檢測多菌靈的酶聯(lián)免疫試劑盒及其應用
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明設及酶聯(lián)免疫檢測技術，具體設及一種用于檢測多菌靈的酶聯(lián)免疫試劑盒 及其應用，可定性、定量檢測煙葉中多菌靈藥物的殘留量。
【背景技術】
[0002] 我國是生產和使用化學農藥的大國，長期使用農藥對生態(tài)環(huán)境W及人體健康的危 害和影響已經引起人們的高度關注。多菌靈[carbendazim，N-(2-苯并化挫基）氨基甲酸 甲醋]為苯并化挫類，是一種良好的廣譜、內吸性殺菌劑，對子囊菌、擔子菌W及半知菌類 中的大多數(shù)病原菌都有效，廣泛應用于農作物W及中草藥的病害防治工作中。多菌靈化學 性質穩(wěn)定，能被植物的種子、根和葉吸收，殘效期較長，對人、畜均有一定毒性，可引起抽搖、 精神恍惚、惡屯、嘔吐、胸悶、頭暈等中毒癥狀。因此，有關多菌靈殘留量的分析已經越來越受 到重視。
[0003] 由于多菌靈在農作物病害的防治方面有著廣泛的應用，但其對人體又有一定的毒 害性，目前世界許多國家都制定了多菌靈在不同種（類）農副產品中殘留量的最高限量標 準。加拿大國家標準規(guī)定黃瓜、西葫蘆等蔬菜中多菌靈殘留量每公斤不得超過0.5mg;馬 來西亞規(guī)定蔬菜類中多菌靈殘留量每公斤不得超過1mg;我國衛(wèi)生標準GB14870294中規(guī) 定蔬菜、水果中多菌靈殘留量每公斤不得超過0.5mg。但目前尚無簡單、快捷的檢測方法。

【發(fā)明內容】

[0004] 本發(fā)明的目的正是針對上述現(xiàn)有技術狀況而提供一種能夠檢測煙葉中多菌靈藥 物殘留量的酶聯(lián)免疫試劑盒，并提供一種高效、準確、簡便、適于大批量樣品篩選的定性、定 量檢測方法，應用本發(fā)明的酶聯(lián)免疫法測定煙葉中多菌靈藥物的殘留量，具有檢測限低、特 異性強、操作簡便、檢測速度快、檢測成本低，非常容易推廣等優(yōu)點。 陽〇化]本發(fā)明的目的是通過W下技術方案來實現(xiàn)的：本發(fā)明的試劑盒包括：包被有包被 原的酶標板、多菌靈標準品溶液、多菌靈抗體、酶標二抗、底物顯色液、終止液、洗涂液、復溶 液，所述包被原為多菌靈偶聯(lián)抗原，所述酶標二抗為酶標記的多菌靈抗抗體，所述多菌靈偶 聯(lián)抗原是由多菌靈半抗原與載體蛋白偶聯(lián)得到，所述多菌靈半抗原是由多菌靈和Ξ氣乙酸 酢、硝酸錠反應得到。
[0006] 所述載體蛋白可為甲狀腺蛋白、牛血清白蛋白、兔血清蛋白、人血清蛋白、卵清蛋 白、血藍蛋白。
[0007] 所述多菌靈半抗原分子結構式為：
[0008] 所述多菌靈抗體是W多菌靈偶聯(lián)抗原作為免疫原制備獲得，所述多菌靈抗體為多 菌靈單克隆抗體或多菌靈多克隆抗體，其中優(yōu)選多菌靈單克隆抗體。
[0009] 所述酶標二抗的標記酶為辣根過氧化物酶或細菌提取堿性憐酸醋酶，其中優(yōu)選辣 根過氧化物酶；酶標二抗是由酶和多菌靈抗抗體偶聯(lián)得到的。
[0010] 為了更方便現(xiàn)場監(jiān)控和大量樣本篩查，所述試劑盒還包括多菌靈標準品溶液、底 物顯色液、終止液、洗涂液、復溶液。
[0011] 所述多菌靈標準品溶液6瓶，濃度分別為0μκ/1、0. 1μκΑ，0.3μκΑ，0.9μκΑ， 2. 7μg/L，8. 1μg/L。
[0012] 當標記酶為辣根過氧化物酶時，所述底物顯色液由底物液A液和底物液Β液組成， A為過氧化氨或過氧化脈，Β液為鄰苯二胺或四甲基聯(lián)苯胺，所述終止液為1~2mol/L的硫 酸溶液或鹽酸緩沖液；當標記酶為細菌提取堿性憐酸醋酶時，所述底物顯色液為對硝基憐 酸鹽緩沖液，所述終止液為1~2mol/L氨氧化鋼溶液。
[0013] 所述洗涂液優(yōu)選為抑值為7. 4,含有0. 5%~1. 0%吐溫-20、0. 01%〇~0. 03%〇疊氮化 鋼防腐劑、0. 1~0. 3mol/L的憐酸鹽緩沖液，其中的百分比為重量體積百分比，單位g/mL。
[0014] 所述復溶液優(yōu)選為抑值為7. 0、0. 02mol/L的憐酸鹽緩沖液。
[0015] 其中在酶標板制備過程中所用到的包被緩沖液為抑值為9. 6,0. 05mol/L的碳酸 鹽緩沖液，封閉液為抑值為7. 1~7. 5,含有1%~3% (g/mL)酪蛋白、0. 1~0. 3mol/L的憐酸鹽 緩沖液。
[0016] 本發(fā)明中酶標板的制備過程為：用包被緩沖液將包被原稀釋成20μg/mU每孔加 入100μL25°C避光解育2h或4°C過夜，傾去孔中液體，用洗涂液洗涂2次，每次30S，拍 干，然后在每孔中加入150~200μL封閉液，25°C避光解育1~2h，傾去孔內液體拍干，干燥 后用侶膜真空密封保存。
[0017] 本發(fā)明的檢測原理為： 本試劑盒采用直接競爭化ISA方法，在酶標板微孔條上預包被偶聯(lián)抗原，樣本中殘留 的多菌靈和酶標板微孔條上預包被的偶聯(lián)抗原競爭抗多菌靈的酶標二抗，用TMB底物顯 色，樣本吸光度值與其所含殘留物多菌靈的含量成負相關，與標準曲線比較，再乘W其對應 的稀釋倍數(shù)，即可得出樣本中多菌靈的殘留量。
[0018] 本發(fā)明還提供了一種應用上述酶聯(lián)免疫試劑盒檢測多菌靈的方法，它包括步驟： (1) 樣品前處理； (2) 用試劑盒進行檢測； (3) 分析檢測結果。
[0019] 本發(fā)明檢測多菌靈的酶聯(lián)免疫試劑盒主要采用ELISA方法定性或定量檢測樣品 中多菌靈的含量；對樣品的前處理要求低，樣品前處理過程簡單，能同時快速檢測大批量樣 品；主要試劑W工作液的形式提供，檢驗方法方便易行，具有檢測限低、特異性高、操作簡 便、靈敏度高、精確度高、準確度高等特點。本發(fā)明的酶聯(lián)免疫試劑盒，結構簡單、使用方便、 價格便宜、攜帶便利、檢測方法高效、準確、簡便、適于大批量樣品篩選的定性、定量。
【附圖說明】
[0020] 圖1 :多菌靈半抗原合成路線圖， 圖2 :試劑盒柄；準曲線圖。
【具體實施方式】
[0021] 下面結合具體的實施例來進一步闡述本發(fā)明。應理解，運些實施例僅用于說明本 發(fā)明，而不用來限制本發(fā)明的范圍。
[0022] 實施例1試劑盒組分的制備 1、多菌靈半抗原的制備 多菌靈原料藥經硝化反應，在苯環(huán)上引入硝基，經還原后得到帶有芳香胺的半抗原產 物。 陽02引 Ξ氣乙酸20血加立氣乙酸酢2血，冰水浴，降至0°C，加硝酸錠0. 5g，攬拌1h， 加入含多菌靈1.0g的Ξ氣乙酸溶液，繼續(xù)攬拌，反應2h。停止反應，就稀氨氧化鋼溶液 中和到中性，二氯甲燒萃取，水洗，蒸干，乙酸洗涂結晶，得到化合物a0.76g，收率67%。1H NMR(CDC13,300M監(jiān)）δ: 8. 31 (1H,dd,片1.616，tl.239), 7. 69 ( 1H,dd,t8. 716， J=1.616), 7.64 (IH,dd,t8. 716，J=l. 239)，3.85 (3H，s)。
[0024]化合物a0. 7g加乙醇溶解，加0. 43g氯化錫水溶液10mL，通入氮氣，加入回流 反應3h。停止反應，旋蒸除去乙醇，加乙酸乙醋萃取，濃縮上硅膠柱，石油酸/乙酸乙醋（1 : l，v/v)洗脫分離，得到半抗原化合物b產物0. 54g，收率，83%。1HNMR(CDC13,300M監(jiān)） δ:3.79 (3H,s),6. 27 (2H,s), 6.90 (IH,dd,J=2. 225,J=1.850), 6.46 (IH,dd, t8. 422，J=2. 225),7.：M(IH,dd,t8. 422，J=l. 850)，5.00(1?s), 9.15(1?s)。
[00巧]圖譜中化學位移5=6.27的為苯環(huán)上芳香胺的共振吸收峰，該吸收峰的存在證 明，半抗原合成成功。 陽0%] 2、抗原的制備 免疫原制備一一多菌靈半抗原與牛血清白蛋白（BSA)偶聯(lián)得到免疫原。
[0027] 稱取BSA50mg，使之充分溶解在3. 8血0.1M的憐酸鹽緩沖液PBS(PH7. 2)中， 得到溶液A;取30mg碳化二亞胺（EDC)和N-徑基班巧酷亞胺（畑S)用0. 2血水充分溶解 后于加入溶液A中，室溫下攬拌30min。取15mg半抗原，溶解于1血N，N-二甲基甲酯胺 (DMF)中，然后緩慢加入到蛋白溶解中，室溫攬拌反應24h。用0.01mol/LPBS4°C透析3 d每天換3次透析液。分裝，于-20°C保存?zhèn)溆谩?br>[0028] 多菌靈半抗原與血藍蛋白偶聯(lián)得到免疫原。
[0029] 稱取血藍蛋白50mg，使之充分溶解在3. 8血0.1M的憐酸鹽緩沖液PBS(PH7. 2) 中，得到溶液A;取30mg碳化二亞胺（邸C)和N-徑基班巧酷亞胺（畑S)用0. 2血水充分 溶解后于加入溶液A中，室溫下攬拌30min。取5mg半抗原，溶解于1血N，N-二甲基甲 酷胺（DMF)中，然后緩慢加入到蛋白溶解中，室溫攬拌反應24h。用0.01mol/LPBS4°C 透析3d每天換3次透析液。分裝，于-20°C保存?zhèn)溆谩?br>[0030] 多菌靈半抗原與甲狀腺蛋白偶聯(lián)得到免疫原。
[0031] 稱取甲狀腺蛋白50mg，使之充分溶解在3. 8血0.1M的憐酸鹽緩沖液PBS(PH 7. 2)中，得到溶液A;取30mg碳化二亞胺（EDC)和N-徑基班巧酷亞胺（NHS)用0. 2血水 充分溶解后于加入溶液A中，室溫下攬拌30min。取3mg半抗原，溶解于1血N，N-二甲 基甲酯胺（DMF)中，然后緩慢加入到蛋白溶解中，室溫攬拌反應24h。用0.01mol/LPBS 4°C透析3d每天換3次透析液。分裝，于-20°C保存?zhèn)溆谩?br>[0032] 包被原制備一一多菌靈半抗原與卵清蛋白（OVA)偶聯(lián)得到包被原。 陽03引稱取OVA50mg，使之充分溶解在3. 8血0.1MPBS(PH7. 2)中，得到溶液B;取 30mgEDC和N服用0. 2血水充分溶解后于加入溶液B中，室溫下攬拌30min。取13mg半 抗原，溶解于ImLDMF中，然后緩慢加入到蛋白溶解中，室溫攬拌反應24h。用0.01mol/ LPBS4°C透析3d每天換3次透析液。分裝，于-20°C保存?zhèn)溆谩?br>[0034] 多菌靈半抗原與人血清白蛋白偶聯(lián)得到包被原。 陽03引稱取人血清白蛋白50m