酶聯(lián)免疫試劑盒及制備和利用其進行胃蛋白酶檢測的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及臨床診斷技術(shù)領(lǐng)域，更具體地說，本發(fā)明涉及一種用于胃蛋白酶檢測的化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫試劑盒，可進行胃蛋白酶的含量檢測，并對咽喉反流性疾病進行無創(chuàng)診斷。
【背景技術(shù)】
[0002]咽喉反流性疾病是指胃內(nèi)容物反流至食管上括約肌以上部位，引起一系列癥狀和體征的總稱，臨床表現(xiàn)為聲音嘶啞或發(fā)音障礙、咽喉腫痛、咽喉部異物感、持續(xù)清嗓、慢性長期咳嗽、呼吸困難、喉痙攣等癥狀，以及聲帶后連合區(qū)域粘膜增生、肥厚，聲帶彌漫性充血水月中，嚴(yán)重時出現(xiàn)肉芽腫、喉室消失、聲門下狹窄等喉部體征。
[0003]咽喉反流性疾病是耳鼻咽喉頭頸外科一些疾病的源頭病因，與慢性喉炎、聲帶息肉、喉接觸性肉芽腫等喉部疾患關(guān)系密切。目前，咽喉反流性疾病的診斷一般依據(jù)癥狀和喉鏡檢查的反流癥狀指數(shù)量表以及反流體征評分量表、24小時喉咽部pH監(jiān)測和胃蛋白酶試劑盒進行診斷。量表診斷缺乏特異性，準(zhǔn)確度差；24小時喉咽部pH監(jiān)測屬于有創(chuàng)檢查，不易被患者接受；目前應(yīng)用的胃蛋白酶試劑盒檢測唾液中胃蛋白酶診斷咽喉反流，雖然是無創(chuàng)檢查，但其是傳統(tǒng)的酶聯(lián)免疫技術(shù)，靈敏度較差，且每天患者咽喉反流次數(shù)有限，唾液中的胃蛋白酶含量相對較低，只有在咽喉反流后一段時間內(nèi)的唾液中才能監(jiān)測到，漏診率高。
[0004]化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)是繼放免分析、酶免分析、熒光免疫分析和時間分辨熒光免疫分析之后發(fā)展起來的一項新的免疫測定技術(shù)。它將化學(xué)發(fā)光分析的高靈敏度與抗原抗體反應(yīng)的高特異性相結(jié)合，與目前常用的其他免疫分析法相比具有靈敏度高、特異性強、檢測時間短、測量線性范圍寬、穩(wěn)定性好，可實現(xiàn)自動化、使用簡便、安全、無放射性污染等諸多優(yōu)點，因此倍受人們的青睞，該技術(shù)已廣泛應(yīng)用于傳染性疾病、肥胖及相關(guān)疾病、內(nèi)分泌系統(tǒng)、遺傳病、腫瘤的早期診斷、動植物檢驗檢疫等眾多領(lǐng)域。
[0005]但是，目前還沒有采用化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫技術(shù)檢測胃蛋白酶的相關(guān)技術(shù)，也沒有用于胃蛋白酶檢測的化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫試劑盒。
[0006]另外，傳統(tǒng)的酶聯(lián)反應(yīng)試劑盒結(jié)構(gòu)較為簡單和單一，在進行試驗操作過程中具有一定的不便利性。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明的一個目的是解決至少上述問題和/或缺陷，并提供至少后面將說明的優(yōu)點。
[0008]本發(fā)明的另一個目的是，提供一種用于胃蛋白酶檢測的化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫試劑盒，能夠利用化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫技術(shù)對待測樣品中的胃蛋白酶進行精確的定量檢測。
[0009]本發(fā)明的另一個目的是，提供一種通過檢測口腔或咽喉分泌物中胃蛋白酶含量進行無創(chuàng)診斷咽喉反流性疾病的方法。
[0010]本發(fā)明還有一個目的是，提供一種結(jié)構(gòu)更為合理的試劑盒，能夠提高使用便利性，并有助于提高試驗檢驗的精確度。
[0011]為了實現(xiàn)根據(jù)本發(fā)明的這些目的和其它優(yōu)點，本發(fā)明提供了以下技術(shù)方案:
[0012]—種酶聯(lián)免疫試劑盒，包括:
[0013]盒體；
[0014]酶標(biāo)板，其包括多個微孔，所述微孔內(nèi)包被有胃蛋白酶單克隆抗體，所述酶標(biāo)板容置在盒體內(nèi)；
[0015]試劑瓶，其容置于盒體內(nèi)，所述試劑瓶內(nèi)分別裝有工作液、標(biāo)準(zhǔn)溶液、緩沖液、洗滌液及顯色液，其中所述工作液含有酶標(biāo)胃蛋白酶抗體。
[0016]優(yōu)選的是，所述的酶聯(lián)免疫試劑盒中，所述酶標(biāo)胃蛋白酶抗體的標(biāo)記物為辣根過氧化物酶，采用過碘酸鈉法進行標(biāo)記。
[0017]優(yōu)選的是，所述的酶聯(lián)免疫試劑盒中，所述標(biāo)準(zhǔn)溶液為梯度濃度的氯霉素系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，所述標(biāo)準(zhǔn)溶液內(nèi)氯霉素的濃度分別為Ong/ml、20ng/ml、40ng/ml、60ng/ml、80ng/ml及 lOOng/ml ；
[0018]所述顯色液的化學(xué)發(fā)光底物為魯米諾；以及
[0019]所述胃蛋白酶為人胃蛋白酶。
[0020]優(yōu)選的是，所述的酶聯(lián)免疫試劑盒中，所述盒體頂部開口，盒體的開口處設(shè)置有可抽拉的蓋體；
[0021]所述盒體內(nèi)還設(shè)置有帶有凹槽和多個豎直孔洞的卡板；
[0022]所述酶標(biāo)板水平嵌入在所述卡板的凹槽內(nèi)，所述試劑瓶分別嵌入在所述卡板的孔洞內(nèi)。
[0023]優(yōu)選的是，所述的酶聯(lián)免疫試劑盒中，
[0024]所述蓋體為透明設(shè)置；
[0025]所述蓋體與盒體的連接方式為:所述盒體開口的兩側(cè)設(shè)置有第一卡槽，所述蓋體兩側(cè)設(shè)置有與第一卡槽相匹配的凸條，使蓋體可沿所述第一卡槽滑動，以使盒體打開或合蓋;
[0026]其中，所述第一卡槽的兩端分別設(shè)置有I個限位塊；沿所述蓋體兩側(cè)凸條的外側(cè)開設(shè)有第二卡槽，所述第二卡槽內(nèi)設(shè)置有滾珠，使蓋體沿所述第一卡槽滑動時所述滾珠能夠沿所述第二卡槽同向自由滾動，并在滾珠抵達(dá)所述限位塊位置及第二卡槽端部時停止，以使所述蓋體停止滑動并得到定位；
[0027]此外，所述蓋體兩端分別設(shè)置有密封件，所述密封件與所述蓋體的兩端為90-180°可彎折連接，使密封件向下彎折90°時可貼附所述盒體兩側(cè)以將盒體密封；向上彎折時可解除盒體的密封并使蓋體進行滑動；
[0028]所述蓋體兩側(cè)沿所述第二卡槽設(shè)置有密封條。
[0029]優(yōu)選的是，所述的酶聯(lián)免疫試劑盒中，所述卡板的孔洞深度大于所述試劑瓶的高度，且所述孔洞底部設(shè)置有彈簧，所述試劑瓶底部設(shè)置有用于與彈簧相吸附的磁扣，以將試劑瓶與彈貪活動連接；
[0030]其中，所述彈簧的高度以其上放置試劑瓶后的自然狀態(tài)下，試劑瓶頂部高于所述孔洞開口邊緣0.8-1.5cm為準(zhǔn)；
[0031]此外，所述卡板的大小與所述盒體的內(nèi)部相對應(yīng)，使卡板可嵌入并固定在盒體內(nèi)；所述卡板的上表面低于所述盒體開口邊緣1.8-2.2cm ;以及
[0032]所述酶標(biāo)板上的微孔設(shè)置為48或96個，所述酶標(biāo)板上覆蓋有密封膜。
[0033]—種酶聯(lián)免疫試劑盒的制備方法，包括以下步驟:
[0034]步驟一、胃蛋白酶單克隆抗體的制備，提取人胃粘膜分泌物中的胃蛋白酶，將純化后的胃蛋白酶免疫BALB/c小鼠，通過雜交瘤融合技術(shù)制備得到所述胃蛋白酶單克隆抗體；
[0035]步驟二、酶標(biāo)板的制備，將所得胃蛋白酶單克隆抗體稀釋后，加入所述微孔中進行包被，即得所述酶標(biāo)板；
[0036]步驟三、酶標(biāo)胃蛋白酶抗體的制備，制備辣根過氧化物酶溶液，將胃蛋白酶單克隆抗體與所述辣根過氧化物酶溶液混合反應(yīng)，然后在得到的反應(yīng)液中加入NaBH4溶液后進行超濾，留取超濾截留物即得所述酶標(biāo)胃蛋白酶抗體。
[0037]優(yōu)選的是，所述的酶聯(lián)免疫試劑盒的制備方法中，
[0038]步驟一中，胃蛋白酶的提取采用離子交換層析和凝膠過濾技術(shù)；所述胃蛋白酶單克隆抗體分別通過蛋白質(zhì)親和層析技術(shù)和凝膠過濾技術(shù)進行純化，然后利用酶聯(lián)免疫技術(shù)篩選得到具有高度特異性的診斷用胃蛋白酶單克隆抗體；
[0039]步驟二中，利用所述稀釋液對胃蛋白酶單克隆抗體進行稀釋，得到單克隆抗體稀釋液，然后在3_5°C條件下將單克隆抗體稀釋液加入微孔中，放置12_24h后，利用所述洗滌液對微孔進行洗滌，然后加入封閉液，水浴加熱后再次洗滌，并依次重復(fù)2-4次后拍干，即得所述酶標(biāo)板，可將酶標(biāo)板于3_5°C保存；
[0040]步驟三中，辣根過氧化物酶