水貂細小病毒性腸炎病原體抗原膠體金檢測試紙條及其制備方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及毛皮動物病毒性傳染病病原的檢測技術領域，具體涉及一種水貂細小 病毒性腸炎病原體抗原膠體金檢測試紙條及其制備方法。
【背景技術】
[0002] 水紹腸炎病毒(Mink enteritis virus，MEV)引起的水紹病毒性腸炎發(fā)病率和死 亡率高，給養(yǎng)貂業(yè)帶來了巨大的經濟損失。然而本病沒有特異的治療方法，只能采用疫苗免 疫來預防，所以對水貂病毒性腸炎的診斷顯得尤為重要。目前對MEV的診斷主要是HA-HI和 傳統PCR方法，HA操作繁瑣，耗時費力，而且需要準備豬的紅血細胞;而PCR是近些年發(fā)展起 來的分子生物學診斷方法，主要用于病毒核酸的檢測，但是PCR方法需要專業(yè)的儀器設備， 而且操作人員需要經過專門的培訓才能在專門的實驗室內操作。
[0003] 自從1971年Faulk與Taylor創(chuàng)立膠體金標記技術以來，膠體金已成為繼焚光標記、 酶標記和放射性免疫標記之后的又一種新型的免疫標記技術。膠體金技術具有方便快捷、 特異敏感、穩(wěn)定性強、不需要特殊設備和試劑、結果判斷直觀等優(yōu)點，正因為這些特性使它 在工作量大、設施較簡單的動物檢驗檢疫實際工作中具有很大的實用性，滿足了基層獸醫(yī) 檢測和大面動物檢測需求，所以在獸醫(yī)傳染病上得到了廣泛的應用，尤其是病毒性傳染病， 目前已經在多種動物病毒的檢測上應用了本技術。

【發(fā)明內容】

[0004] 為了解決現有技術存在的問題，本發(fā)明提供一種快速檢測水貂腸炎病毒抗原的膠 體金試紙條及其制備方法。
[0005] 本發(fā)明為解決技術問題所采用的技術方案如下：
[0006] 本發(fā)明的水貂細小病毒性腸炎病原體抗原膠體金檢測試紙條，包括:樣品墊、金標 墊、NC膜和吸收墊，所述NC膜的檢測線上噴涂水貂細小病毒VP2蛋白，所述NC膜的質控線上 噴涂羊抗鼠二抗;所述金標墊的制備方法為:采用20nm膠體金溶液標記水貂細小病毒單克 隆抗體獲得金標抗體溶液，將其按照6yl/cm的點樣量噴涂于玻纖膜上獲得金標墊;所述水 貂細小病毒單克隆抗體是采用水貂細小病毒VP1蛋白制備的，所述水貂細小病毒VP1蛋白的 氨基酸序列如序列表中的SEQ ID N0:2所示。
[0007] 進一步的，所述水貂細小病毒VP2蛋白濃度為0.85mg/ml，所述羊抗鼠二抗?jié)舛葹?lmg/ml〇
[0008] 本發(fā)明還提供了上述水貂細小病毒性腸炎病原體抗原膠體金檢測試紙條的制備 方法，包括以下步驟：
[0009] 步驟一、PCR擴增水貂細小病毒MEVB株VP2基因及VP1部分基因，定向克隆至原核表 達載體構建重組質粒，并轉化至宿主菌BL21中，IPTG誘導后經純化后得到水貂細小病毒VP2 蛋白和水貂細小病毒VP1蛋白；
[0010]步驟二、利用純化的水貂細小病毒VP1蛋白制備水貂細小病毒單克隆抗體；
[0011]步驟三、采用檸檬酸還原法制備20nm膠體金溶液；
[0012]步驟四、采用20nm膠體金溶液標記水貂細小病毒單克隆抗體獲得金標抗體溶液； [0013]步驟五、玻纖膜經預處理后，按照6yl/cm的點樣量在玻纖膜上噴涂金標抗體溶液， 獲得金標墊；
[0014] 步驟六、將純化后的濃度為0.85mg/ml的水貂細小病毒VP2蛋白噴涂在NC膜的檢測 線上，將濃度為lmg/ml的羊抗鼠二抗噴涂在NC膜的質控線上；
[0015] 步驟七、將NC膜、金標墊、樣品墊和吸收墊組裝成膠體金檢測試紙條。
[0016] 優(yōu)選的，步驟一中，所述原核表達載體為PET-30a。
[0017] 優(yōu)選的，步驟一中，水貂細小病毒VP2蛋白和水貂細小病毒VP1蛋白的純化方法為： 利用His標簽進行純化，經His Bind Purification Kit純化試劑盒純化即可得到目的蛋 白。
[0018] 優(yōu)選的，步驟二中，利用純化的水貂細小病毒VP1蛋白制備水貂細小病毒單克隆抗 體的具體方法為：
[0019] (1)將純化的水貂細小病毒VP1蛋白免疫BABL/c小鼠，首次免疫將水貂細小病毒 VP1蛋白與弗氏完全佐劑等體積乳化后，采用腹腔注射方式免疫，每間隔兩周進行一次免 疫，共免疫4次，其中第2次、第3次采用弗氏不完全佐劑乳化，第4次是融合前3天的加強免 疫；
[0020] (2)加強免疫后經過間接ELI SA方法測定小鼠血清抗體效價，水貂細小病毒抗體效 價達到1〇5以上進行融合，無菌取小鼠脾臟，研磨離心后與骨髓瘤細胞SP2/0融合，采用間接 ELISA方法進行篩選以及有限稀釋法進行亞克隆，最終篩選出分泌抗水貂細小病毒抗體的 雜交瘤細胞株14株，選取親和力強的細胞株采用體內制備抗體的方法，制備水貂細小病毒 單克隆抗體。
[0021] 優(yōu)選的，步驟三中，采用檸檬酸還原法制備20nm膠體金溶液的具體方法為：
[0022]取1 %的氯金酸溶液lmL加入去離子水99mL充分混勻后，加熱至沸騰;邊攪拌中邊 加入1 %的檸檬酸三鈉溶液1.5mL，混勻，并使其保持沸騰狀態(tài)，溶液顏色則由淺黃色依次轉 變?yōu)闇\黑色、黑色、深紫色，最終穩(wěn)定為酒紅色，繼續(xù)煮沸5min，待冷卻后用去離子水補充至 1 OOmL，獲得20nm膠體金溶液，4 °C避光保存。
[0023]優(yōu)選的，步驟四中，金標抗體溶液的具體制備方法為：
[0024] (1)取20nm的膠體金溶液lmL，用0 . lmol/I^K2C03溶液調至最佳PH值8.0，攪拌混 勻；
[0025] (2)加入純化后的水貂細小病毒(MEV)單克隆抗體12yg，混勻，室溫靜置30min;
[0026] (3)加入PEG-20000和BSA溶液攪拌混勻，靜置30min;
[0027] (4)將已經標記好的膠體金探針1500r/min離心30min，去除沉淀;上清12000r/min 離心30min，棄上清;將沉淀的膠體金探針用BSA和疊氮鈉溶液懸浮并離心，最后將沉淀用 lmL的BSA和疊氮鈉溶液的混合物進行溶解，獲得金標抗體溶液，4°C避光保存。
[0028]優(yōu)選的，步驟五中，玻纖膜的預處理過程為：
[0029] 將玻璃纖維素膜切割成5mmX 30cm的長條，用0.01mol/L、PH為8.2的TB溶液處理， 置于37 °C烘干。
[0030] 優(yōu)選的，步驟六中，采用Biodot XYZ3060儀器將純化后的VP2蛋白及羊抗鼠二抗劃 線于NC膜上;劃線參數為:T線2yl/cm，C線1μ1/〇?，Τ線與C線間隔5mm;Biodot XYZ3060儀器 參數為:T線速度50mm/s，加速度1000mm/s2，Z軸下降55mm，drop為40nl，pitch 0.4,on time 0 · 4; C線速度50mm/s，加速度 1000mm/s2，Z軸下降55mm，drop為40nl，pitch 0 · 4，on time 0.4。
[0031] 本發(fā)明的有益效果是：
[0032] 本膠體金試紙條的建立將有助于毛皮動物養(yǎng)殖場凈化水貂病毒性腸炎，方便基層 獸醫(yī)人員的操作。
[0033] 本發(fā)明不僅可以用于水貂病毒性腸炎的診斷，而且可以用于犬細小病毒病的診 斷，可以廣泛的用于寵物醫(yī)院等臨床對犬細小病毒腸炎的診斷。
[0034] 本發(fā)明用于快速檢測水貂糞便中的細小病毒抗原，尤其適用于基層獸醫(yī)及養(yǎng)殖場 技術人員的現場操作。
【附圖說明】
[0035] 圖1為本發(fā)明的水貂細小病毒性腸炎病原體抗原膠體金檢測試紙條的實物圖。圖 中：S為加樣孔，T為檢測線，C為質控線。
[0036] 圖2為本發(fā)明的水貂細小病毒性腸炎病原體抗原膠體金檢測試紙條結果判定示意 圖。圖2a為陽性判定結果(C線一條線），圖2b為陰性判定結果(C線、T線兩條線）。
[0037] 圖3為特異性試驗結果圖。圖中：從左到右依次為CPV BJ14-24、MEVB、AMDV-G、CAV-2C和⑶V3以及水對照。
[0038]圖4為敏感性試驗結果圖。圖