一種Et試劑及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于分析化學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種Et試劑及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] DTNB 是 5, 5' -二硫代雙（2-硝基苯甲酸）（5, 5' -Dithiobis-(2-nitrobenzoic acid))的簡(jiǎn)稱。一方面它和碳酸氫鈉或磷酸鹽緩沖溶液以一定的比例混合后用作產(chǎn)物乙 酰膽堿的顯色劑，顯黃色，通常用于農(nóng)殘檢測(cè)，以吸光度的大小來(lái)反映酶活性的大小并計(jì)算 膽堿酯酶的抑制率值，最終用來(lái)初步判斷農(nóng)藥是否超標(biāo)。另一方面常用于檢測(cè)游離的巰基 (-SH)，此時(shí)也稱作ELLman試劑。
[0003] 在現(xiàn)有的農(nóng)藥殘留快速檢測(cè)方法中，DTNB是作為一種檢測(cè)膽堿酯酶活性的單獨(dú)使 用顯色劑，樣品中的農(nóng)藥與膽堿酯酶作用抑制其酶活性后，再加入DTNB顯色劑和底物后放 到農(nóng)藥殘留檢測(cè)儀上檢測(cè)膽堿酯酶的活性并計(jì)算膽堿酯酶的抑制率值。無(wú)論在農(nóng)藥殘留檢 測(cè)還是在酶活性檢測(cè)過(guò)程中還未見(jiàn)有將DTNB與膽堿酯酶復(fù)合成一種應(yīng)用于農(nóng)藥殘留檢測(cè) 的專用試劑的報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的在于提供一種Et試劑及其應(yīng)用，由膽堿酯酶和5, 5' -二硫代雙 (2-硝基苯甲酸）混合而成一種應(yīng)用于食品安全檢測(cè)和生化檢測(cè)的Et試劑。在運(yùn)用膽堿酯 酶抑制法檢測(cè)農(nóng)藥殘留時(shí)只需吸取一次量的Et試劑，既可完成兩套器皿對(duì)兩種試劑的加 樣操作。為了解決膽堿酯酶與DTNB復(fù)合所引起的膽堿酯活性的降低失活，采用牛血清白蛋 白和海藻糖作為保護(hù)劑，以及?；悄懰徕c作為穩(wěn)定劑使Et試劑的穩(wěn)定性很好，在（0~5°C ) 的溫度下可以保存一年以上，膽堿酯酶的活性沒(méi)有明顯降低，且可很好地應(yīng)用于不同樣品 中的農(nóng)藥殘留的快速檢測(cè)。
[0005] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案： 一種Et試劑，由膽堿酯酶和5, 5'-二硫代雙（2-硝基苯甲酸）混合而成，兩者的重量 比為1 : 40~100。
[0006] 所述的Et試劑用于動(dòng)植物材料及食品、飲品、土壤中的有機(jī)磷和氨基甲酸酯類農(nóng) 藥殘留檢測(cè)。
[0007] 本發(fā)明的顯著優(yōu)點(diǎn)在于：在動(dòng)植物材料及食品、飲品、土壤中的農(nóng)藥殘留檢測(cè)時(shí) 直接將Et試劑與樣品待測(cè)液進(jìn)行酶抑制反應(yīng)，在運(yùn)用膽堿酯酶抑制法檢測(cè)農(nóng)藥殘留時(shí)只 需吸取一次量的Et試劑，既可完成兩套器皿對(duì)兩種試劑的加樣操作，使得操作過(guò)程更加簡(jiǎn) 便，檢測(cè)方法更加實(shí)用易于推廣普及，并減少實(shí)驗(yàn)器材的使用和試劑的營(yíng)運(yùn)成本。
【具體實(shí)施方式】
[0008] 實(shí)施例1 一種茶葉或茶青中農(nóng)藥殘留的檢測(cè)方法：茶葉或茶青中有機(jī)磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘 留的檢測(cè)步驟： (1) 試劑的配制： Et試劑：2mg (或Iku)膽堿酯酶溶解于500ml磷酸鹽緩沖溶液(稱取磷酸氫二鈉5~15g 和磷酸二氫鉀0. 2~0. 9g于試劑瓶中加入500mL蒸餾水溶解，混勾；）中，加入2~IOg牛 血清白蛋白和3~15g海藻糖攪拌溶解；另稱取80~200mg的DTNB和0. 5~5g的?；悄?酸鈉加入，并攪拌至完全溶解后即成為Et試劑，將其封裝在5ml的安瓿中并置于冰箱（0~ 5°C)保存。使用時(shí)取出開(kāi)封即可。
[0009] Sub試劑：稱取分析純的碘化硫代乙酰膽堿10~60mg加入IOmL蒸餾水，搖勻使之 溶解； 農(nóng)藥提取液：吸取100~300mL的丙三醇加入50mL的蒸餾水混勻后再加入160mL95wt. % 乙醇溶液，混勻； 緩沖液：稱取磷酸氫二鈉5~15g和磷酸二氫鉀0. 2~0. 9g于試劑瓶中加入500mL蒸餾水 溶解，混勻； (2) 檢測(cè) 樣品提?。?稱取0. 5克茶葉樣品，加入1.0 mL農(nóng)藥提取液，使樣品充分浸潤(rùn)并靜置10分鐘，底部溶 液即為待測(cè)液，作為檢測(cè)之用； 對(duì)照測(cè)定： 吸取Et試劑100 μ L，加入I. 5mL緩沖液，搖勻，加入200 μ L農(nóng)藥提取液，搖勻，靜置10 分鐘，加入100 μ L Sub試劑，搖勻后移入0. 5cm比色皿，及時(shí)放入農(nóng)藥測(cè)試儀進(jìn)行對(duì)照測(cè) 試； 樣品測(cè)定： 吸取Et試劑100 μ L，加入I. 5mL緩沖液，搖勻，加入200 μ L待測(cè)液，搖勻，靜置反應(yīng) 10分鐘，加入100 μ LSub試劑，搖勻后移入0. 5cm比色皿，及時(shí)放入農(nóng)藥測(cè)試儀進(jìn)行樣品測(cè) 試； 測(cè)定結(jié)果的判定： 當(dāng)檢測(cè)結(jié)果的酶抑制率讀數(shù)超過(guò)50%時(shí)，表明樣品農(nóng)藥殘留毒性可能超過(guò)安全標(biāo)準(zhǔn)， 應(yīng)當(dāng)確認(rèn)操作步驟無(wú)誤、儀器工作正常、試劑沒(méi)有污染失效，重新進(jìn)行對(duì)照測(cè)試并對(duì)此樣品 進(jìn)行2次以上的重復(fù)檢測(cè)，如檢測(cè)結(jié)果重復(fù)并仍然超過(guò)50%，則需用氣相色譜作進(jìn)一步的確 認(rèn)。
[0010] 在鐵觀音茶葉和實(shí)驗(yàn)室栽種的無(wú)農(nóng)藥的茶青進(jìn)行農(nóng)藥加樣提取測(cè)定，得到的不同 農(nóng)藥的檢測(cè)靈敏度如下： CN 105181685 A I兄明書(shū) 3/4 頁(yè)
實(shí)施例2 果蔬中農(nóng)藥殘留的快速檢測(cè)方法： (1) 試劑的配制： Et試劑：2mg (或Iku)膽堿酯酶溶解于500ml磷酸鹽緩沖溶液(稱取磷酸氫二鈉5~15g 和磷酸二氫鉀0. 2~0. 9g于試劑瓶中加入500mL蒸餾水溶解，混勾；）中，加入2~IOg牛 血清白蛋白和3~15g海藻糖攪拌溶解；另稱取80~200mg的DTNB和0. 5~5g的?；悄?酸鈉加入，并攪拌至完全溶解后即成為Et試劑，將其封裝在5ml的安瓿中并置于冰箱（0~ 5°C)保存。使用時(shí)取出開(kāi)封即可。
[0011] Sub試劑：稱取分析純的碘化硫代乙酰膽堿10~60mg加入IOmL蒸餾水，搖勾使之 溶解； 緩沖液：稱取磷酸氫二鈉5~15g和磷酸二氫鉀0. 2~0. 9g于試劑瓶中加入500mL蒸餾水 溶解，混勻； (2) 檢測(cè) 樣品提取：取2 g果蔬樣品（葉菜剪成寬度為1厘米左右的菜樣，塊根菜取橫截面樣 品）放入三角瓶中，加入IOmL緩沖液，振蕩提取2分鐘后過(guò)濾，取出清液即為待測(cè)試液。 對(duì)照測(cè)試：取Et試劑100 yL，緩沖液2. 5mL，加入專用反應(yīng)瓶中，混勻，再加入Sub試劑 100 μ L。搖勻后立即轉(zhuǎn)移到比色皿中，及時(shí)放入儀器，按對(duì)照測(cè)試鍵進(jìn)行對(duì)照測(cè)試。
[0012] 樣品測(cè)試：取Et試劑100 μ L，待測(cè)試液2. 5mL，加入專用反應(yīng)瓶中，混勻靜置抑制 10分鐘（秒表計(jì)時(shí)）后，再加入Sub試劑100 μ L。搖勻后立即轉(zhuǎn)移到比色皿中，及時(shí)放入儀 器，按樣品測(cè)試鍵進(jìn)行測(cè)試。
[0013] 測(cè)試結(jié)果的判讀：若被測(cè)樣品的酶抑制率讀數(shù)超過(guò)50 (即抑制率達(dá)到50%以上)， 則表明被測(cè)樣品的農(nóng)藥殘留毒性可能超過(guò)安全的界定標(biāo)準(zhǔn)，需用氣相色譜等儀器分析法作 進(jìn)一步的確認(rèn)。
[0014] 應(yīng)用上述的檢測(cè)方法和配套檢測(cè)試劑進(jìn)行果蔬中的農(nóng)藥殘留快速檢測(cè)，所得到的 樣品檢測(cè)靈敏度如下： CN 105181685 A 說(shuō)明書(shū) 4/4 頁(yè)
以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例，凡依本發(fā)明申請(qǐng)專利范圍所做的均等變化與修 飾，皆應(yīng)屬本發(fā)明的涵蓋范圍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種Et試劑，其特征在于：由膽堿酯酶和5, 5' -二硫代雙（2-硝基苯甲酸）混合而 成。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的Et試劑，其特征在于：膽堿酯酶和5, 5' -二硫代雙（2-硝基 苯甲酸）的重量比為1 : 40~100。3. -種如權(quán)利要求1所述的Et試劑的應(yīng)用，其特征在于：所述的Et試劑用于動(dòng)植物 材料及食品、飲品、土壤中的農(nóng)藥殘留檢測(cè)。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于：所述的農(nóng)藥為有機(jī)磷和氨基甲酸酯類農(nóng) 藥。
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種Et試劑及其應(yīng)用，由膽堿酯酶和5,5ˊ-二硫代雙(2-硝基苯甲酸)混合而成。在農(nóng)藥殘留檢測(cè)時(shí)直接將其與樣品待測(cè)液進(jìn)行酶抑制反應(yīng)，使得在進(jìn)行酶抑制反應(yīng)整個(gè)過(guò)程僅需三種試劑即可完成，檢測(cè)方法更加簡(jiǎn)便，并減少實(shí)驗(yàn)器材的使用和環(huán)境的污染。
【IPC分類】G01N21/78
【公開(kāi)號(hào)】CN105181685
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510422142
【發(fā)明人】黃敏, 蔡琪, 劉薇, 張青松
【申請(qǐng)人】福建省測(cè)試技術(shù)研究所
【公開(kāi)日】2015年12月23日
【申請(qǐng)日】2015年7月18日