所述序列可W大量快速 地在體外合成，且制備方法簡單，比較容易獲得。
【附圖說明】
[0023] 圖1為本發(fā)明具有高親和力，能特異性識別結(jié)核分枝桿菌的適配體SEQ ID NO: 1和 SEQ ID NO:2核屯、序列的二級結(jié)構(gòu)；
[0024] 圖2,左圖為結(jié)核分枝桿菌與適配體的結(jié)合率，右圖為流式細胞技術(shù)分析文庫中適 配體的富集情況；
[0025] 圖3為本發(fā)明制備的SWCNTs/ApViDE-MSPQC傳感器檢測結(jié)核分枝桿菌的機理圖；
[0026] 圖4為本發(fā)明傳感器的阻抗值變化曲線，（a)裸金叉指電極，（b)修飾上適配體后， (C)與碳納米管結(jié)合后，（d)適配體捕獲結(jié)核分枝桿菌，釋放碳納米管后；
[0027] 圖5為本發(fā)明SWCNTs/Apt/IDE-MSPQC傳感器檢測不同細菌的頻移變化曲線，細菌 濃度均為lX106cfu/mL(a)空白對照，（b)大腸桿菌，（C)綠脈桿菌，（d)恥垢分支桿菌，（e) 金黃色葡萄球菌，（f)卡介苗，（g)結(jié)核分枝桿菌。
【具體實施方式】
[002引實施例1:構(gòu)建隨機單鏈DNA文庫及引物
[0029] 構(gòu)建含78nt堿基序列的DM文庫（5' -GGGAGCTCAGAATAAACGCTCAA-N35- TTCGACATGAGGCCCGGATC-3')，上游引物為5' -GGGAGCTCAGAATAAACGCTCAA-3'，下游引物是 5/-GAT CCGGGCCTCATGTCG AA-3/，N35為隨機核屯、序列，庫容量為435。^上文庫及引物均由 上海生工合成。
[0030] 實施例2:沈LEX篩選
[0031] 前四輪，首先將ssDNA文庫置于400化選擇緩沖液（50mM Tris-HCl (抑7.4)，lOOmM NaCl，5mM KCl，ImM MgCb，0.1 %Na化）中，95°C加熱5min，然后置于冰中冷卻lOmin，備用；取 結(jié)核分枝桿菌，用生理鹽水洗涂，離屯、，棄上清液，反復=次;在盛有沉淀的離屯、管中，加入 100化上述備好的ssDNA文庫溶液，37°C，解育45min;6000rpm離屯、lOmin，棄去上清液。并用 洗涂緩沖液（50mM lYis-HCKpH 7.4)，100mM 化Cl，5mM KCiamM MgCl2,0.1%Na化，0.2% 牛血清白蛋白）洗涂3次，棄去上清液，加入100化的雙蒸水，置于95 °C水浴鍋，在5min， lOOOOrpm離屯、15min,上清液即為與M. tuberculosis有特異結(jié)合的ssDNA序列。后十輪篩選 中，ssDNA文庫先與恥垢分枝桿菌、大腸桿菌、綠脈桿菌、金黃色葡萄球菌、腸炎沙口氏菌的 混合物解育，離屯、，收集上清液，再與結(jié)核分枝桿菌解育，制備與結(jié)核分枝桿菌特異性結(jié)合 地ssDNA序列。W此序列為模板進行對稱和不對稱PCR擴增，程序為95°C5min，95°C30s，65°C 3〇3,721：3〇3,721：5111111，18-40個循環(huán);循環(huán)次數(shù)根據(jù)具體的擴增效果進行調(diào)整^0?產(chǎn)物通 過3%的瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，膠純化試劑盒進行回收。經(jīng)過14輪篩選后，已得到目標 ssDNA單鏈，終止篩選。
[0032] 實施例3:適配體文庫與結(jié)核分枝桿菌的結(jié)合率
[0033] 將第2、4、6、8、10、12、13、14輪得到的33〇臟庫，用5'端修飾巧光素的上游引物和下 游引物(Biotin-RP)，進行不對稱PCR擴增，得到的ssDNA與結(jié)核分枝桿菌解育后，離屯、，分別 收集上清液和結(jié)合了 ssDNA的細菌沉淀。用巧光分光光度計測定上清液的巧光值為Fi。將結(jié) 合了 ssDNA的細菌沉淀，用1(K)化雙蒸水重懸菌體，100°C水浴鍋中加熱lOmin，再放置高速離 屯、機中10000巧m、4°C離屯、15min，收集上清移至新離屯、管，測定巧光值F2,結(jié)合率R = F2/(Fi+ F2)x100%，第13輪后結(jié)合率基本上穩(wěn)定，表明ssDNA文庫與結(jié)核分枝桿菌的結(jié)合已達到平 衡，結(jié)束篩選。
[0034] 實施例4:用流式細胞儀證明目標序列的富集程度
[0035] 為了證明在篩選過程中目標序列的富集程度，用流式細胞儀監(jiān)測了目標序列對結(jié) 核分枝桿菌的捕獲。首先用異硫氯酸巧光素(FITC)修飾的ssDNA文庫（lOOnM)與祀標細菌 (l〇6c化/mL)于2(K)化選擇緩沖液中，置于搖床10化pm、37°C解育40min。取上述樣品置于流 式細胞儀中，收集10000個細胞進行分析。通過檢測說明隨著篩選輪次的增加，高親和力、高 特性的適配體不斷得到了富集。
[0036] 實施例5:核酸適配體克隆
[0037] 第14輪篩選產(chǎn)物的擴增和純化:將第14輪篩選得到的ssDNA序列，進行PCR擴增。 PCR產(chǎn)物yongUNIQ.lODNA膠回收試劑盒回收純化。將PCR純化產(chǎn)物克?。喝』?擴增產(chǎn)物，與 載體PGM-T在T4DNA連接酶的作用下連接，再將其轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細胞，取適當體積均勻涂布 于含有IPTG、x-gal、抗生素(Amp)(它們分別購自于上海生工）的LA平板，倒置培養(yǎng)皿，于37 °C培養(yǎng)12-16小時進行"藍-白斑篩選"。挑選40個克隆子進行培養(yǎng)并從每個克隆子所培養(yǎng)的 菌液中取ImL送往上海生工測序。用DNAMAN軟件對所測得的核酸適配體序列一級結(jié)構(gòu)的同 源性進行分析，并用Mfold sever分析軟件在線模擬其二級結(jié)構(gòu)。
[0038] 實施例6:適配體親和力的測定
[0039] 取不同濃度梯度的簇基巧光素(FAM)標記的適配體溶液(濃度依次為0-120nM)與 固定量的結(jié)核分枝桿菌（107cfu/mL)在離屯、管中混勻，加入選擇緩沖液至500]iL，37°C、 lOOr/min振蕩解育45miru8000巧m冷凍離屯、lOmin，棄上清，用500化洗涂緩沖液（50mM Tris-肥 1(抑 7.4)，100mM NaCl，5mM KCl，lmM MgCl2,0.1%化化，0.2%牛血清白蛋白），重 懸菌體后離屯、，棄上清，重復洗涂3次。結(jié)合了適配體的菌體沉淀重懸于10化L無菌去離子水 中，將離屯、管置于水浴鍋中100 °C處理5min，立即冰浴冷卻至室溫，10000巧m高速離屯、 15min，取上清液移入微量比色皿中，用巧光分光光度計測其巧光值。利用軟件化iginS.O對 所得巧光值進行非線性回歸分析，根據(jù)公式:Y = XXBmax/化打X)計算出適配體的Kd值(其中 Bmax為體系中最大巧光值，X為適配體濃度，Y為對應的巧光值）。結(jié)果表明，SEQ ID NO: 1序 列的親和力最好。SEQ ID N0:2的親和力次之，結(jié)果見表2。
[0040] 實施例7:制備檢測結(jié)核分枝桿菌傳感器及應用
[0041] 將實施例6篩選出的適配體琉基修飾后固定在在叉指金電極上，與碳納米管通過 31-31鍵連接作為探針，叉指金電極與多通道壓電傳感器相連，設計出SWCNTs/ApViDE-MSPQC 傳感器。當有結(jié)核分枝桿菌時，適配體與結(jié)核分枝桿菌特異性結(jié)合，碳納米管脫離，從而引 起叉指電極表面阻抗值的增加，傳感器的頻移值增加。該傳感器可W在Ih內(nèi)檢測出結(jié)核分 枝桿菌，檢測下限為100c化/mL。結(jié)果見圖4和5。
[0042] W上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施例而已，并非對本發(fā)明做任何形式上的限制，雖 然本發(fā)明已W優(yōu)選實施例掲露如上，然而并非用W限定本發(fā)明，任何熟悉本專業(yè)的技術(shù)人 員，在不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的范圍內(nèi)，當可利用上述掲示的技術(shù)內(nèi)容作出些許更動或修 飾為等同變化的等效實施例，但凡是未脫離本發(fā)明技術(shù)方案的內(nèi)容，依據(jù)本發(fā)明的技術(shù)實 質(zhì)對W上實施例所作的任何簡單修改、等同變化與修飾，均仍屬于本發(fā)明技術(shù)方案的范圍 內(nèi)。
[0043] 表1:14輪篩選所加的冊7Rv與ssDNA庫量
[0044]
[0045] 表2:包含W下核屯、序列的12個適配體的解離平衡常數(shù)/nM
【主權(quán)項】
1. 一組特異性結(jié)合結(jié)核分枝桿菌的核酸適配體，所述核酸適配體的核心序列如SEQ ID NO :1 和SEQ ID NO :2所示。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的特異性結(jié)合結(jié)核分枝桿菌的核酸適配體，其特征在于，所述核 酸適配體序列如下： 5' -GGGAGCTCAGAATAAACGCTCAA-N35-TTCGACATGAGGCCCGGATC-3'，其中N35為核心序列， 核心序列如SEQ ID N0:1和SEQ ID N0:2所示。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的特異性結(jié)合結(jié)核分枝桿菌的核酸適配體，其特征在于，所述的 核酸適配體的核苷酸序列上的某一位置被巰基化、磷酸化、氧甲基化、甲基化、氨基化或同 位素化。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的特異性結(jié)合結(jié)核分枝桿菌的核酸適配體，其特征在于，所述的 核酸適配體的核苷酸序列上結(jié)合熒光物質(zhì)、生物素、地高辛、納米發(fā)光材料、聚乙二醇、肽 段、蛋白、酶或葉酸標記。5. 權(quán)利要求1-4任一項所述的核酸適配體在制備結(jié)核病診斷試劑中的應用。6. 權(quán)利要求1-4任一項所述的核酸適配體在制備預防或治療結(jié)核病藥物中的應用。7. 權(quán)利要求1-4任一項所述的核酸適配體在制備檢測結(jié)核分枝桿菌傳感器中的探針應 用。8. -組特異性結(jié)合結(jié)核分枝桿菌的核酸適配體，其特征在于，所述的核酸適配體的核 苷酸序列包括以下三種序列中的任意一種： (1) 與權(quán)利要求1-4任一項所述的核酸適配體的核苷酸序列的同源性在60 %以上； (2) 與權(quán)利要求1-4任一項所述的核酸適配體的核苷酸序列進行雜交的序列； (3) 權(quán)利要求1-4任一項所述的核酸適配體的核苷酸序列轉(zhuǎn)錄的RNA序列。9. 權(quán)利要求8所述的核酸適配體在制備結(jié)核病診斷試劑中的應用，或者在制備預防或 治療結(jié)核病藥物中的應用。10. 權(quán)利要求8所述的核酸適配體在制備檢測結(jié)核分枝桿菌傳感器中的探針的應用。
【文檔編號】C12N15/115GK106047882SQ201610381839
【公開日】2016年10月26日
【申請日】2016年6月1日
【發(fā)明人】何鳳姣, 張曉青
【申請人】湖南大學