s/yL。
[0038]4)加樣:將2.(1)中稀釋好的cAMP溶液按每個(gè)濃度1個(gè)復(fù)孔，10yL每孔加入384孔板中，再加入1孔10yL的SB作為negative control(NC);將2.(2)中稀釋好的Forskolin溶液按每個(gè)濃度2個(gè)復(fù)孔，5yL每孔加入384孔板中，再加入2孔每孔各5yL的SB作為cell negativecontrol (CNC)。接著向不同濃度的Forskol in溶液及CNC中加入2.(3)配制好的不同濃度的細(xì)胞稀釋液各5yL。將384孔板在500rpm下離心15s，使10yL試劑混合均勻以充分反應(yīng)。為防止試劑蒸發(fā)造成損失，將TopSeal-A膜貼于板面并將板放于室溫下使之孵育45min。
[0039]5)終止試劑:用Lysis buffer(LB)將cAMP_d2稀釋40倍，將ant1-cAMP稀釋20倍。取適量LB與稀釋好的ant1-cAMP溶液按1:1混合，向NC及CNC中每孔各加入10yL;將剩余cAMP-d2溶液與ant1-cAMP溶液按1:1混勻后加入到其余各孔，每孔10yL。將384孔板在500rpm下離心15s，使20yL試劑混合均勻以充分反應(yīng)。重新貼上TopSeal-A膜并將板放于室溫下繼續(xù)孵育60min。
[°04°] 6)檢測(cè):孵育時(shí)間到達(dá)后，揭去TopSeal-A膜，將板放于設(shè)定好程序的Paradigm?Detect1n Platform上檢測(cè)。處理數(shù)據(jù)，確定最佳細(xì)胞數(shù)及Forskol in的ECso。
[0041 ] (3)激動(dòng)劑驗(yàn)證
[0042]1)EP4激動(dòng)劑PGD2使用DMS0配制成10mM儲(chǔ)備液，因EP4偶聯(lián)Gai，需加入Forskolin刺激cAMP產(chǎn)生。首先根據(jù)2.(6)中Forskolin的EC8Q配制FSB，再用FSB逐級(jí)稀釋為最終濃度的2倍。
[0043]2)配制含最佳細(xì)胞數(shù)的溶液:用SB將1.(7)中重懸好的細(xì)胞稀釋為2.(6)中得到的最佳細(xì)胞濃度。
[0044]3)加樣:將3.(1)中稀釋好的PGD2溶液按每個(gè)濃度2個(gè)復(fù)孔，5yL每孔加入384孔板中，再加入4孔每孔各5yL的SB，其中2孔作為CNC，另2孔作為non-stimulated control(NSC)。將3.⑵配制的細(xì)胞溶液按每孔5yL加入384孔板中。將384孔板在500rpm下離心15s，使10yL試劑混合均勻以充分反應(yīng)。為防止試劑蒸發(fā)造成損失，將TopSeal-A膜貼于板面并將板放于室溫下使之孵育45min。
[0045]4)按2.(5)配制終止試劑。向CNC中每孔加入10yL LB/ant1-cAMP溶液(1:1)，向NSC及其余各孔每孔加入10此: 1)。將384孔板在500rpm下離心15s使20yL試劑混合均勻以充分反應(yīng)。重新貼上TopSeal-A膜并將板放于室溫下繼續(xù)孵育60mino
[0046]5)孵育時(shí)間到達(dá)后，揭去TopSeal-A膜，將板放于設(shè)定好程序的Beckman Paradigm上檢測(cè)。處理數(shù)據(jù)，確定pgd2的EC5Q及EC80。
[0047](4)拮抗劑驗(yàn)證
[0048]l)293cl8/EP4拮抗劑L-161982使用DMS0溶液配制成100mM儲(chǔ)備液，以SB逐級(jí)稀釋為最終濃度的4倍。
[0049]2)配制含最佳細(xì)胞數(shù)的溶液:用SB將1.(7)中重懸好的細(xì)胞稀釋為2.(6)中得到的最佳細(xì)胞濃度。
[0050]3)加樣:將4.(1)中稀釋好的L-16182溶液按每個(gè)濃度2個(gè)復(fù)孔，2.5yL每孔加入384孔板中，再加入4孔每孔各5yL的SB，其中2孔作為CNC，另2孔作為NSC，再加入2孔每孔各2.5μL的SB，作為cell positive control (CPC)。將4.(2)配制的細(xì)胞溶液按每孔5yL加入384孔板中。將384孔板在500rpm下離心15s，使7.5yL試劑(CNC及NSC為10yL)混合均勻以充分反應(yīng)。為防止試劑蒸發(fā)造成損失，將TopSeal-A膜貼于板面并將板放于室溫下使之孵育30min。[0051 ] 4)根據(jù) 2.(6)中Forskolin的EC8()配制FSB，用FSB按3.(5)中PGD2的EC8()配制PGD2溶液。向CPC中加入FSB，每孔2.5yL ；其余各孔加入PGD2溶液，每孔2.5yL ； CNC及NSC不加操作。將384孔板在500rpm下離心15s，使10yL試劑混合均勻以充分反應(yīng)。重新貼上TopSeal-A膜并將板放于室溫下繼續(xù)孵育45min。
[0052]5)按2.(5)配制終止試劑。向CNC中每孔加入1 OyL LB/ant 1-cAMP溶液(1:1)，向NSC、CPC及其余各孔每孔加入10yL cAMP-d2/anti_cAMP溶液(1: 1)。將384孔板在500rpm下離心15s使20yL試劑混合均勻以充分反應(yīng)。重新貼上TopSeal-A膜并將板放于室溫下繼續(xù)孵育60min。
[0053]6)孵育時(shí)間到達(dá)后，揭去TopSeal-A膜，將板放于設(shè)定好程序的Paradigm?Detect1n Platform上檢測(cè)。處理數(shù)據(jù)，確定措抗劑的ICso。
[0054]實(shí)驗(yàn)結(jié)果
[0055]確定了穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株293cl8/EP4的拮抗劑藥物篩選模型造模條件，每孔細(xì)胞數(shù)為50006118/^1^，即為250006118/\￥611，所得到?0^1^01;[11刺激結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)曲線趨勢(shì)最為一致(見(jiàn)圖1)。通過(guò)該模型驗(yàn)證了P⑶2對(duì)EP4的激動(dòng)作用，其EC5Q為1.333198.4nM(見(jiàn)圖2);驗(yàn)證了L-161982對(duì)EP4的拮抗作用，其IC5Q為580.7nM(見(jiàn)圖3)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.前列腺素E2受體4拮抗劑藥物篩選模型高通量篩選模型，用激動(dòng)劑對(duì)培養(yǎng)過(guò)的293cl8/EP4穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株進(jìn)行反應(yīng)后加入d2標(biāo)記的cAMP示蹤劑與樣本cAMP競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合Eu3+穴狀物標(biāo)記的cAMP特異性抗體的結(jié)合位點(diǎn)反應(yīng)1小時(shí)，最后在Paradigm? Detect1n Platform檢測(cè)信號(hào)強(qiáng)度評(píng)價(jià)樣品中cAMP濃度。其特征在于確定了穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株293cl8/EP4的拮抗劑藥物篩選模型造模條件，所用的CAMP-d2assay方法簡(jiǎn)便省時(shí)，只需兩到三個(gè)小時(shí)即可得到結(jié)果，即開(kāi)即用，毋需用放射性同位素和有機(jī)溶劑。靈敏度高，步驟少，無(wú)損失，結(jié)果準(zhǔn)確，能夠滿足高通量篩選的要求。
【專利摘要】一種利用分辨熒光技術(shù)實(shí)現(xiàn)的前列腺素E2受體4拮抗劑活性高通量篩選，通過(guò)確定穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株293c18/EP4的拮抗劑藥物篩選模型造模條件，確定最佳細(xì)胞數(shù)為2500cells/well，所得到Forskolin刺激結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)曲線趨勢(shì)最為一致。該模型驗(yàn)證了PGD2對(duì)EP4的激動(dòng)作用，和L-161982對(duì)EP4的拮抗作用。包括以下步驟：(1)前列腺素E2受體4拮抗劑篩選模型的建立與優(yōu)化：標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定及最佳細(xì)胞數(shù)確定；(2)驗(yàn)證模型可靠性：激動(dòng)劑和拮抗劑驗(yàn)證。方法簡(jiǎn)便快捷；熒光檢測(cè)值靈敏度高，提高檢測(cè)精確度；結(jié)果穩(wěn)定可靠，重現(xiàn)性好。
【IPC分類】G01N33/50
【公開(kāi)號(hào)】CN105486851
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510828104
【發(fā)明人】嚴(yán)明, 俞沁瑋, 駱深玲, 張陸勇
【申請(qǐng)人】中國(guó)藥科大學(xué)
【公開(kāi)日】2016年4月13日
【申請(qǐng)日】2015年11月20日