鐵(is)染色液(化學(xué)染色法)的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體的說是涉及鐵(IS)染色液(化學(xué)染色法)，即一種鐵染色試劑盒和染色方法。
【背景技術(shù)】
[0002]正常人的骨髓中含有一定量的鐵，以鐵蛋白及含鐵血黃素的形式貯存，供血細(xì)胞利用以合成血紅蛋白，此種鐵稱為“細(xì)胞外鐵”。存在于紅細(xì)胞內(nèi)的鐵顆粒稱為“細(xì)胞內(nèi)鐵”，紅細(xì)胞含鐵粒主要有三種類型:含有鐵顆粒的幼稚紅細(xì)胞稱為“鐵粒幼紅細(xì)胞”，含鐵顆粒的成熟紅細(xì)胞，稱為“鐵粒紅細(xì)胞”，鐵顆粒圍繞于幼紅細(xì)胞核周呈環(huán)形分布的細(xì)胞，稱為“環(huán)形鐵粒幼紅細(xì)胞”。
[0003]鐵化學(xué)染色可對細(xì)胞內(nèi)鐵和細(xì)胞外鐵進(jìn)行定位，反映機(jī)體內(nèi)鐵的儲存和利用情況。鐵化學(xué)染色主要用于鐵代謝異常相關(guān)疾病的診斷，如缺鐵性貧血骨髓細(xì)胞外鐵明顯減少，甚至消失，經(jīng)有效鐵劑治療后，細(xì)胞外鐵增多；鐵粒幼細(xì)胞貧血出現(xiàn)較多環(huán)形鐵粒幼紅細(xì)胞，鐵粒幼紅細(xì)胞也增多，其所含鐵顆粒的數(shù)目也較多，顆粒也粗大，有時(shí)還可見鐵粒紅細(xì)胞。另外，鐵染色還可用于觀察療效和評估預(yù)后及探索某些血液病的發(fā)病原理及治療機(jī)制。
[0004]普魯士藍(lán)染色是一種普遍使用的顯示鐵的染色方法，其檢測原理是骨髓中的細(xì)胞內(nèi)外鐵在酸性環(huán)境下與亞鐵氰化鉀作用，可形成普魯士藍(lán)色的亞鐵氰化鐵沉淀，定位于含鐵部位，藍(lán)色沉淀顆粒的多少和深淺與細(xì)胞內(nèi)外鐵的含量成正比。通常細(xì)胞外鐵以陽性強(qiáng)度表示，一般可分為五個(gè)級別:0級:骨髓小粒無藍(lán)色鐵粒出現(xiàn)；1+:有少量鐵?；蚺家婅F小珠；2+:有較多鐵粒、小珠；3+:有較多鐵粒、小珠、少數(shù)小塊狀；4+:有極多鐵粒、小珠、并有許多小塊狀。而細(xì)胞內(nèi)鐵則需要分型并以鐵粒幼紅細(xì)胞陽性率表示。鐵粒幼紅細(xì)胞根據(jù)鐵顆粒多少、粗細(xì)分為I型、II型、III型、IV型及環(huán)形鐵粒幼紅細(xì)胞。幼紅細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)有I?2個(gè)鐵粒(I型)；有3?5個(gè)鐵粒(II型)；6?10個(gè)鐵粒(III型)；大于10個(gè)鐵粒(IV型)。環(huán)形鐵粒幼細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)為:幼紅細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)的鐵顆粒在6粒以上，并圍繞于核周呈環(huán)狀分布。正常人細(xì)胞外鐵一般為(+)?(++);細(xì)胞內(nèi)鐵19%?44%、I型為主，少數(shù)II型，無環(huán)形鐵粒幼紅細(xì)胞及鐵粒紅細(xì)胞。
[0005]目前常規(guī)鐵染色試劑染色采用37°C水浴箱加熱，至少需30-60min，染色時(shí)間較長。復(fù)染試劑通常選用堿性品紅、沙黃、核固紅等，復(fù)染后細(xì)胞結(jié)構(gòu)不夠清晰，不易將幼紅細(xì)胞與單核細(xì)胞及粒細(xì)胞等細(xì)胞區(qū)分開，對內(nèi)鐵的含量判斷需要的時(shí)間較長，從而影響病理診斷的效率。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]有鑒于此，本發(fā)明的目的在于提供鐵(IS)染色液(化學(xué)染色法)，即一種含有核固紅復(fù)染液的鐵染色試劑盒，使得鐵染色液中所述核固紅復(fù)染液能夠提高骨髓細(xì)胞中鐵染色效果，諸如細(xì)胞分型明顯，細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰，更有利于辨認(rèn)骨髓細(xì)胞內(nèi)外鐵等，能夠應(yīng)用于骨髓細(xì)胞鐵染色中。
[0007]本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供一種骨髓細(xì)胞中鐵染色方法，使得所述方法縮短鐵染色試劑染色時(shí)間，同時(shí)提高骨髓細(xì)胞中鐵染色效果。
[0008]為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案:
[0009]—種含有核固紅復(fù)染液的骨髓細(xì)胞鐵染色試劑盒，所述核固紅復(fù)染液包含去污劑TritonX-1OO0
[0010]Triton X-100 (曲拉通X-100)，化學(xué)名為聚乙二醇單辛基苯基醚，是一種非離子型表面活性劑。本發(fā)明將其以一定濃度加入到核固紅染液中，能夠促進(jìn)核固紅進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)對細(xì)胞核進(jìn)行染色，起到協(xié)助染色的作用，增強(qiáng)染色的效果，染色后細(xì)胞核和細(xì)胞漿對比度增強(qiáng)，細(xì)胞分型明顯，更有利于檢測人員對細(xì)胞內(nèi)鐵水平的判斷。
[0011]作為優(yōu)選，所述去污劑TritonX-1OO的濃度為0.01-0.5mg/mL，更優(yōu)選0.02-0.2mg/mL,更進(jìn)一步優(yōu)選為 0.05-0.2mg/L。
[0012]作為優(yōu)選，本發(fā)明所述核固紅復(fù)染液包含核固紅、硫酸鋁、防腐劑和去污劑TritonX-1OO。其中，核固紅濃度優(yōu)選為l_20mg/mL，硫酸鋁濃度優(yōu)選為lO-lOOmg/mL，防腐劑濃度優(yōu)選為0.2-1.0mg/mL (防腐劑優(yōu)選麝香草酚)，TritonX-1OO的濃度優(yōu)選為0.01-0.5mg/mL ;更進(jìn)一步優(yōu)選地，核固紅濃度為2_5mg/mL，硫酸招濃度優(yōu)選為50mg/mL，防腐劑濃度優(yōu)選為0.5mg/mL(防腐劑優(yōu)選麝香草酚)，TritonX-100的濃度優(yōu)選為
0.02-0.2mg/mL (TritonX-100 的濃度可再進(jìn)一步優(yōu)選為 0.05-0.2mg/mL)。
[0013]將本發(fā)明所提供的核固紅復(fù)染液應(yīng)用于到骨髓細(xì)胞中鐵染色，相比傳統(tǒng)的核固紅復(fù)染液，細(xì)胞類型易于區(qū)分，細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰，對察細(xì)胞內(nèi)鐵的判定更準(zhǔn)確。
[0014]作為優(yōu)選，本發(fā)明所述試劑盒還包含常規(guī)鐵染色試劑盒常用到的固定液、亞鐵氰化鉀溶液以及鹽酸溶液。其中，所述固定液優(yōu)選為甲醇溶液或體積百分比濃度為10%的中性福爾馬林溶液(以磷酸緩沖液配置)；所述亞鐵氰化鉀溶液中亞鐵氰化鉀濃度優(yōu)選為lO-lOOmg/mL，更優(yōu)選為20_50mg/mL ;所述鹽酸溶液為將濃鹽酸以體積百分比1% -10%的比例稀釋獲得，更優(yōu)選為以體積百分比2% -5%的比例稀釋獲得。
[0015]本發(fā)明在上述試劑盒的基礎(chǔ)上提供了一種鐵染色方法，包括:
[0016]步驟1、骨髓涂片上滴加固定液固定，水洗待干；
[0017]步驟2、將鹽酸溶液緩緩滴入亞鐵氰化鉀溶液內(nèi)配制成染色液，將涂片用染色液染色，用微波爐將功率調(diào)至400-800W微波20-60s，水洗待干；
[0018]步驟3、用含去污劑TritonX-1OO的所述核固紅復(fù)染液復(fù)染，水洗待干，中性樹膠封片，鏡檢。
[0019]其中，所述微波爐功率以及微波時(shí)間隨之功率增大可適當(dāng)減少。作為優(yōu)選，上述染色方法包括:
[0020]步驟1、骨髓涂片上滴加3-5滴固定液，蓋滿骨髓膜，固定lOmin，水洗，待干；
[0021]步驟2、將鹽酸溶液緩緩滴入亞鐵氰化鉀溶液內(nèi)配制成染色液，將涂片放入含有染色液的染缸中，或?qū)⑷旧旱斡谕科戏湃霛窈袃?nèi)，用微波爐將功率調(diào)至500-600W微波25_30s，水洗，待干；
[0022]步驟3、用含去污劑TritonX-1OO的核固紅復(fù)染液復(fù)染1_2分鐘，水洗待干，中性樹膠封片，鏡檢。
[0023]作為優(yōu)選，本發(fā)明染色方法中步驟2所述染色液中HCl與亞鐵氰化鉀的摩爾濃度比為 4:1-6:1。
[0024]作為優(yōu)選，本發(fā)明染色方法中步驟2所述微波處理時(shí)間為25-30S。
[0025]作為優(yōu)選，所述去污劑TritonX-1OO的濃度為0.01-0.5mg/mL，更優(yōu)選0.02-0.2mg/mL,更進(jìn)一步優(yōu)選為 0.05-0.2mg/L。
[0026]作為優(yōu)選，本發(fā)明所述核固紅復(fù)染液包含核固紅、硫酸鋁、防腐劑和去污劑TritonX-1OO。其中，核固紅濃度優(yōu)選為l_20mg/mL，硫酸鋁濃度優(yōu)選為lO-lOOmg/mL，防腐劑濃度優(yōu)選為0.2-1.0mg/mL (防腐劑優(yōu)選麝香草酚)，TritonX-1OO的濃度優(yōu)選為0.01-0.5mg/mL ;更進(jìn)一步優(yōu)選地，核固紅濃度為2_5mg/mL，硫酸招濃度優(yōu)選為50mg/mL，防腐劑濃度優(yōu)選為0.5mg/mL(防腐劑優(yōu)選麝香草酚)，TritonX-1OO的濃度優(yōu)選為0.02-0.2mg/mL (TritonX-100 的濃度可再進(jìn)一步優(yōu)選為 0.05-0.2mg/mL)。
[0027]在本發(fā)明染色方法中，本發(fā)明采用微波處理染色后的樣品，借助其高頻短波的特性，使樣品內(nèi)部分子高頻運(yùn)動(dòng)，實(shí)現(xiàn)分子水平的“攪拌”，從而可以使鐵?？焖僦?，相比現(xiàn)有的處理方法大幅減少耗時(shí)。
[0028]由以上技術(shù)方案可知，本發(fā)明調(diào)整了核固紅復(fù)染液的成分組成，加入了去污劑TritonX-100，使其在進(jìn)行骨髓細(xì)胞鐵染色時(shí)相比常規(guī)核固紅復(fù)染液更易于區(qū)分細(xì)胞類型，細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰，對察細(xì)胞內(nèi)鐵的判定更準(zhǔn)確，同時(shí)在本發(fā)明染色方法中，采用微波方式替代常規(guī)的水浴方式，使得整體的染色時(shí)間大幅縮短。
【附圖說明】
[0029]圖1所示本發(fā)明試劑盒染色缸染色法骨髓細(xì)胞鐵染色效果圖；箭頭所指骨髓小粒內(nèi)可見藍(lán)色顆粒，呈陽性；
[0030]圖2所示本發(fā)明試劑盒染色缸染色法骨髓細(xì)胞鐵染色效果圖；箭頭所指A屬于成熟紅細(xì)胞，細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)藍(lán)色沉淀物為鐵顆粒，呈陽性，為鐵粒紅細(xì)胞，同時(shí)易看到B為幼稚紅細(xì)胞、C、D為白細(xì)胞；
[0031]圖3所示本發(fā)明試劑盒滴染法骨髓細(xì)胞鐵染色效果圖；箭頭所指骨髓小粒內(nèi)可見藍(lán)色顆粒，呈陽性；
[0032]圖4所示本發(fā)明試劑盒滴染法骨髓細(xì)胞鐵染色效果圖；箭頭所指A屬于幼稚紅細(xì)胞，細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)藍(lán)色沉淀物為鐵顆粒，呈陽性，為鐵粒幼紅細(xì)胞，同時(shí)易看到B、C、D、E為白細(xì)胞，F(xiàn)為成熟紅細(xì)胞；
[0033]圖5所示常規(guī)骨髓細(xì)胞鐵染色方法；箭頭所指骨髓小粒內(nèi)可見藍(lán)色顆粒，呈陽性；
[0034]圖6所示常規(guī)骨髓細(xì)胞鐵染色方法；箭頭所指細(xì)胞間有藍(lán)色沉淀物，呈陽性。
【具體實(shí)施方式】
[0035]本發(fā)明實(shí)施例公開了一種核固紅復(fù)染液及其應(yīng)用以及鐵染色試劑盒和染色方法。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以借鑒本文內(nèi)容，適當(dāng)改進(jìn)工藝參數(shù)實(shí)現(xiàn)。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動(dòng)對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發(fā)明。本發(fā)明的產(chǎn)品和方法已經(jīng)通過較佳實(shí)施例進(jìn)行了描述，相關(guān)人員明顯能在不脫