n。)將活化時間到的樣品進行10000r/min離心，時間5min，然后再加入0.01M的PBS進行洗滌離心，重復3次。將離心完的樣品各加入適量的抗牛病毒性腹與病毒抗體，在混勾儀上偶聯(lián)lh。偶聯(lián)完成后加入的10%BSA封閉液45min。封閉結(jié)束后，轉(zhuǎn)速8000r/min離心分離5min，用0.01M的PBS清洗離心，重復3次，則將多余的抗體、BSA洗去，最后加入PBS進行重懸。制備的抗性修飾的KMnF4納米粒子即為免疫探針，保存在4 °C待用。
[0025]2.單克隆抗體固定:可以采用常規(guī)的酶標板固定方法，也可以采用以下方法。用干凈的蓋玻片5X5mm2正方形，鍍膜機先噴一層Cr (2-4 nm)用以幫助固定金。再用在表面派射噴上一層納米金，再采用200微升2 mmol 二硫基-琥?自酰亞胺-丙酸酯(DSP)對納米金進行修飾(DMS0，二甲基亞砜稀釋DSP)。加入抗牛病毒性腹瀉病毒抗體，即將100 μ?100 Pg/mL單克隆抗體通過共價偶聯(lián)法固定在玻璃板上并37 °C孵育45 min。加入1%牛血清蛋白(BSA)，22°C，1小時，將板上剩余的活性位點進行封閉并干燥。
[0026]3.將糞便樣品等進行預處理，必要時采用FDA增菌法，對樣品進行過濾、增菌活化等預處理，得到待檢樣品。待檢樣品加到第2步制得的固定了特異性單抗的酶標板上孵育20mins,若樣品中存在目標病毒，則會與酶標板上的單抗結(jié)合，通過洗滌，則目標病毒被固定在酶標板上。
[0027]4.將第1步所制的抗體修飾的KMnFjfi米探針加入第3步所得到的酶標板上，此時，如果酶標板上有目標病毒，通過免疫探針的特異性反應(yīng)，則探針會與酶標板上的目標病毒發(fā)生特異性結(jié)合，形成雙抗夾心結(jié)構(gòu)。此時用無菌的去離子水清洗，就可以將沒有結(jié)合的探針洗去。在酶標板上剩下的就只有結(jié)合了病毒的探針。
[0028]5.加入定量的洗脫液(30%甲醇)將第4步的酶標板上的結(jié)合了病毒的探針洗脫下來。得到的溶液，用核磁共振儀(NMR20，紐邁公司)測定溶液的自旋-晶格弛豫時間。以無菌的去離子水重復上述步驟作為空白，溶液測得的自旋-晶格弛豫時間與空白相比較，有顯著差異，說明溶液中有探針存在，從而說明樣品中有目標病毒，探針的量與自旋-晶格弛豫時間和自旋-自旋弛豫時間的下降值呈正比。下降的越多說明探針越多，從而間接說明病毒越多，通過加標驗證定量檢測樣品中目標病毒的數(shù)目。
[0029]實施例2。
[0030]測定樣品是否含有病毒一一豬細小病毒。
[0031]1.KMnF4納米粒子制備:KMnF 4納米粒子可以從市場購買，也可以采用以下方法制備:稱取1.6mmol MnCl2*4H20加入到反應(yīng)釜中，再加入10mL的無水乙醇，攪拌溶液至完全溶解；稱取3mmol油酸鉀加入上述溶液，攪拌l_2min，使其混勻；稱取5_6g的氟化鉀(KF)研磨lOmin以上，當其粒徑變小變細之后，稱取4.98mmol，將其加入之前的溶液中；再次加入無水乙醇，一般30mL ;夾套套緊，密封好后，將反應(yīng)釜放入烘箱，將溫度調(diào)制160°C，反應(yīng)24h ;當反應(yīng)釜降至室溫時，一般是在關(guān)閉烘箱后的3-4h即可。打開反應(yīng)釜，將上清液倒去，用無水乙醇洗滌并攪拌；洗滌完一次就進行一次離心，直到上清液澄清為止。轉(zhuǎn)速8000r/min，時間3min ;將洗滌好的樣品放入烘箱中，溫度調(diào)至60°C，所得顆粒粒徑一般是20nm。
[0032]KMnF4納米粒子羧基修飾:將得到的1^必4與PEG-1500按質(zhì)量比1:10在無水乙醇的溶解下，加入反應(yīng)釜中，密封完畢后放入烘箱中，將溫度調(diào)至90°C，反應(yīng)12小時；當反應(yīng)釜降至室溫時，一般是在關(guān)閉烘箱后的3-4h即可。打開反應(yīng)釜，將上清液倒去，用無水乙醇洗滌并攪拌；洗滌完一次就進行一次離心，直到上清液澄清為止。轉(zhuǎn)速8000r/min，時間3min ;將洗滌好的最終產(chǎn)品放在烘箱中自然晾干，得到PEG修飾的KMnF4納米粒子。
[0033]抗體修飾:稱取一定量的羧基修飾的腸必4納米粒子，加入2倍質(zhì)量的EDC和NHS，加入0.01M的PBS各lmL。放在混勻儀上，轉(zhuǎn)速15轉(zhuǎn)，反應(yīng)45min。)將活化時間到的樣品進行10000r/min離心，時間5min，然后再加入0.01M的PBS進行洗滌離心，重復3次。將離心完的樣品各加入豬細小病毒單抗，在混勾儀上偶聯(lián)lh。偶聯(lián)完成后加入的10%BSA封閉液45min。封閉結(jié)束后，轉(zhuǎn)速8000r/min離心分離5min，用0.01M的PBS清洗離心，重復3次，則將多余的抗體、BSA洗去，最后加入PBS進行重懸。制備的抗性修飾的KMnF4納米粒子即為免疫探針，保存在4 °C待用。
[0034]2.單克隆抗體固定:可以采用常規(guī)的酶標板固定方法，也可以采用以下方法。用干凈的蓋玻片5X5mm2正方形，鍍膜機先噴一層Cr (2-4 nm)用以幫助固定金。再用在表面派射噴上一層納米金，再采用200微升2 mmol 二硫基-琥?自酰亞胺-丙酸酯(DSP)對納米金進行修飾(DMS0，二甲基亞砜稀釋DSP)。加入豬細小病毒單抗，即將100 μ? 100 μδ/mL豬細小病毒抗體通過共價偶聯(lián)法固定在玻璃板上并37 °C孵育45 min。加入1%牛血清蛋白(BSA)，22°C，1小時，將板上剩余的活性位點進行封閉并干燥。
[0035]3.將樣品進行預處理，必要時采用FDA增菌法，對樣品進行過濾、增菌活化等預處理，得到待檢樣品。待檢樣品加到第2步制得的固定了大單抗的酶標板上孵育20mins，若樣品中存在目標病毒，則會與酶標板上的單抗結(jié)合，通過洗滌，則目標病毒被固定在酶標板上。
[0036]4.將第1步所制的抗體修飾的KMnFjfi米探針加入第3步所得到的酶標板上，此時，如果酶標板上有豬細小病毒，通過免疫探針的特異性反應(yīng)，則探針會與酶標板上的目標病毒發(fā)生特異性結(jié)合，形成雙抗夾心結(jié)構(gòu)。此時用無菌的去離子水清洗，就可以將沒有結(jié)合豬細小病毒的探針洗去。在酶標板上剩下的就只有結(jié)合了豬細小病毒的探針。
[0037]加入定量的洗脫液(30%甲醇)將酶標板上的結(jié)合了病毒的探針洗脫下來。得到的溶液，用核磁共振儀(NMR20，紐邁公司)測定溶液的自旋-晶格弛豫時間。以無菌的去離子水重復上述步驟作為空白，溶液測得的自旋-晶格弛豫時間與空白相比較，有顯著差異，說明溶液中有探針存在，從而說明樣品中有豬細小病毒，探針的量與自旋-晶格弛豫時間和自旋-自旋弛豫時間的下降值呈正比。下降的越多說明探針越多，從而間接說明豬細小病毒越多，通過加標驗證可以定量檢測樣品中目標病毒的數(shù)目。
【主權(quán)項】
1.一種基于KMnF 4納米探針的NMR病毒快速檢測方法，其特征是步驟如下: (1)檢測目標病毒的KMnFjfi米探針的制備； (2)將目標病毒特異性單抗在酶標板上的固定備用，并將多余的活性位點用牛血清蛋白封閉； (3)將待檢樣品加到步驟(2)所制得的酶標板上，孵育一段時間，若待檢樣品中含有目標病毒，則會與酶標板上的單抗結(jié)合，用無菌的去離子水清洗后，目標病毒被固定在酶標板上; (4)將步驟(1)制得的KMnF4納米探針懸濁液加到步驟(3)固定了目標病毒的酶標板上，若存在目標病毒則形成雙抗夾心，用無菌的去離子水清洗，則沒有結(jié)合的探針就被洗掉；若不存在目標病毒，則所有探針都被洗掉； (5)用洗脫劑將酶標板上的雙抗夾心的探針洗下來，如果還存在探針就是抓到目標病毒的探針； (6)步驟(5)所得的探針的懸濁液，進行核磁共振的弛豫時間測定；以無菌的去離子水重復上述步驟作為空白，測得的懸濁液的弛豫時間自旋-晶格弛豫時間和自旋-自旋弛豫時間相比無菌的去離子水有顯著降低，則說明含有探針，從而間接證明樣品中有目標病毒；探針的量與自旋-晶格弛豫時間和自旋-自旋弛豫時間的下降呈正比，通過加標定量探針而間接定量出目標病毒的量。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于KMnF4納米探針的NMR病毒快速檢測方法，其特征是所述探針為納米級KMnF4材料，其納米粒徑小于500納米。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于KMnF4納米探針的NMR病毒快速檢測方法，其特征是所述核磁共振弛豫時間，是指自旋-晶格弛豫時間和自旋-自旋弛豫時間。
【專利摘要】一種基于KMnF4納米探針的NMR病毒快速檢測方法，屬于食品安全快速檢測技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明依賴于建立的可以用于樣品中病毒的核磁共振檢測方法，利用KMnF4納米探針的順磁特性對核磁共振弛豫時間的影響，檢測出樣品中是否含有病毒。不同的具體的對應(yīng)關(guān)系為：KMnF4納米探針，在一定條件下顯示出線性關(guān)系，即KMnF4納米探針含量大，樣品的自旋-晶格弛豫時間值越小，在一定范圍能夠定量檢測病毒。本發(fā)明可以用于樣品中病毒的快速檢測，從而可以作為大批待檢樣品的快速篩選。
【IPC分類】G01N33/577
【公開號】CN105424938
【申請?zhí)枴緾N201510750082
【發(fā)明人】張錦勝, 萬益琴, 彭紅, 劉玉環(huán), 王允圃, 巫小丹
【申請人】南昌大學
【公開日】2016年3月23日
【申請日】2015年11月9日