本發(fā)明涉及一種可以識別人平足蛋白的單克隆抗體及可分泌該抗體的雜交瘤細(xì)胞系。具體而言，本發(fā)明提供了一種抗腫瘤細(xì)胞表面抗原pdpn的單克隆抗體，該抗體可以用于通過人工或自動化方式，以免疫組織化學(xué)染色（ihc）、酶聯(lián)免疫吸附（elisa）或免疫印跡（westernblot）方式檢測細(xì)胞中pdpn的表達(dá)水平，從而對這些腫瘤進(jìn)行診斷，屬于生物檢測領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

pdpn蛋白又稱腎小球上皮細(xì)胞整合膜蛋白，1996年由wetterwald首次發(fā)現(xiàn)并報道，而后breiteneder等發(fā)現(xiàn)其還存在于小鼠的腎小球足狀突細(xì)胞膜表面蛋白，與維持腎小球通透性及足狀突細(xì)胞突起的形成有關(guān)。在breiteneder等的進(jìn)一步研究中發(fā)現(xiàn)，pdpn特異性表達(dá)于淋巴管，而不表達(dá)于血管，可作為淋巴管內(nèi)皮標(biāo)記物。

pdpn蛋白是一種相對分子量為38kda的ⅰ型跨膜唾液酸糖蛋白，由162個氨基酸組成，可分為4個部分：第一部分為第1位至第22位氨基酸組成的信號肽片段，第二部分為第23位至第131位氨基酸編碼的胞外片段，第三部分為第132位至第152位氨基酸編碼的跨膜片段，第四部分為第153位至第162位氨基酸組成的胞漿片段。

pdpn蛋白不只在淋巴管內(nèi)皮表達(dá)，也在人體很多組織細(xì)胞表達(dá)，如腎足突細(xì)胞、骨骼肌、肺、心臟和乳腺的肌成纖維細(xì)胞、唾液腺、成骨細(xì)胞、卵巢粒層細(xì)胞、濾泡樹突狀細(xì)胞和間皮細(xì)胞等。近年來，越來越多研究發(fā)現(xiàn)在多種人類腫瘤中pdpn表達(dá)由無到有或表達(dá)上調(diào)，包括口腔鱗癌、喉癌、肺癌、宮頸癌、子宮內(nèi)膜癌、膀膚癌、食管癌、結(jié)直腸癌、皮膚癌、淋巴瘤、牙源性細(xì)胞瘤、卵巢無性生殖細(xì)胞瘤及粒層細(xì)胞癌、間皮瘤等，另外在一些中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤中的表達(dá)也上調(diào)。

自從發(fā)現(xiàn)pdpn以來，針對它在淋巴管形成，炎癥的發(fā)生以及腫瘤的發(fā)生發(fā)展中的作用的研究越來越多，隨之產(chǎn)生各種抗pdpn的單克隆抗體。d2-40是最早制備的抗pdpn抗原的單克隆抗體，現(xiàn)在已用于病理診斷，診斷腫瘤患者的淋巴管轉(zhuǎn)移；nz-1抗體能夠抑制pdpn誘導(dǎo)的血小板聚集；18h5現(xiàn)在已經(jīng)商品化用于elisa，westernblot，fcm等技術(shù)。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的第一個目的是提供一種制備pdpn重組蛋白的方法，該重組蛋白由pdpn分子的胞外區(qū)片段及用于純化的組氨酸標(biāo)簽組成。

本發(fā)明的第二個目的是提供一種特異性好，親和力高的pdpn單克隆抗體，該抗體能特異結(jié)合pdpn重組抗原和天然抗原。

本發(fā)明的第三個目的是提供一種將本抗體用于腫瘤組織切片免疫組織化學(xué)檢測的使用方法。

解決技術(shù)問題所采用的技術(shù)手段

本發(fā)明對pdpn分子按照公布的序列進(jìn)行分析，依據(jù)在細(xì)胞膜上的結(jié)構(gòu)、抗原性、組成氨基酸的親疏水性以及二級結(jié)構(gòu)，選擇適宜可溶表達(dá)又具有良好免疫原性的區(qū)域用于重組表達(dá)。為促進(jìn)重組蛋白的可溶表達(dá)，優(yōu)化其表達(dá)行為，對片段進(jìn)行密碼子優(yōu)化，經(jīng)基因合成后克隆進(jìn)表達(dá)載體pet-28a中重組表達(dá)，純化目的蛋白后作為免疫原，多次免疫balb/c小鼠。經(jīng)細(xì)胞融合、篩選和亞克隆，獲得高效分泌抗pdpn抗體的單克隆細(xì)胞系。

利用該雜交瘤細(xì)胞系用小鼠進(jìn)行腹水制備，proteina/g柱親和層析純化腹水，獲得鼠單克隆抗體。用elisa技術(shù)測定該單克隆抗體的亞類為igg2b型單克隆抗體，親和常數(shù)為2.94×10⁸l/mol。免疫組化實驗顯示該抗體能特異識別表達(dá)pdpn分子的腫瘤細(xì)胞。

具體地，本發(fā)明涉及以下幾個方面：

一株分泌抗平足蛋白單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，為小鼠雜交瘤細(xì)胞系5b3d4，該細(xì)胞系已于2017年1月9日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏號為cgmccno.13589，地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號中國科學(xué)院微生物研究所。

一種單克隆抗體，由小鼠雜交瘤細(xì)胞系5b3d4分泌。

所述單克隆抗體，其免疫小鼠用的抗原是將具有序列表中seqidno.1的核苷酸序列編碼經(jīng)由大腸桿菌重組表達(dá)而獲得的重組pdpn抗原蛋白。

所述的單克隆抗體，其為小鼠igg2b亞型單克隆抗體。

所述的單克隆抗體，其可識別重組和腫瘤細(xì)胞表面的pdpn分子。

所述的單克隆抗體，其用于免疫組織化學(xué)法、免疫印跡法和酶聯(lián)吸附測定法檢測腫瘤及正常組織細(xì)胞中的pdpn表達(dá)水平。

所述的單克隆抗體，在制備免疫組化病理診斷劑上的應(yīng)用。

所述的重組pdpn抗原蛋白，該重組蛋白由優(yōu)選的具有抗原性的pdpn片段及用于重組蛋白的蛋白標(biāo)簽組成。

所述的重組pdpn抗原蛋白，pdpn片段包括第23位至第131位氨基酸的片段，用于純化的標(biāo)簽是由5至7個組氨酸組成的。

所述的單克隆抗體，是由seqidno.1所示的核苷酸序列編碼的，其中包括pdpn分子第23位至第131位氨基酸序列的片段在大腸桿菌中表達(dá)，且經(jīng)鎳柱親和純化而來。

獲得雜交瘤細(xì)胞株所分泌的抗體為一種鼠源igg2b亞型單克隆抗體。

所述的單克隆抗體，可獨立或與其他抗體組合應(yīng)用于腫瘤細(xì)胞制備物、腫瘤組織切片的免疫印跡或酶聯(lián)免疫檢測方法。

據(jù)報道正常組織中，pdpn存在于淋巴管內(nèi)皮（血管內(nèi)皮沒有）、成纖維細(xì)胞、骨細(xì)胞、濾泡樹突細(xì)胞、平滑肌和橫紋肌細(xì)胞、cajal細(xì)胞、扁桃體鱗狀上皮基底細(xì)胞、胃隱窩細(xì)胞、前列腺基底細(xì)胞、不成熟的基底細(xì)胞、胎兒生殖母細(xì)胞（但不是對應(yīng)成人睪丸細(xì)胞、腎小球足細(xì)胞、間皮（特別是反應(yīng)性）、淋巴細(xì)胞的亞群、schwann細(xì)胞、神經(jīng)膠質(zhì)和室管膜細(xì)胞。

據(jù)報道腫瘤組織中，pdpn存在于幾乎所有情況下的精原細(xì)胞瘤/無性細(xì)胞瘤（但不是精母細(xì)胞性精原細(xì)胞瘤）和浸潤前的睪丸生殖細(xì)胞瘤（原位癌或?qū)Ч軆?nèi)生殖細(xì)胞腫瘤igcn）。胚胎性癌可能是有限的胞膜反應(yīng)。pdpn在大量的上皮樣和兩相惡性間皮瘤（~90%）、腺瘤樣腫瘤和滑膜肉瘤中（上皮樣部分）中。pdpn也在幾乎所有的kaposi肉瘤，此外在血管肉瘤的一個亞群及血管母細(xì)胞瘤的泡狀細(xì)胞（分化的血管母細(xì)胞腫瘤的內(nèi)皮細(xì)胞通常都是陰性的），大多數(shù)鱗狀細(xì)胞癌（頭頸部、肺、子宮頸），成纖維細(xì)胞腫瘤，平滑肌肉瘤和胃腸道間質(zhì)腫瘤，幾乎所有的軟骨瘤（但不是脊索瘤），濾泡樹突網(wǎng)狀細(xì)胞瘤、大部分原發(fā)性腦腫瘤（星形細(xì)胞瘤、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、室管膜瘤、脈絡(luò)叢腫瘤、pnet、腦膜瘤），腺癌通常是陰性。漿液性癌中，蛋白檢出率為13-65%。胸腔積液中，腺癌pdpn陽性率達(dá)到50%。

本發(fā)明的優(yōu)點及有益效果

（1）本發(fā)明獲得的雜交瘤（5b3d4）分泌產(chǎn)生的單克隆抗體，能識別重組蛋白pdpn分子和表達(dá)pdpn的細(xì)胞，能夠檢測高表達(dá)pdpn的多種正常組織和腫瘤組織。

（2）本發(fā)明獲得的雜交瘤（5b3d4）為一種igg2b類抗體，與pdpn蛋白的結(jié)合有極強特異性和敏感性。

（3）本發(fā)明獲得的雜交瘤（5b3d4）產(chǎn)生的單克隆抗體可應(yīng)用于免疫組織化學(xué)（ihc）、免疫印記（westernblotting）、間接elisa、抗體芯片制備等檢測與篩查，特異性和靈敏度高。pdpn在各種正常組織和腫瘤組織定位良好，具有高敏感性和特異性。因此，本發(fā)明的pdpn單克隆抗體具有廣泛的應(yīng)用范圍，可顯著提高診斷的準(zhǔn)確度。

附圖說明

圖1：純化的pdpn重組抗原蛋白；m為蛋白marekr，1為空載表達(dá)產(chǎn)物，2為目的蛋白表達(dá)產(chǎn)物，3、4為表達(dá)產(chǎn)物200mm咪唑洗脫的結(jié)果，表達(dá)產(chǎn)物的大小約為24kda，使用15%sds-page凝膠。所純化的重組pdpn蛋白為可溶狀態(tài)，可以部分保天然構(gòu)象，濃度為1.7mg/ml。

圖2：5b3d4抗體的識別特性和實際應(yīng)用效果；1為分子量標(biāo)記。應(yīng)用純化的5b3d4單克隆抗體可以在免疫印跡雜交中特異地檢出pdpn重組蛋白。

圖3：以pdpn單克隆抗體對免疫組織化學(xué)芯片檢測多種正常和腫瘤組織的結(jié)果。以5b3d4單克隆抗體對甲狀腺、間皮瘤進(jìn)行染色分析，滴度為1:4000，左為對照抗體d2-40，右為本發(fā)明5b3d4抗體，染色結(jié)果顯示5b3d4能特異識別淋巴管而不識別血管，特異性良好，敏感性高，未見任何非特異染色。

具體實施方式

下面結(jié)合圖表和具體實施的方式對本發(fā)明做進(jìn)一步闡述，以使本領(lǐng)域技術(shù)人員可以更清楚地得知本發(fā)明的技術(shù)方案，并非對本發(fā)明的限制。

實施例1重組pdpn蛋白片段的制備

一、基因優(yōu)化與合成

pdpn按照uniprot數(shù)據(jù)庫中登錄號為q86yl7-1的蛋白質(zhì)序列，選擇在胞外表達(dá)的第23位至131位氨基酸的蛋白片段，直接優(yōu)化成適合在大腸桿菌transetta(de3)表達(dá)的基因片段。在pcr的過程中在基因5’和3’端分別加入ncoi和xhoi酶切位點。pcr產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離后回收，分別對回收的融合蛋白基因和用于表達(dá)的質(zhì)粒載體pet-28a進(jìn)行ncoi和xhoi酶切，再次電泳回收，以t4dna連接酶連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞transetta(de3)，挑取平板上的克隆接種，進(jìn)行菌液pcr鑒定。挑選pcr結(jié)果陽性的克隆進(jìn)行測序分析，序列完全正確的克隆使用。

二、蛋白表達(dá)和純化

按1:100的比例將單菌落培養(yǎng)的過夜菌轉(zhuǎn)接至100mllb培養(yǎng)基，加入終濃度為10μg/ml的卡那霉素，37℃振蕩培養(yǎng)至od600為0.6~0.8。加入1mmol/l的iptg，16℃震蕩培養(yǎng)過夜，收菌后超聲破碎。該重組蛋白帶有組氨酸標(biāo)簽，使用鎳柱進(jìn)行蛋白質(zhì)的親和純化。用200mm咪唑進(jìn)行洗脫后，進(jìn)行sds-page分離檢測，圖1為融合組氨酸標(biāo)簽的重組pdpn蛋白的表達(dá)和純化結(jié)果。重組pdpn蛋白濃度為1.7mg/ml，可以滿足免疫動物和抗體篩選與鑒定的要求。

實施例2雜交瘤細(xì)胞系的建立

一、免疫

將實施例1中交聯(lián)的多肽和快速佐劑（北京博奧龍公司）按說明書要求混合，免疫4-6周齡雌性balb/c小鼠（購自上海吳氏實驗動物中心），后腿小腿肌肉注射，劑量為50μg/只。第21天按照同樣放還是加強免疫1針。第35天以間接elisa（波長450nm）檢測小鼠血清中抗免疫原的多抗效價，效價最高的小鼠以腹腔注射沖擊免疫，抗原用生理鹽水混勻，劑量為50μg/只。

二、細(xì)胞融合

無菌制備免疫達(dá)標(biāo)的小鼠脾細(xì)胞懸液，與小鼠骨髓瘤細(xì)胞sp2/0（中科院上海細(xì)胞庫）以5:1比例混合，離心1500rpm，5min。棄上清后離心管放入37℃水浴中，在1分鐘內(nèi)緩慢加入1ml的peg1450（sigma公司），并攪動細(xì)胞。在溫水中靜置1min后，加入10ml無血清的rpmi-1640培養(yǎng)基，混勻，離心1000rpm，5min。棄上清后，加入10mlhat培養(yǎng)基小心的將細(xì)胞吹打起來，充分混勻后鋪到96孔板中，放入37℃5%co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

三、elisa篩選陽性雜交瘤細(xì)胞

10天后，取100μl上清用純化的融合蛋白進(jìn)行elisa篩選。選取效價高、數(shù)量少、狀態(tài)好的陽性克隆進(jìn)行亞克隆。7天后進(jìn)行第二次elisa篩選，陽性克隆轉(zhuǎn)入事先準(zhǔn)備好培養(yǎng)基（含飼養(yǎng)細(xì)胞和ht）的24孔板培養(yǎng)。五天后取100μl上清進(jìn)行第三次elisa篩選，陽性克隆逐次轉(zhuǎn)入6孔板和細(xì)胞培養(yǎng)瓶擴大培養(yǎng)并凍存。

實施例3腹水誘生法制備單克隆抗體

一、腹水制備

對數(shù)生長期細(xì)胞用無血清培養(yǎng)基洗滌并懸起，計數(shù)5×10⁵，1ml。懸浮的細(xì)胞腹腔注射事先用石蠟油致敏的小鼠。7天后開始收集腹水。取出的腹水于4℃離心4000rpm，10min。小心吸出中間的腹水收集于離心管中，4℃或-20℃保存。

二、單克隆抗體的純化

用proteing（南京金斯瑞公司）親和層析法按說明書從腹水中純化抗體。sds-page膠鑒定純度，bca法測定濃度。純化的抗體保存于-20℃。

實施例4單克隆抗體特性鑒定

一、亞類鑒定

用0.05m包被液（ph9.2）按1:1000稀釋6種不同的亞類鑒定試劑（iga、igm、igg1、igg2a、igg2b、igg3、）(sigma公司)，每孔加100μl，37℃孵育1h。棄去孔中液體，用pbs洗3次，每孔加入200μlpbsm封閉液，37℃孵育1h。傾空液體，用pbs清洗3次。每孔加入100μl雜交瘤上清，37℃孵育1h。傾空液體用pbs-t清洗3次，用pbs清洗3次。用封閉液1:8000稀釋hrp-igg酶標(biāo)二抗，每孔100μl，37℃孵育1h。傾空液體，用pbs-t清洗3次，用pbs清洗3次，拍干。每孔加100μl顯色液，37℃孵育10-20min后加入50μl終止液，在450nm波長下測定od值。結(jié)果顯示，本發(fā)明單克隆抗體為igg2b型鼠源單克隆抗體。

二、親和常數(shù)測定

包被重組pdpn蛋白，包被濃度分別為4μg/ml，1.5μg/ml，0.5μg/ml，100μl/孔，4℃包被過夜，pbs洗3次。每孔加200μl封閉液37℃封閉2h，pbs洗3次。實施例4中純化的單克隆抗體，從1:1000開始2倍梯度稀釋，37℃孵育1h，pbs-t洗3次，pbs清洗3次。用封閉液1:8000稀釋hrp-igg酶標(biāo)二抗，每孔100μl，37℃孵育1h，pbs-t洗3次，pbs清洗3次。每孔加入100μl顯色液，37℃孵育10-20min后加入50μl終止液。用酶標(biāo)儀測定波長450nm的吸光值。利用origin8.0軟件繪制擬合曲線，根據(jù)各曲線的ic50，按照下列公式計算出親和常數(shù)為2.94×10⁸l/mol。

親和常數(shù)

式中：[ab]表示抗原濃度為[ag]時ic50對應(yīng)的抗體濃度；

[ab]t表示抗原濃度為[ag]t時ic50對應(yīng)的抗體濃度；

n=[ab]/[ab]t

三、單抗反應(yīng)特異性和應(yīng)用效果

選擇重組的pdpn蛋白，用免疫印跡的方法檢測本發(fā)明的單克隆抗體的識別特異性，免疫印跡實驗過程如下：每種蛋白上樣約5-10ng，進(jìn)行15%聚丙烯酰胺凝膠電泳。按常規(guī)方法在bio-rad電轉(zhuǎn)移系統(tǒng)中將凝膠蛋白帶轉(zhuǎn)移到pvdf膜上（millipore公司）。將膜置于含5%脫脂奶粉的tbs封閉液中4℃過夜。加入單克隆抗體5b3（1:4000稀釋）37℃孵育1h。用tbs-t洗膜后，加入1:8000稀釋的羊抗鼠二抗（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司），37℃孵育1h。再次tbst洗膜，加入ecl超敏顯色液（武漢三鷹生物技術(shù)有限公司），熒光成像系統(tǒng)（bio-rad）進(jìn)行化學(xué)發(fā)光圖像的采集。

實施例5.組織芯片染色和鑒定

一.芯片制備過程

對各樣本先進(jìn)行he切片染色，以確定腫瘤部位。對腫瘤靶位點畫圈，預(yù)備打孔。制作空白受體蠟塊時，將塑料架置于模具上，將融化的石蠟（熔點在56～58℃）倒入模具，冷卻至室溫后將模具放入-20℃冰箱6min，將蠟塊從模具中取出。在組織樣品機上選擇1mm直徑的樣品針在受體蠟塊上打孔，孔深3～4mm，用另一直徑1mm的打孔針在蠟塊的標(biāo)記部位打孔采集組織芯，其長度比受體蠟塊的孔深淺0.1mm左右。將采集到的組織芯直接插入或用鑷子小心夾取插入受體蠟塊的空孔內(nèi)。如此反復(fù)直至完成全部樣品點的制備。最后用載玻片將所有組織芯按平，使組織芯片蠟塊平坦光滑。將制成的組織芯片蠟塊再放入蠟塊制作模具，放入60℃烤箱內(nèi)15min，使組織芯與受體臘塊的蠟融為一體，然后輕輕從烤箱中取出模具，讓半融狀態(tài)的石蠟在室溫條件下冷卻約30min，再放入-20℃冰箱冷凍6min后將組織芯片蠟塊從模具中取出，切片或放入4℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆谩Ｐ奁筮M(jìn)行連續(xù)切片，厚度定為4μm，將連續(xù)切片漂在涼水中,讓其自然展開，再將分開的切片轉(zhuǎn)移到45℃的溫水中展片30秒，用經(jīng)2%apes丙酮液處理過的載玻片裱貼切片，將制成的組織芯片放入60℃烤箱內(nèi)烤片2小時，取出室溫冷卻，放入-4℃冰箱保存。

二．ihc染色及分析

常規(guī)二甲苯脫蠟3次，每次6分鐘，100%、100%、95%、85%梯度乙醇中水化，每次3分鐘，最后自來水沖洗。進(jìn)行抗原修復(fù)，然后將切片放入濕盒中，pbs沖洗3×3分鐘。滴加3%h2o2孵育10分鐘，pbs沖洗3×3分鐘。甩去pbs，滴加封閉液（1%的bsa溶液）室溫孵育10分鐘。甩干切片，滴加適當(dāng)比例稀釋的一抗（首次稀釋根據(jù)抗體濃度來設(shè)計抗體的稀釋比例）室溫（25℃）孵育1小時，pbs沖洗3×3分鐘，滴加二抗室溫孵育20-30分鐘，pbs沖洗3×3分鐘，甩去pbs，用新鮮配置的dab顯色液顯色3-10分鐘。蘇木素復(fù)染25秒，pbs返藍(lán)30秒。按照85%（3分鐘）-95%（3分鐘）-100%（3分鐘）-100%（3分鐘）的酒精梯度依次脫水，最后二甲苯透明3分鐘，中性樹膠封片。

三．?dāng)?shù)據(jù)統(tǒng)計

根據(jù)各抗體在樣本點的著色情況，統(tǒng)計各指標(biāo)的著色率（著色樣本數(shù)/樣本總數(shù)），見表1。

表1

sequencelisting

<110>福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司

<120>一株分泌抗平足蛋白單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株及其應(yīng)用

<130>1

<160>1

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>327

<212>dna

<213>人工序列

<400>1

gcgagcaccggccaaccggaggatgataccgaaaccaccggactggaaggcggcgtggcg60

atgcccggtgcggaagatgatgtggtgactccgggcacctccgaagatcggtataaaagc120

ggcctgaccaccctggtggctaccagcgtgaatagcgtgaccggcattcgtattgaagat180

ctgccgaccagcgaaagcactgtgcatgcgcaggaacagagcccgagcgcgaccgcgagc240

aatgtggcgacctcgcatagcaccgaaaaagtggatggcgatacccagaccaccgtggaa300

aaagatggcttgagtaccgtaaccctg327