obius chinesis)皮膚顯微組織切片的制備方法，包括以下步驟:
[0034](I)取材:在室溫下，使用鑷子將小鯢科動物背部皮膚夾起，然后使用剪刀剪取所需皮膚，放入10%福爾馬林中室溫保存，采集的皮膚組織塊大小為4mmX4mm，且切面應(yīng)在一條直線上；
[0035](2)固定:將采集的皮膚組織投入10%福爾馬林固定液(或75%酒精固定液)中進行固定，用量為組織塊體積的15倍(10?20被均可)，并做好標記，便于識別；
[0036](3)沖洗:將固定后的皮膚組織用水沖洗8min (5?1min均可)；
[0037](4)脫水:在室溫下將脫水劑(乙醇)用蒸餾水配成不同的梯度濃度，然后將皮膚組織置入，進行逐級脫水，即依次在50 %、70 %、80 %、90 %、95 %、100 %的乙醇中脫水，其中95%、100%乙醇各重復(fù)兩次，各級乙醇脫水的時間50min ;若步驟(3)中采用75%酒精固定液固定，則直接加入80%酒精中進行脫水(如需過夜，組織塊應(yīng)停留在70%乙醇中)；
[0038](5)透明:透明分兩步，第一步采用100%乙醇和二甲苯按體積比1:1配制的透明液，透明時間為2.5min，第二步采用純的二甲苯透明液，透明時間為20min ；
[0039](6)浸蠟:將已透明的組織放入體積比1:1的二甲苯與石蠟的混合液中25min，然后再分兩次放入盛有58°C純蠟的容器中，每次浸蠟50min，共lOOmin透蠟完畢；
[0040](7)包埋:在包埋盒內(nèi)注入融化的石蠟，將已浸蠟的組織塊置入其中(使欲切的組織面向下)，使蠟塊迅速冷卻硬固，包埋好的組織塊在蠟塊中可長期保存；
[0041](8)石蠟塊的整修:將包埋盒上石蠟塊做適當(dāng)整修，以節(jié)省刀片；
[0042](9)切片與展片:切片厚度5 μ m，切好片后置于42°C溫水中展片；
[0043](10)貼片與烤片:待石蠟切片自然伸展平之后輕輕地從水中撈取，撥正位置，控干水分，然后放入40 °C溫箱中干燥3h ;
[0044](11)H.E染色:H.E染色按以下流程進行，欲染切片依次置于二甲苯I (lOmin)—二甲苯 II (lOmin) — 100 % 酒精 I (5min) — 100 % 酒精 II (5min) — 95 % 酒精(5min) —85%酒精(5min) — 75 %酒精(5min)—蒸餾水浸泡(5min)—蘇木精染液(15min)—流水沖洗(5min) — HC1-酒精分化液(30s)—流水沖洗(20min)—鏡檢后蒸餾水沖洗(2min) — 70%酒精(lmin) — 85%酒精(lmin)—伊紅染液(2min) — 95%酒精I (2min) —95%酒精 II (2min) — 100%酒精 I (2min) — 100%酒精 II (2min) — 二甲苯I (5min) — 二甲苯II (5min)；
[0045](12)封固:在染色后的皮膚組織邊緣滴中性樹膠，用右手持細鑷輕輕地夾住蓋玻片的右側(cè)，并把它的左邊放在樹膠的左邊，然后左手持解剖針扶住蓋玻片的左邊，右手將鑷子松開逐漸下降，慢慢抽出，這樣樹膠在蓋玻片均勻地展開并將其中氣泡排出，用二甲苯擦干凈蓋玻片周多余邊溢的樹膠，將切片放置平穩(wěn)，稍加重壓，待樹膠干燥凝固，即得，切片可長期保存。
[0046]本實施例中小鯢科動物中國小鯢(Hynobius chinesis)皮膚石錯切片顯微圖如圖1所示，圖中Ep為表皮層，SC為致密真皮層，P為色素細胞，Μ為粘液腺，CV為毛細血管。
[0047]注意事項:
[0048]1、步驟(4)中脫水處理使用梯度濃度乙醇的作用是利用不同濃度的乙醇逐步脫去組織細胞中的水分，而不至于使組織細胞變形影響觀察效果，需要注意的是采用高濃度乙醇脫水時應(yīng)嚴格把握時間，以免脫水過度。
[0049]2、步驟(5)中透明處理采用的二甲苯有透明組織的作用，利用二甲苯占據(jù)細胞中乙醇位置從而達到透明組織的效果，需要注意的是應(yīng)時刻注意透明程度且透明適當(dāng)后立即放入石蠟中。脫水時應(yīng)注意每級中停留的時間依材料的大小、性質(zhì)以及固定液的性質(zhì)而定。
[0050]3、步驟(5)中如果組織塊有局部不能透明即有呈白色混濁狀態(tài)時，則是因脫水不徹底所致，應(yīng)退回重新脫水，然后再透明。
[0051]4、步驟￠)中浸蠟的作用是利用石蠟與二甲苯互溶的特性，使石蠟占據(jù)組織中二甲苯的位置，從而有利于切片。
[0052]5、步驟(11)中染色過程使用的二甲苯其作用是脫蠟，蘇木素染色細胞核，伊紅染色細胞質(zhì)，需要注意的是染色過程須嚴格把握時間以免功虧一簣。
[0053]在本發(fā)明的其他實施例中，各步驟中涉及參數(shù)的取值可做適當(dāng)調(diào)整，如步驟(4)脫水處理中，各級乙醇脫水時間可在45?60min適當(dāng)選取，組織塊較大時處理60min，組織塊較小時處理45min，再如步驟(5)透明處理中，第二步透明的時間可在10?30min適當(dāng)選取，達到透明效果時即可停止。在給定的范圍內(nèi)適當(dāng)調(diào)整各參數(shù)取值為本領(lǐng)域常規(guī)技術(shù)，此處不再舉例說明。
【主權(quán)項】
1.小鯢科動物皮膚顯微組織切片的制備方法，其特征在于:包括以下步驟: (1)脫水:將經(jīng)固定處理的小鯢科動物皮膚組織依次浸入濃度梯度50%、70%、80%、90 %、95 %、100 %的乙醇中脫水，其中95 %、100 %乙醇各重復(fù)兩次，每個梯度脫水45?60min ； (2)透明:將經(jīng)脫水處理的皮膚組織浸入100%乙醇與二甲苯的混合液中2?3min，取出后再浸入二甲苯中10?30min ； (3)浸蠟:將經(jīng)透明處理的皮膚組織放入二甲苯與石蠟的混合液中20?30min，取出后再分兩次放入石錯中，每次45?60min ； (4)將經(jīng)浸蠟處理的皮膚組織包埋，依次經(jīng)切片、展片、貼片、烤片、染色、封固處理，SP得。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于:步驟(2)中所述100%乙醇與二甲苯的體積比為1:1。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于:步驟⑶中所述二甲苯與石蠟的體積比為1:1。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于:步驟(4)中所述切片的厚度為4?6 μm，切片后置于42?45°C的水中展片。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于:步驟⑷中所述貼片、烤片為:待切片自然伸展平后從水中取出，控干水分，置于37?45°C下干燥2?4h，或者于室溫下自然干燥一夜。6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于:步驟(4)中所述染色為Η.E染色，操作步驟為:將切片依次置于二甲苯I lOmin、二甲苯II lOmin、100%乙醇I 5min、100%乙醇II 5min、95% 乙醇 5min、85% 乙醇 5min、75% 乙醇 5min、水 5min、蘇木精染液 10 ?20min，流水沖洗5min，再置于HC1-乙醇分化液20?40s，流水沖洗10?30min，鏡檢，流水沖洗2min，再依次置于70%乙醇lmin、85%乙醇lmin、伊紅染液2min、95%乙醇I 2min、95%乙醇 II 2min、100% 乙醇 I 2min、100% 乙醇 II 2min、二甲苯 I 5min、二甲苯 II 5min。7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的制備方法，其特征在于:所述蘇木精染液為:將lg蘇木精溶于20mL 100%乙醇中得甲液，50g鉀明礬溶于300mL蒸餾水中得乙液；將甲液、乙液混合，煮沸2?3min，再加蒸饋水定容至lOOOmL ;最后加入0.2g碘酸鈉，即得。8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的制備方法，其特征在于:所述伊紅染液為:將0.5g伊紅加入到100mL 85%乙醇中，溶解完全，即得。9.根據(jù)權(quán)利要求6所述的制備方法，其特征在于:所述HC1-乙醇分化液為:將lmL鹽酸加入到99mL 70 %乙醇中，混勻，即得。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種小鯢科動物皮膚顯微組織切片的制備方法，屬于顯微組織切片技術(shù)領(lǐng)域。該方法包括以下步驟：(1)脫水：將經(jīng)固定處理的小鯢科動物皮膚組織依次浸入濃度梯度50％、70％、80％、90％、95％、100％的乙醇中脫水，每個梯度脫水45～60min；(2)透明：將經(jīng)脫水處理的皮膚組織浸入100％乙醇與二甲苯的混合液中2～3min，取出后再浸入二甲苯中10～30min；(3)浸蠟：將經(jīng)透明處理的皮膚組織放入二甲苯與石蠟的混合液中20～30min，取出后再分兩次放入石蠟中，每次45～60min；(4)將經(jīng)浸蠟處理的皮膚組織包埋，依次經(jīng)切片、展片、貼片、烤片、染色、封固處理，即得；其流程簡單，操作方便，獲得的切片完整，圖片結(jié)構(gòu)清晰。
【IPC分類】G01N1/28, G01N1/06
【公開號】CN105241685
【申請?zhí)枴緾N201510487750
【發(fā)明人】熊建利, 劉秀英, 孫原野, 張亞男, 胡益源, 呂云云, 孫平
【申請人】河南科技大學(xué)
【公開日】2016年1月13日
【申請日】2015年8月10日