一種利用高效液相色譜分析木聚糖水解液的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及木聚糖，尤其是涉及用于多糖水解液中單糖和寡糖的快速分析的一種 利用高效液相色譜分析木聚糖水解液的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 木質(zhì)纖維素生物質(zhì)主要由纖維素、半纖維素和木質(zhì)素組成。纖維素是由D-葡萄糖 基以β_1，4糖苷鍵連接而成的均一聚糖，其主要水解產(chǎn)物為纖維二糖和葡萄糖。半纖維素 結(jié)構(gòu)較為復雜，一般主要成分為以D-木糖為主鏈、多種糖基為側(cè)鏈的木聚糖，組成木聚糖 的主要糖基有：D-木糖、L-阿拉伯糖、D-葡萄糖、D-甘露糖、D-半乳糖、L-鼠李糖、4-0-甲 基葡萄糖醛酸和半乳糖醛酸。木質(zhì)纖維素生物質(zhì)中木聚糖可以通過酸催化或者酶水解選擇 性轉(zhuǎn)化為木糖或者低聚木糖。低聚木糖由于其獨特的生理功能，已于2008年被中國衛(wèi)生部 批準為新資源食品（衛(wèi)生部，2008)。利用富含木聚糖的木質(zhì)纖維素生物質(zhì)生產(chǎn)木糖或者低 聚木糖具有巨大市場前景。目前，對于復雜的木質(zhì)纖維素生物質(zhì)水解產(chǎn)物，特別是低聚木糖 尚缺乏快速、靈敏和高效的分析方法。常用的糖類化合物分析檢測方法有：高效液相色譜 法（HPLC)、氣相色譜法（GC)和離子色譜法（HPAEC)。糖類物質(zhì)缺少紫外吸收，利用高效液 相色譜法檢測糖類物質(zhì)通常要配備示差檢測器（RID)。HPLC-RID對糖的檢測靈敏度較低 并且對低聚木糖分離效果不佳。由于糖類化合物較難揮發(fā)，利用GC檢測糖類只能采用間 接的方法，一般是通過將糖進行糖醇衍生化變成易揮發(fā)性化合物，再進行檢測。利用GC檢 測時，糖的衍生化步驟繁瑣，并且大多數(shù)情況下只用于單糖的檢測，少有檢測寡糖的報道。 HPAEC-PAD已經(jīng)廣泛應用于各種單糖和寡糖的分析，但由于其洗脫液中含有高濃度的鹽，限 制了其與質(zhì)譜的聯(lián)用。僅用HPLC-RID或者HPAEC-PAD分析，無法對復雜的木聚糖水解液中 缺乏商業(yè)化標準品的糖類進行定性分析。1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（PMP)能顯著提高 糖的離子化程度和檢測的靈敏度。PMP柱前衍生化HPLC分析方法由于其具有較高的靈敏度 和分離效率，已經(jīng)被廣泛應用于單糖的分析，在已有的報道中，一般采用中性或偏酸性的流 動相來進行分析，其流動相一般pH < 8. 0。該方法在流動相pH多8. 1用于同時分析木質(zhì)纖 維素生物質(zhì)中的單糖和寡糖尚無報道。研究結(jié)果表明，流動相PH顯著影響PMP衍生化糖類 化合物的分離，調(diào)整流動相的pH多8. 1，各類單糖和寡糖的PMP衍生物的分離度可以有效提 尚。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明的目的在于提供以1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（PMP)為衍生化試劑，采 用堿性流動相（pH彡8. 1)、紫外檢測器和C-18色譜柱，建立PMP柱前衍生化的一種利用高 效液相色譜分析木聚糖水解液的方法。
[0004] 本發(fā)明包括以下步驟：
[0005] 1)取配制好的糖標準品溶液或生物質(zhì)水解液加到NaOH溶液中，再加入PMP甲醇 溶液，反應后取出冷卻至室溫，用HCl中和，然后用氯仿萃取，漩渦震蕩后除去有機溶劑，離 心，取上清液稀釋檢測；
[0006] 2)采用C18反相色譜柱進行HPLC檢測，當衍生物通過檢測器時獲得峰面積響應 值，即可實現(xiàn)定性分析；
[0007] 3)若需定量分析，將糖標準品溶液逐級稀釋1~30倍，依次進樣，根據(jù)步驟2)測 定的峰面積響應值對相應標準糖的進樣濃度進行線性回歸，建立回歸方程y = ax+b，表征 峰面積響應值y與糖的進樣濃度X之間的關(guān)系，從而根據(jù)峰面積響應值可以判斷未知樣品 中的糖濃度。再計算當信噪比為2~5時所對應的標準溶液的濃度以確定最低檢測限。
[0008] 在步驟1)中，所述配制好的糖標準品溶液或生物質(zhì)水解液、NaOH溶液、PMP甲醇 溶液、HC1、氯仿的體積比可為（1~1000) yL : (1~1000) yL : (1~1000) yL : (1~ 1000) μ L : 0. 1~5. OmL，所述NaOH溶液的摩爾濃度可為0. 1~10mol/L，所述PMP甲醇溶 液的摩爾濃度可為〇· 1~l〇mol/L，所述HCl的摩爾濃度可為0· 1~10mol/L ;所述反應的 溫度可為30~100°C，反應的時間可為5~150min ;所述離心可在2000~20000rpm下離 心0· 5~15min ;所述稀釋可稀釋1~100倍。
[0009] 在步驟2)中，所述C18反相色譜柱內(nèi)涂有18烷基碳鏈的反相固定相，含碳量 5 %~11 %，直徑L 0~4. 0臟，粒度1~8 μ m ;所述HPLC檢測的流速可為0· 1~2. OmL/ min ;流動相A可為磷酸緩沖液，pH多8. 1，磷酸緩沖液的摩爾濃度可為0. 01~1.0 Omol/ L ;流動相B為乙腈，采用等度洗脫，流動相A :流動相B = (4~0. 5) : 1 ;紫外檢測波長， 230 ~270nm〇
[0010] 本發(fā)明的檢測對象包括但不限于木聚糖水解液、商品功能性保健糖等。
[0011] 本發(fā)明利用PMP對木聚糖水解液中的單糖和寡糖進行衍生化，通過優(yōu)化高效液相 色譜分離條件，首次在堿性流動相（pH多8. 1)條件下實現(xiàn)了多種單糖（甘露糖、鼠李糖、葡 萄糖、木糖和阿拉伯糖）和寡糖（纖維二糖、木二糖、木三糖、木四糖、木五糖和木六糖）的 分析。本發(fā)明具有如下的有益效果：
[0012] (1)采用的設備相對便宜（相對于離子色譜）。
[0013] (2)采用的設備配件相對便宜（相對于糖分析柱和示差檢測器），降低了分析成 本。
[0014] (3)操作簡單、反應條件溫和，既可定性分析，也可定量分析，可以與質(zhì)譜聯(lián)用，具 有良好的市場應用前景，為木質(zhì)纖維素生物質(zhì)轉(zhuǎn)化為燃料和化學品過程的研究奠定基礎。
[0015] 此外，基于PMP衍生化的HPLC方法能高效分析多種生物質(zhì)水解液實際樣品中的單 糖和寡糖。該方法在利用木質(zhì)纖維素生物質(zhì)生產(chǎn)燃料和高附加值化學品中具有廣闊的應用 前景。
[0016] 本發(fā)明建立了 PMP柱前衍生化的HPLC分析木質(zhì)纖維素生物質(zhì)中單糖和寡糖方法， 為木質(zhì)纖維素生物質(zhì)轉(zhuǎn)化為燃料和化學品過程的研究奠定基礎。
【附圖說明】
[0017] 圖1為定性分析含有甘露糖、鼠李糖、纖維二糖、葡萄糖、木糖和阿拉伯糖的木聚 糖硫酸水解液。在圖1中，圖a為標準品，圖b為木聚糖硫酸水解液。
[0018] 圖2為定性分析低聚木糖標準品和芒草的木聚糖酶水解產(chǎn)物。在圖2中，圖a為 低聚木糖標準品，圖b為芒草的木聚糖酶水解產(chǎn)物。
【具體實施方式】
[0019] 以下通過實施例將結(jié)合附圖對本發(fā)明作進一步的說明。
[0020] 實施例1 :
[0021 ] 本實施例定性分析含有甘露糖、鼠李糖、纖維二糖、葡萄糖、木糖和阿拉伯糖的木 聚糖硫酸水解液混合物（已中和至中性），具體過程如下所示：
[0022] 步驟1.取上述糖的標準品和混合有上述糖的木聚糖硫酸水解液100 μ L，分別加 至Ij 100 μ L 0. 3mol/L NaOH溶液中，再加入100 μ L的PMP甲醇溶液（0. 5mol/L)，混合均勻 后，在70°C下反應30min后取出冷卻至室溫，用IOOyL 0.3mol/L HCl進行中和。然后用 ImL氯仿進行萃取，漩渦震蕩后除去有機溶劑，重復三次，離心（12000rpm，5min)，取上清液 稀釋到一定倍數(shù)進行檢測。
[0023] 步驟 2. HPLC 檢測條件：色譜柱（CAPCELL PAK C1SMG，3. Omm i. d. X 250mm，5 μ m); 流速0. 4mL/min ;流動相A為磷酸緩沖液（0. 04mol/L，pH 8. 5)，流動相B為乙腈，采用等度 洗脫（A : B = 4 : 1);紫外檢測波長，245nm。
[0024] 如圖1所示，上述分離條件下，PMP試劑比所有的PMP衍生物保留時間都短，不會 對PMP衍生物的分離和分析產(chǎn)生任何干擾。a為標準品，b為木聚糖酸水解液，可以看到，水 解液的主要成分為木糖和阿拉伯糖，同時存在少量的甘露糖和鼠李糖。本發(fā)明相對于以往 報道的