C-MS/MS分析?？瞻兹搜獫{樣品質(zhì)譜圖如圖1所 不。
[0047] 取L 5mL EP管數(shù)支，加入0XC、MHD、MHD-G標(biāo)準(zhǔn)溶液各15 μ L，氮氣吹干后，加入 150 μ L空白人血衆(zhòng)，15 μ L 1000ng/mL內(nèi)標(biāo)硝基安定溶液以及285 μ L乙腈沉淀蛋白，渦旋 混勾5~10min，13000rpm離心10~15min，取上清液10 μ L進(jìn)行LC-MS/MS分析。
[0048] 空白人血漿中加入0XC、MHD、MHD-G和內(nèi)標(biāo)硝基安定（Nitraz印am)的質(zhì)譜圖如圖 2所示。
[0049] 注：通道 a:0XC 選擇性反應(yīng)檢測離子[M+H]+m/z 253. 2 - m/zl80· 2CE:28eV ;通道 b:MHD選擇性反應(yīng)檢測離子[M+H]+m/z 255. 2 - m/zl94. 2CE:21eV ;通道c:內(nèi)標(biāo)硝基安定 選擇性反應(yīng)檢測離子[M+H]+m/z 282. 3 - m/z 236. 2CE:22eV ;通道d:MHD-G選擇性反應(yīng)檢 測離子[M+H]+m/z 431. 1 - m/zl94. 2CE:28eV。
[0050] 結(jié)果顯示，在本實驗所采用的LC-MS/MS條件下，血漿內(nèi)無雜峰對檢測物質(zhì)造成 干擾，OXC的保留時間約為1. 24min，MHD的保留時間約為1. 07min，MHD-G保留時間約為 1.0 Omin，內(nèi)標(biāo)硝基安定的保留時間約為I. 55min，3min內(nèi)完成測定。0XC、MHD、MHD-G和內(nèi) 標(biāo)硝基安定互不干擾，峰形良好，基線平穩(wěn)。
[0051] 3、標(biāo)準(zhǔn)曲線
[0052] 取I. 5mL EP管數(shù)支，分別加入0XC、MHD、MHD-G標(biāo)準(zhǔn)系列溶液，氮氣吹干后，加入 150 yL 空白人血漿，配置成濃度為（0XC:10、20、50、100、250、500、750ng/mL ;MHD:50、125、 500、2000、500、8000、10000ng/mL ;MHD-G :125、250、500、1000、2000、4000、5000ng/mL)的標(biāo) 準(zhǔn)含藥血漿。再加入15 μ LlOOOng/mL內(nèi)標(biāo)硝基安定溶液，285 μ L乙腈沉淀蛋白，渦旋混勻 5~10min，13000rpm離心10~15min，取上清液10 μ L進(jìn)行LC-MS/MS分析。分別計算0XC、 MHD、MHD-G的峰面積As和內(nèi)標(biāo)峰面積Ai的比值f (f = As/Ai)，以待測物濃度c為橫坐標(biāo)， 以f值為縱坐標(biāo)，用加權(quán)（權(quán)重系數(shù)：l/x2)最小二乘法進(jìn)行線性回歸運算得回歸方程。
[0053] OXC ：f = 0. 0055663+0. 00615469*c, r2= 0. 9985 ；
[0054] MHD ：f = 0. 0245203+0. 000508853*c, r2= 0. 9953 ；
[0055] MHD-G :f = -0· 00106133+8. 3264e-005*c，r2= 0· 9967。
[0056] OXC在10~750ng/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，最低定量限為10ng/mL。
[0057] MHD在50~lOOOOng/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，最低定量限為50ng/mL。
[0058] MHD-G在125~5000ng/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，最低定量限為125ng/mL。
[0059] 具體標(biāo)準(zhǔn)曲線圖如圖3-5所示。
[0060] 4、最低定量限（LLOQ)
[0061] 取1.51111^?管數(shù)支，分別加入(《(^!10、1^)-6標(biāo)準(zhǔn)溶液，氮氣吹干后，加入15(^1^ 空白人血漿，配置成濃度為（0XC:10ng/mL ;MHD:50ng/mL ;MHD-G :125ng/mL)的標(biāo)準(zhǔn)含藥血 漿。再加入15 μ L 1000ng/mL內(nèi)標(biāo)硝基安定溶液以及285 μ L乙腈沉淀蛋白，渦旋混勻5~ lOmin，13000rpm離心10~15min，取上清液10 μ L進(jìn)行LC-MS/MS分析。同時設(shè)5個平行 樣。計算OXC、MHD、MHD-G的峰面積As和內(nèi)標(biāo)峰面積Ai的比值f，代入當(dāng)天的血漿標(biāo)準(zhǔn)曲 線中求得含〇XC、MHD、MHD-G的實測濃度。由實測濃度計算最低定量限（LLOQ)的精密度 (RSD% )和準(zhǔn)確度（RE% )。
[0062] 由表 1 結(jié)果可知，OXC、MHD、MHD-G 的 RSD % 和 RE % 均在 15 % 以內(nèi)，OXC、MHD、MHD-G 的定量下限（LLOQ)分別為 10、50、125ng/mL(S/N>10)。
[0063] 表1LC-MS/MS法測定人血漿中OXC、MHD、MHD-G的定量下限（LLOQ)
[0064]
[0065] 5、精密度和準(zhǔn)確度
[0066] 按照人血漿標(biāo)準(zhǔn)曲線方法配制含 0XC(20、100、500ng/mL)、MHD(125、2000、8000ng/ mL)、MHD-G(250、1000、4000ng/mL)血漿樣品為低、中、高質(zhì)控（QC)樣品。再加入15yL 1000ng/mL內(nèi)標(biāo)硝基安定溶液以及285 μ L乙腈沉淀蛋白，禍旋混勾5~lOmin，13000rpm離 心10~15min，取上清液10 μ L進(jìn)行LC-MS/MS分析。連續(xù)3天，每天每個濃度5個平行樣， 計算OXC、MHD、MHD-G的峰面積As和內(nèi)標(biāo)峰面積Ai的比值f，代入當(dāng)天的血漿標(biāo)準(zhǔn)曲線中 求得含OXC、MHD、MHD-G的實測濃度，由實測濃度計算日內(nèi)、日間精密度，即為相對標(biāo)準(zhǔn)偏差 (RSD% )，實測濃度與理論濃度的比值即為準(zhǔn)確度（RE% )。
[0067] 由表2-4可知，OXC、MHD、MHD-G的低QC日內(nèi)、日間精密度和準(zhǔn)確度均小于20% ; 中、高QC日內(nèi)、日間精密度和準(zhǔn)確度均小于15%。
[0068] 表2LC-MS/MS法測定人血漿中OXC的日內(nèi)、日間精密度和準(zhǔn)確度
[0069]
[0070] 表3LC-MS/MS法測定人血漿中MHD的日內(nèi)、日間精密度和準(zhǔn)確度
[0071]
[0072] UiN 丄 UUlOOdiJi Λ J 一 I/ 丄 U X
[0073] 表4LC-MS/MS法測定人血漿中MHD-G的日內(nèi)、日間精密度和準(zhǔn)確度
[0074]
[0075]
[0076] 6、回收率
[0077] 取I. 5mL空白離心管數(shù)支，分別加入不同濃度的OXC、MHD和MHD-G標(biāo)準(zhǔn)溶液各 15 μ L，N2吹干后，再加入150 μ L人空白血漿配制成低、中、高三個濃度的標(biāo)準(zhǔn)含藥血漿 (0XC 血漿濃度分別為 20、100、500ng/mL，MHD 血漿濃度分別為 125、2000、8000ng/mL，MHD-G 血漿濃度分別為250、1000、4000ng/mL)。再加入15 μ L 1000ng/mL內(nèi)標(biāo)硝基安定溶液以及 285 μ L乙腈沉淀蛋白，禍旋混勾5~lOmin，13000rpm離心10~15min，取上清液10 μ L進(jìn) 行LC-MS/MS分析。得到相應(yīng)藥物峰面積和內(nèi)標(biāo)峰面積，分別為As (H)、Ai (H);每一濃度進(jìn) 行5樣本分析。
[0078] 取I. 5mL空白離心管數(shù)支，加入150 μ L人空白血漿后加再入300 μ L乙腈沉淀蛋 白，禍旋混勾5~10min，13000rpm離心10~15min后，備用。另取I. 5mL空白離心管數(shù) 支，分別加入不同濃度的〇XC、MHD和MHD-G質(zhì)控（QC)溶液和1000ng/mL內(nèi)標(biāo)硝基安定溶 液各15 μ L，N2下吹干，每管加入上述450 μ L乙腈離心處理后空白血漿上清液，渦旋溶解， 配制成低、中、高三個濃度的對照品溶液，進(jìn)樣分析，得到相應(yīng)藥物峰面積和內(nèi)標(biāo)峰面積，分 別為As (D)、Ai (D)，每一濃度進(jìn)行5樣本分析。提取回收率按下式計算=[As (H)/As (D)平 均]X100%〇
[0079] 表5-7結(jié)果表明，OXC回收率為85. 48 %~96. 24%，MHD回收率為90. 73 %~ 97. 95 %，MHD 回收率為 72. 30 % ~80. 63 %。
[0080] 表5LC-MS/MS法測定血漿中OXC的回收率（η = 5)
[0081]
[0083] 表6LC-MS/MS法測定血漿中MHD的回收率（η = 5)
[0084]
[0085] 表7LC-MS/MS法測定血漿中MHD-G的回收率（η = 5)
[0086]
[0087] 7、檢測結(jié)果
[0088] 檢測10名患兒服用奧卡西平（OXC)后，血漿OXC、MHD、MHD-G的谷濃度，見表8。
[0089] 表 8
[0090]
[0091] 由表1-8可知，本發(fā)明方法快速、準(zhǔn)確、靈敏度高、操作簡便，為0XC、MHD、MHD-G的 血藥濃度測定提供依據(jù)。本方法的〇XC、MHD、MHD-G血漿標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍為10~750ng/ mL、50~10000ng/mL、125~5000ng/mL，低QC日內(nèi)、日間精密度和精確度均小于20% ;中、 高QC日內(nèi)、日間精密度和準(zhǔn)確度均小于15%。
【主權(quán)項】
1. 一種同時測定人血漿中OXC以及代謝產(chǎn)物MHD和MHD-G的檢測方法，其特征是步驟 為： (1) 血漿樣品預(yù)處理：取血漿樣品，加入內(nèi)標(biāo)硝基安定，再加入乙腈沉淀蛋白，離心取上 清液，得到血楽樣品； (2) 色譜：將步驟（1)預(yù)處理后的血漿樣品進(jìn)行液相色譜分離：色譜條件中色譜柱： Phenomenex kinetex XB-C18柱；流動相：乙腈：水體積比為50:50,水中含有質(zhì)量濃度為 〇? 1% 的甲酸；流速：250~300 y L/min ;柱溫：30~40°C ;進(jìn)樣量：10 y L ; (3) 質(zhì)譜：離子源：電噴霧離子化ESI離子源，掃描方式：選擇反應(yīng)檢測掃描SRM，噴霧 電壓：3500~4000V，鞘氣：20~50psi，輔助氣：10~20arb，毛細(xì)管溫度：350°C，離子源溫度： 300 0C ； (4) 計算：采用內(nèi)標(biāo)法，以0XC、MHD和MHD-G和內(nèi)標(biāo)硝基安定的峰面積比值代入標(biāo)準(zhǔn)曲 線方程，計算〇XC、MHD和MHD-G的血藥濃度。2. 如權(quán)利要求1所述同時測定人血漿中OXC以及代謝產(chǎn)物MHD和MHD-G的檢測方法， 其特征是步驟（1)具體為：取血漿樣品150 y L，加入lOOOng/mL內(nèi)標(biāo)硝基安定溶液15 y L， 再加入乙腈285 y L，禍旋混勾5~10min，13000rpm離心10~15min，離心后取上清液。3. 如權(quán)利要求1所述同時測定人血漿中OXC以及代謝產(chǎn)物MHD和MHD-G的檢測方法， 其特征是：步驟（1)所述血漿樣品為含〇XC、MHD和MHD-G的血漿。4. 如權(quán)利要求1所述同時測定人血漿中OXC以及代謝產(chǎn)物MHD和MHD-G的檢測方法， 其特征是步驟（2 )中色譜柱長度為100mm，內(nèi)徑為2. 1mm，填料粒徑為2. 6 y m。5. 如權(quán)利要求1所述同時測定人血漿中OXC以及代謝產(chǎn)物MHD和MHD-G的檢測方法， 其特征是步驟（3)中檢測離子具體如下：0XC選擇性反應(yīng)檢測離子[M+H] + m/z 253.2 - m/ zl80. 2 CE: 28eV ;MHD 選擇性反應(yīng)檢測離子[M+H]+ m/z 255. 2 - m/zl94. 2 CE: 21eV ; MHD-G選擇性反應(yīng)檢測離子[M+H]+ m/z 431. 1- m/zl94. 2 CE: 28eV ;內(nèi)標(biāo)硝基安定選擇 性反應(yīng)檢測離子[M+H]+ m/z 282.3 - m/z 236.2 CE: 22eV。
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種同時測定人血漿中OXC以及代謝產(chǎn)物MHD和MHD-G的檢測方法，屬于生物檢測技術(shù)領(lǐng)域。本實驗以硝基安定為內(nèi)標(biāo)，蛋白沉淀法預(yù)處理后，采用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法可同時檢測3種化合物的血藥濃度。本發(fā)明方法時間短、特異性強(qiáng)、靈敏度高、操作簡便，已成功運用于人血漿中奧卡西平及其代謝產(chǎn)物的分析研究。
【IPC分類】G01N30/88
【公開號】CN105136957
【申請?zhí)枴緾N201510580239
【發(fā)明人】黃凱, 蔡建美, 過湘云, 華穎, 賀晴
【申請人】無錫市人民醫(yī)院
【公開日】2015年12月9日
【申請日】2015年9月11日