中：從左到右依次為水對照和MEVB株病毒按照血凝效 價進行 2 倍系列稀釋(分別為1:2,1:4,1:8,1:16,1:32,1:64,1:128,1:256)。
【具體實施方式】
[0039] 本發(fā)明的水貂細小病毒性腸炎病原體抗原膠體金檢測試紙條，其組成成分包括： 樣品墊、金標墊、NC膜和吸收墊，其中NC膜上的檢測線(T線)噴涂的是VP2蛋白，而質(zhì)控線(C 線)噴涂的是羊抗鼠二抗，整個試紙條組裝在一起包裹在塑料卡內(nèi)，如圖1所示。
[0040] 結(jié)果判定：如圖2a所示，質(zhì)控線（C線）顯示深色條帶，檢測線（T線）不顯示深色條 帶，判為陽性。如圖2b所示，質(zhì)控線(C線)和檢測線(T線)均顯示深色條帶，判為陰性。質(zhì)控線 (C線)和檢測線(T線)不顯示深色條帶或者是質(zhì)控線(C線）不顯示深色條帶而檢測線(T線） 顯示深色條帶，均判為無效。
[0041] 本發(fā)明的水貂細小病毒性腸炎病原體抗原膠體金檢測試紙條的制備方法，主要包 括以下步驟：
[0042]步驟一、原核表達水貂細小病毒(MEV)VP2蛋白及其純化 [0043]步驟二、原核表達水貂細小病毒(MEV)VPl部分蛋白及其純化 [0044]步驟三、水貂細小病毒(MEV)單克隆抗體的制備
[0045] 步驟四、膠體金溶液的制備
[0046] 步驟五、金標抗體溶液的制備 [0047]步驟六、金標墊的制備
[0048] 步驟七、NC膜的預(yù)處理(C、T線的劃線）
[0049] 步驟八、試紙條的組裝。
[0050] 實施例1原核表達水貂細小病毒(MEV)VP2蛋白及其純化
[0051] 檢測線(T線）的VP2蛋白是經(jīng)過原核表達純化而得到的。
[0052]具體過程為：（1)采用PCR技術(shù)擴增水貂細小病毒MEVB株VP2基因，擴增條件為:95 °C，5min;94°C，30s，55°C，lmin，72°C，2min;72°C，8min。將獲得的基因片段定向克隆至原核 表達載體PET-30a，構(gòu)建水貂細小病毒(MEV)VP2基因原核表達重組質(zhì)粒PET-30a-VP2。
[0053] (2)將上述獲得的水貂細小病毒(MEV)VP2基因原核表達重組質(zhì)粒PET-30a-VP2轉(zhuǎn) 化至宿主菌BL21中，IPTG誘導(dǎo)后VP2蛋白以包涵體的形式表達，進行SDS-PAGE和Western blotting分析表明該VP2蛋白能正確表達。
[0054] (3)結(jié)果表明：該基因全長為1755bp，其目的基因序列完全正確，能編碼584個氨基 酸，利用水貂細小病毒(MEV)VP2基因原核表達重組質(zhì)粒PET-30a-VP2上的His標簽對其進行 純化，經(jīng)過His Bind Purification Kit純化試劑盒純化即可得到目的蛋白，該目的蛋白即 水貂細小病毒(MEV)VP2蛋白的氨基酸序列如序列表中的序列1所示。
[0055]實施例2原核表達水貂細小病毒(MEV)VPl部分蛋白及其純化
[0056] 水貂細小病毒(MEV)VPl蛋白是通過表達VP1部分基因獲得的，其表達純化方法參 照實施例1。
[0057] 具體過程為：（1)采用PCR技術(shù)擴增水貂細小病毒MEVB株VP1部分基因，擴增條件 為:95°C，5min;94°C，30s，55°C，45s，72°C，90s;72°C，8min。將獲得的基因片段定向克隆至 原核表達載體PET-30a，構(gòu)建水貂細小病毒(MEV)VPl基因原核表達重組質(zhì)粒PET-30a-VPl。
[0058] (2)將上述獲得的水貂細小病毒(MEV)VPl基因原核表達重組質(zhì)粒PET-30a-VPl轉(zhuǎn) 化至宿主菌BL21中，IPTG誘導(dǎo)后VP1蛋白以包涵體的形式表達，進行SDS-PAGE和Western blotting分析表明該VP1蛋白能正確表達。
[0059] (3)結(jié)果表明：該基因長為900bp，其目的基因序列完全正確，能編碼300個氨基酸， 利用水貂細小病毒(MEV)VPl基因原核表達重組質(zhì)粒PET-30a-VPl上的His標簽對其進行純 化，經(jīng)過His Bind Purification Kit純化試劑盒純化即可得到目的蛋白，該目的蛋白即水 貂細小病毒(MEV)VPl蛋白的氨基酸序列如序列表中的序列2所示。
[0060]實施例3水貂細小病毒(MEV)單克隆抗體的制備
[0061 ] (1)將上述原核表達純化的水貂細小病毒VP1蛋白免疫BABL/c小鼠，首次免疫將水 貂細小病毒VP1蛋白與弗氏完全佐劑等體積乳化后，采用腹腔注射的方式免疫，每間隔兩周 進行一次免疫，共免疫4次，其中第2次、第3次采用弗氏不完全佐劑乳化，第4次是融合前3天 的加強免疫。
[0062] (2)加強免疫后經(jīng)過間接ELISA方法測定小鼠血清抗體效價，水貂細小病毒(MEV) 抗體效價達到1〇5以上進行融合，無菌取小鼠脾臟，研磨離心后與骨髓瘤細胞SP2/0融合，采 用間接ELISA方法進行篩選以及有限稀釋法進行亞克隆，最終篩選出分泌抗水貂細小病毒 (MEV)抗體的雜交瘤細胞株14株，選取親和力強的細胞株采用體內(nèi)制備抗體的方法，制備水 貂細小病毒(MEV)單克隆抗體。
[0063]實施例4膠體金溶液的制備
[0064]采用檸檬酸還原法制備20nm膠體金溶液。
[0065] 具體過程為：取1 %的氯金酸溶液lmL加入去離子水99mL充分混勻后置于電爐上， 加熱至沸騰;在劇烈攪拌中迅速加入1 %的檸檬酸三鈉溶液1.5mL，迅速混勻，并使其保持沸 騰狀態(tài)，溶液顏色則由淺黃色依次轉(zhuǎn)變?yōu)闇\黑色、黑色、深紫色逐漸穩(wěn)定為酒紅色，繼續(xù)煮 沸5min，待冷卻后用去離子水補充至100mL，獲得20nm膠體金溶液，4°C避光保存。
[0066]實施例5金標抗體溶液的制備
[0067] (1)取20nm的膠體金溶液lmL，用0 . lmol/I^K2C03溶液調(diào)至最佳PH值8.0，攪拌混 勻。
[0068] (2)加入純化后的水貂細小病毒(MEV)單克隆抗體12yg，混勻，室溫靜置30min。
[0069] (3)加入PEG-20000和BSA溶液攪拌混勻，靜置30min。
[0070] (4)將已經(jīng)標記好的膠體金探針1500r/min離心30min，去除沉淀;上清12000r/min 離心30min，棄上清;將沉淀的膠體金探針用BSA和疊氮鈉溶液懸浮并離心，最后將沉淀用 lmL的BSA和疊氮鈉溶液的混合物進行溶解，獲得金標抗體溶液，4°C避光保存。
[0071]實施例6金標墊的制備
[0072] 將一整張玻璃纖維素膜切割成5mmX30cm的長條，用0.01mol/L、PH為8.2的TB溶液 充分處理，并置于37°C烘干，按照上述尺寸(5mmX3〇Cm)每厘米噴涂6μ1金標抗體溶液。
[0073] 其儀器參數(shù)如下:速度50mm/s，加速度1000mm/s2，Ζ軸下降54.5mm。
[0074] 實施例7NC膜的預(yù)處理(C、T線的劃線）
[0075] 采用Biodot XYZ3060儀器，檢測線T線標記純化后的VP2蛋白（0.85mg/ml)，質(zhì)控線 C線標記商品化的羊抗鼠二抗(lmg/ml)。
[0076]將純化后的VP2蛋白及抗體劃線于NC膜上，其劃線基本參數(shù)為:T線2yl/cm，C線1μ l/cm，T線與C線間隔5mm。
[0077] 乂￥23060儀器參數(shù)為：1'線速度50111111/8，加速度1000111111/82,2軸下降55111111，(^〇口為 40nl，pitch 0.4,on time 0.4;C線速度50mm/s，加速度 1000mm/s2，Z軸下降55mm，drop為 40nl，pitch 0·4,οη time 0.4〇
[0078] 實施例8試紙條的組裝
[0079] 將NC膜、金標墊、樣品墊和吸收墊依次貼于PVC背板上，用切割機剪切成4mmX60mm 大小試紙條，放于大小適合的塑料卡槽內(nèi)，組裝成檢測MEV抗原的膠體金檢測試紙條。
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