除草劑2,4-d的免疫膠體金檢測卡及其制備方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及環(huán)境激素檢測技術領域，特別是涉及2，4-D的免疫膠體金檢測卡及其制備方法。
【背景技術】
[0002]近些年來，科學家不斷發(fā)現一些來源于環(huán)境中的化學物質能夠模擬內分泌激素功能從而引起生物體內分泌系統(tǒng)紊亂，稱其為環(huán)境激素或環(huán)境荷爾蒙。環(huán)境激素已成為繼臭氧層、地球氣候變暖之后全球的第三大環(huán)境問題，成為環(huán)境科學研究領域中的熱門課題。美國環(huán)境保護局給出的環(huán)境激素的定義，是指一類干擾體內與生物體的正常行為及與生殖、發(fā)育相關的正常激素的合成、貯存、分泌、體內運輸、結合及清除等過程的外源性化合物。
[0003]環(huán)境激素是環(huán)境中的激素類似物，它能通過與激素受體結合，干擾生物體正常的生理代謝、內分泌和生殖機能，引起種種負面的生物學效應。環(huán)境激素通過環(huán)境介質和食物鏈進入人體或動物體內，干擾其內分泌系統(tǒng)和生殖功能系統(tǒng)，影響后代的生存和繁衍。
[0004]現代工農業(yè)生產在不斷滿足人類的生活需要的同時也給環(huán)境帶來了沉重的負擔，并且已經威脅到人類的生殖健康，甚至物種的繁衍。我國是世界上的農藥生產與使用大國，資料顯示2011年我國農藥原藥產量為264.87萬噸，其中殺蟲劑原藥產量為70.9萬噸，占總產量的44.35% ;除草劑產量為117.5萬噸，占總產量的26.77% ;殺菌劑原藥的產量為15萬噸，占總產量的5.67%。此類農藥除部分出口外，大部分在國內銷售和使用。據相關數據估算我國每年約有50~60萬噸有機氯農藥直接排放至環(huán)境中，如除草劑2，4-滴(2，4-Dichlorophenoxyacetic Acid, 2, 4-D)。而多數有機氯農藥具有較強的內分泌干擾作用。此類農藥一旦進入環(huán)境就會通過多種暴露途徑進入生物體內，富集于生物體的脂肪組織內進而危害人和動物的生殖健康。
[0005]目前，環(huán)境激素污染物的分析方法主要分為以GC-MS、HPLC與LC-MS技術為代表的儀器分析方法以及基于抗原抗體反應的免疫分析技術，這些常規(guī)的殘留分析技術通常操作程序復雜，效率較低，分析成本較高，不利于推廣使用，難以適應大量樣本和現場檢測的要求?；诃h(huán)境激素污染物的危害性、代表性及目前的研究熱點，本發(fā)明涉及一種除草劑2，4-D檢測卡及其制備方法。本發(fā)明的檢測卡具有簡便快捷、易于操作、成本低廉等優(yōu)點，并且能同時檢測水樣中這二種環(huán)境激素污染物質，產生了良好的社會效益和經濟效益。
[0006]本發(fā)明的2，4-D膠體金檢測卡，包括包被了單克隆抗體膠體金標記物的膠體金結合墊、包被了 2，4-D-BSA和羊抗鼠IgG的硝酸纖維素膜、樣品墊、吸水墊、PVC膠板和塑料模具組成，在PVC膠板的一端依次粘附樣品墊、結合墊，中間黏貼硝酸纖維素膜，另一端粘附吸水墊。
[0007]本發(fā)明的2，4-D膠體金檢測卡的制備方法，是由以下步驟實現:
(I)膠體金溶液制備:取I L三角燒瓶I個,加入超純水495 mL，而后加入1%氯金酸(HAuCl4.3H20) 5 mL，配制成500 mL 0.01%氯金酸水溶液，加熱煮沸后在持續(xù)攪拌的情況下加入1%檸檬酸三鈉(Na3C6H5O7.2H20)溶液5_7 mL，繼續(xù)攪拌加熱，當溶液的顏色完全變?yōu)橥该鞯淖霞t色時，維持5 min后停止加熱，補水至原體積，冷卻至室溫，2-8°C保存?zhèn)溆茫?br> (2)抗體的預處理:將要標記的2，4-D抗體在1000r/min, 4°C條件下,離心20 min,取上清，用0.01 mol/L PBS稀釋成I mg/mL ;或者用0.01 mol/L PBS稀釋成I mg/ml,過0.22 Pm 濾膜；
(3)膠體金標記物的制備:取步驟⑴中的膠體金溶液40mL，用0.25 mol/L K2C03調節(jié)膠體金溶液pH至8.5,電磁攪拌器250 r/min攪拌,逐滴加入4 mL含0.3 mg抗體蛋白的蛋白溶液，反應10 min;逐滴加入4 mL 10% BSA,繼續(xù)攪拌反應10 min ;金標抗體溶液常溫低速(1500 r/min)離心10 min,棄去由凝聚的金顆粒形成的沉淀；紅色上清溶液4°C,12000 r/min離心20 min,棄上清,收集沉淀,將沉淀用金標抗體稀釋液定容至I mL,制備成2，4-D單克隆抗體膠體金標記物；
(4)膠體金膜的制備:將步驟(3)2，4-D蛋白質偶聯物單克隆抗體膠體金標記物用劃膜儀以5 PL/cm的濃度均勻噴在載體玻璃纖維素膜上，室溫自然晾干或者37°C烘干3 h，制成含2，4-D蛋白質偶聯物單克隆抗體膠體金標記物的膠體金膜；
(5)包被膜制備:將羊抗鼠IgG抗體、2，4-D蛋白質偶聯物稀釋成Img/mL，用劃膜儀依次以I PL/cm的濃度噴涂在硝酸纖維素膜上,制備成包被膜,370C包被2 h后，室溫自然晾干或者37°C烘干；
(6)樣品墊前處理:將樣品墊處理液均勻涂布在玻璃纖維素膜上，在空氣濕度低于60%的條件下，室溫自然晾干；
(7)檢測卡的組裝:PVC膠板自上而下依次粘貼樣品墊、膠體金膜、包被膜和吸水棉，組裝成試紙條，切割成一定寬度的長條，再將試紙條安裝在長條扁平殼狀的檢測卡外殼中。
[0008]所述步驟(5)中所包被的檢測線T設在質控線C的下方；
所述步驟(6)中的樣品墊處理液是由I g小牛血清蛋白(BSA)和0.8 g氯化鈉(NaCl),用含有 0.5%TRIT0N-100 的 0.01 mol/L PBS 定容至 100 mL ；
本發(fā)明可有效用于測定2，4-D，方法簡單，方便、快捷，結果準確。
【附圖說明】
[0009]圖1為本發(fā)明2，4-D的免疫膠體金檢測卡的結構圖:圖中1.加樣孔 2.檢測線
3.質控線4.檢測孔5.試紙條6.檢測卡外殼。
[0010]圖2為本發(fā)明2，4-D的免疫膠體金檢測卡內的試紙條的剖視結構圖，圖中7.樣品墊8.膠體金結合墊9.PVC膠板10.硝酸纖維素膜11.吸水墊。
【具體實施方式】
[0011]實施例1
圖1、圖2所示的實施例:圖中9為PVC膠板；7為樣品墊；8為膠體金結合墊，該膠體金結合墊上包被了單克隆抗體膠體金標記物；10為包被膜，即硝酸纖維素膜，該硝酸纖維素膜上包被了 2，4-D-BSA和羊抗鼠IgG ;11為吸水墊，由吸水材料如濾紙制成。
[0012]在PVC膠板9的一端上(樣