高通量量化及分析口蹄病病毒及相關(guān)產(chǎn)物的方法
【專利說明】
[0001] 此專利申請以申請?zhí)枮?2/009, 126在2014年6月6日申請的美國專利申請作為 優(yōu)先權(quán)。上述提及的專利申請的所有內(nèi)容和公開都結(jié)合在此申請中。
[0002] 在此專利申請中的所有不同的參考文獻和公開都在此合并到此專利申請中從而 更全面描述此發(fā)明從屬的技術(shù)領(lǐng)域。
技術(shù)領(lǐng)域
[0003] 本發(fā)明涉及口蹄病病毒（Foot and Mouth Disease Virus, FMDV)的量化和分析。 本發(fā)明有助于開發(fā)用于預(yù)防口蹄病的產(chǎn)品，以及評估包含口蹄病病毒的產(chǎn)品。
【背景技術(shù)】
[0004] 口蹄病或手足口?。‵oot and Mouth Disease, FMD)是一種急性的全身性病毒感 染，主要影響供人食用的動物，例如牛、綿羊、山羊、豬以及其它偶蹄類動物?？谔悴〉母?度傳染性大大影響了畜牧業(yè)的生產(chǎn)力和經(jīng)濟，因此即使其死亡率極低，口蹄病仍是畜牧業(yè) 中最嚴重的疾病之一。
[0005] 口蹄病在全球多個地方流行。世界動物衛(wèi)生組織（OIE)定期發(fā)布口蹄病的分布和 爆發(fā)圖。由于OIE對肉類貿(mào)易市場的限制，OIE頒報的衛(wèi)生狀況對依賴于肉類貿(mào)易的國家 (特別是受口蹄病影響的國家）產(chǎn)生深遠的經(jīng)濟影響。
[0006] 大多數(shù)發(fā)達國家通過有效的疫苗和嚴格的監(jiān)控計劃成功根除口蹄病。但即使制定 了嚴格的國際貿(mào)易政策，口蹄病最近在歐洲（2000及2001年）和日本（2000及2010年） 仍發(fā)生了大爆發(fā)。
[0007] 盡管很多國家的所有或部分領(lǐng)土范圍獲得OIE認可其"因接種疫苗而消除口蹄 病，free from FMD with vaccination"的狀態(tài)，但其鄰近國家的口蹄病爆發(fā)仍造成持續(xù)的 威脅。
[0008] 經(jīng)過不斷的努力開發(fā)，現(xiàn)時已不需依賴大規(guī)模地增殖病原體來獲取重組亞基疫 苗，目前的疫苗都是源自經(jīng)滅活的病毒，并透過濃縮和提純這些病毒以達至一定的抗原質(zhì) 量，以產(chǎn)生具保護性的免疫反應(yīng)。制造這些疫苗的廠房需符合OIE的 NBS生物安全等級4 的要求。估計每年全球生產(chǎn)的口蹄病疫苗數(shù)量為25至30億劑。
[0009] 此外，很多國家建立了應(yīng)急方案以確保在口蹄病爆發(fā)時可以快速地制備疫苗應(yīng) 急。例如將口蹄病病毒抗原冷凍儲存，以建立抗原儲存庫。
[0010] 以滅活病毒制備的疫苗通常用于根除口蹄病和在緊急的情況下使用，疫苗效果大 大依賴于疫苗制劑的抗原有效載荷和病毒的完整性。
[0011] 口蹄病病毒（FMDV)包裹在非脂質(zhì)的包膜內(nèi)，呈二十面體對稱。口蹄病病毒的直徑 大小為28至40納米。整個病毒的顆粒在體外極度不穩(wěn)定，當(dāng)溫度超過56°C及pH值小于6 時，病毒即分離成為單份子?，F(xiàn)知有7個口蹄病病毒血清分型，分別是0型、A型、C型、 SATl 型、SAT2 型、SAT3 型和 Asial 型。
[0012] 現(xiàn)時一般推薦使用140S(146S)量化蔗糖密度梯度分析方法以量化病毒抗原。 該方法由 Barteling 和 Meloen (Barteling SJ, Meloen RH. A simple method for the quantification of 140S particles of foot-and-mouth disease virus (FMDV). Arch Gesamte Virusforsch, 1974 ;45 (4) : 362 - 4)建立，在過去30年里一直被視為測定病毒濃 度的可靠方法。該方法需要將樣本放在20-45%濃度梯度的蔗糖中，并對此進行超速離心。 蔗糖梯度可通過人手或使用簡易的梯度混合器將濃度較低的蔗糖液放在濃度較高的蔗糖 液上預(yù)備。
[0013] 146S分析方法的原理是口蹄病病毒顆粒會根據(jù)其沉降系數(shù)在相應(yīng)的蔗糖梯度中 分布，從而將不同的FMD病毒的顆粒分離。因此，該方法只能間接地檢測病毒顆粒的完整 性。
[0014] 盡管國際間致力將口蹄病病毒的檢測方法標準化，但至今還仍未有一個普遍認 可的方案或國際標準。這可能是由于檢測方法涉及復(fù)雜的技術(shù)和需要特殊的設(shè)備所致 (Barteling SJ. Need for further standardization of the 146-S test as the basis for f inal-Foot-and-Mouth Disease (FMD) Vaccine formulation. EUFMD Research Group Meeting 1999-Appendix 17)。
[0015] 缺乏檢測口蹄病疫苗中活性成分的標準方法是引致臨床試驗費用高昂且繁瑣的 主要原因。每個批次的疫苗一般需要在臨床試驗中使用17-20只大型動物以進行口蹄病疫 苗登記和發(fā)放疫苗。
[0016] 過去數(shù)十年間，人類和動物健康相關(guān)的行業(yè)見證了政府對制備藥物和生物制藥產(chǎn) 品的生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范（Good Manufacturing Practice，GMP)的規(guī)管愈來愈嚴格。期間 出現(xiàn)了新的規(guī)管概念，例如過程分析技術(shù)（Process Analytical Technology, PAT)。根據(jù) 食品和藥品監(jiān)督管理局（FDA)的定義，PAT是一個通過測量影響關(guān)鍵質(zhì)量參數(shù)（Critical Quality Attributes, CQA)的關(guān)鍵工序參數(shù)（Critical Process Parameters, CPP),進而設(shè) 計、分析和控制藥品生產(chǎn)過程的體系。
[0017] 對疫苗工業(yè)，特別是由完整抗原制備的疫苗（例如滅活病毒疫苗或經(jīng)減毒的活性 病毒疫苗）來說，需要能在納米范圍內(nèi)可靠地量化和測定的顆粒大小的方法和設(shè)備以監(jiān)控 生產(chǎn)疫苗的過程。監(jiān)控生產(chǎn)過程能確保生產(chǎn)過程每個步驟中的病毒抗原合符所需質(zhì)量，因 此十分重要。然而，涉及病毒的顆粒的生產(chǎn)流程復(fù)雜，因此相比普通重組蛋白（例如單克 隆抗體）其分析困難很多。其中一個挑戰(zhàn)就是當(dāng)前許多疫苗的生產(chǎn)方法都是開發(fā)于數(shù)十年 前，當(dāng)時仍未有開發(fā)出無血清的培養(yǎng)基。因此，現(xiàn)時制備疫苗通常需要使用添加了包含高 蛋白量血清的培養(yǎng)基。另外，通過感染細胞培養(yǎng)物而獲得的病毒顆粒其產(chǎn)量通常每公升只 有數(shù)毫克，這與重組蛋白例如單克隆抗體的表達相比小若干個數(shù)級。另一個要點是，一些病 毒例如口蹄病病毒會出現(xiàn)裂解性復(fù)制周期。此時，細胞會被摧毀，細胞的細胞質(zhì)和細胞核 中的所有物質(zhì)（包括遺傳物質(zhì)如核酸以及來自細胞膜的殘留脂質(zhì)）會釋放到細胞培養(yǎng)液， 這些物質(zhì)的存在使分析變得更加困難。
[0018] 分子排阻層析法（size/molecular exclusion chromatography)根據(jù)分子的流體 力學(xué)體積（hydrodynamic volume)將不同的分子分開。因此，即使分子量不同，具有相近 流體力學(xué)體積的不同分子一般在分子排阻層析柱內(nèi)的流動性相近。非常復(fù)雜的生產(chǎn)流程一 般涉及大分子量的DNA及脂質(zhì)，由于這些物質(zhì)的流體動力學(xué)體積與病毒相近，因此分子排 阻層析法通常不能將病毒與這些物質(zhì)分開。
[0019] 以蛋白或病毒為主的疫苗是常用的疫苗模型，用于將抗原運送到目標受體以進 行免疫。疫苗的成效大大取決于所運送的抗原是否具有正確或天然的構(gòu)象，因為只有正確 或天然的構(gòu)象才能呈現(xiàn)適當(dāng)?shù)目乖砦?，從而誘導(dǎo)特異并有效的免疫反應(yīng)。因此，錯誤折迭 、降解或聚集的抗原都可能降低甚至不能引起特異性的免疫反應(yīng)。動態(tài)光散射法（Dynamic Light Scattering，DLS)有助于評估蛋白性或病毒性疫苗的完整性和穩(wěn)定性，從而評估其 效力。通過分析DLS圖譜，可以檢查抗原在一段時間后或在特定緩沖器或溫度下存儲是否 已出現(xiàn)降級或聚集，從而確保疫苗的效力。
[0020] 分離方法例如分子排阻層析法只考慮顆粒的流動性，僅能粗略地估計顆粒的大 小，因此不能靈敏地偵測到抗原尺寸上的細微分別。DLS可以靈敏和準確地檢測和估計的 顆粒的大小，因此可以偵測到顆粒尺寸上的細微差別。然而，DLS只能估計高度純化的顆粒 的完整性和大小。
[0021] 由于口蹄病與全球的經(jīng)濟相關(guān)，因此必需不斷地改進預(yù)防口蹄病的措施，特別是 改進疫苗和/或制備疫苗的方法。本發(fā)明提供了一種能大量和準確地對口蹄病病毒及相關(guān) 產(chǎn)品進行量化和分析的方法。本發(fā)明提供一個有效且劃算、用于監(jiān)控口蹄病病毒疫苗質(zhì)量 的工具，可以滿足口蹄病病毒疫苗數(shù)量和質(zhì)量上不斷增長的需求。
[0022] 例如，中國市場作為世界上最大的口蹄病疫苗市場，每年需要17億劑量（每劑量 為2毫升）。以現(xiàn)時的工業(yè)規(guī)模為例，每一批次可達500萬劑（即每一批次達一萬公升）， 即是每年需要由不同廠商生產(chǎn)將近340批疫苗以應(yīng)付中國市場的需要。由于龐大的生產(chǎn) 量，截至今日，中國獸醫(yī)管理局已不再監(jiān)控每一批的口蹄病疫苗的質(zhì)量，僅信賴各疫苗生產(chǎn) 商的表現(xiàn)。口蹄病疫苗的質(zhì)量監(jiān)控通常利用體內(nèi)效能測試來進行。雖然這些體內(nèi)效能測試 可以大量地評估疫苗的質(zhì)量，但涉及復(fù)雜和繁瑣的程序。目前仍未有開發(fā)出可以大量及快 捷地對疫苗進行質(zhì)量監(jiān)控的體外技術(shù)。
[0023] 本發(fā)明首次開發(fā)一種體外系統(tǒng)能夠大量地量化每劑量的抗原負載和測定滅活抗 原的大小和完整性。本發(fā)明提供了一個相比體內(nèi)效力測試系統(tǒng)更簡化的系統(tǒng)以監(jiān)控口蹄病 疫苗的質(zhì)量，從而提高產(chǎn)品的質(zhì)量。本發(fā)明估計可以在短短幾天完成340個批次疫苗的質(zhì) 量監(jiān)控。
[0024] 因此，本發(fā)明可以提高疫苗的質(zhì)量，并為動物帶來更好的保護以對抗口蹄病。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0025] 為了改善目前預(yù)防口蹄病的方法和產(chǎn)品，本發(fā)明開發(fā)了一個結(jié)合使用分子排阻層 析法及同軸動態(tài)光散射（in-line dynamic light scattering)檢測的方法以量化及分析 口蹄病病毒（FMDV)。本發(fā)明所描述的方法可以大量地并精準地量化和分析口蹄病病毒。
[0026] 在一個實施例中，本發(fā)明提供一種方法用來量化口蹄病病毒（FMDV)的顆粒以及 檢測它們的大小和完整性。在一個實施例中，這些口蹄病病毒顆粒來自復(fù)雜的生產(chǎn)流程， 單單通過分子排阻層析法不能將流程中的污染物與口蹄病病毒顆粒分開。
[0027] 在一個實施例中，本發(fā)明的方法還包括一個或多個在進行分子排阻層析法和動態(tài) 光散射分析之前的樣本預(yù)備步驟。所述樣本預(yù)備步驟包括使用溶劑如氯彷進行溶劑萃取步 驟，和使用內(nèi)切酶如Benzonase?進行內(nèi)切核酸步驟。
[0028] 在一個實施例中，本發(fā)明提供一種用于從含有口蹄病病毒顆粒的產(chǎn)品分離和純化 口蹄病病毒的方法。
[0029] 在一個實施例中，本發(fā)明提供一種用于設(shè)計和制備防止口蹄病的制劑產(chǎn)品的方 法。
[0030] 在一個實施例中，本發(fā)明提供一種用來評估含有口蹄病病毒的產(chǎn)品的方法，用作 評估的參數(shù)可以是抗原的數(shù)量和穩(wěn)定性。這些產(chǎn)品包括但不限于含有口蹄病病毒的抗原庫 存和疫苗。
[0031] 在一個實施例中，本發(fā)明提供一種方法用來監(jiān)控生產(chǎn)過程期間的中間產(chǎn)品的質(zhì) 量，所述方法測量中間產(chǎn)品當(dāng)中的口蹄病病毒數(shù)量以及測試當(dāng)中的口蹄病病毒的完整性和 大小。
[0032] 本發(fā)明的方法可以大量地并精準地量化和分析病毒如口蹄病病毒（FMDV)。
[0033] 本發(fā)明的方法結(jié)合使用兩個樣本預(yù)備步驟及分子排阻層析法，隨后使用偵測 250-280nm的紫外線檢測器及動態(tài)光散射檢測器作色譜分析。本發(fā)明提供了