氟苯尼考快速檢測試劑盒及其制備、使用方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及抗生素檢測技術(shù)的改進(jìn)，具體涉及氟苯尼考快速檢測試劑盒及其制 備、使用方法，屬于免疫學(xué)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 氟苯尼考（Florfenico,FF)中文名稱：氟洛芬、氟甲砜霉素，化學(xué)名 稱：d(+)-蘇-1-對甲基苯基_2_二氯乙酰氨基_3_氣丙醇，是二十世紀(jì)八十年代后期由美 國Schering-Plough研制成功的一種獸類專用氯霉素類的廣譜抗菌藥，是第三代氯霉素類 抗生素，該藥1990年首次在日本上市，作為新氯霉素的替代品，主要抑制50s亞基的結(jié)合從 而抑制細(xì)菌肽酰基轉(zhuǎn)氨酶的活性，是新型抗革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌及甲砜霉素耐藥 菌的廣譜抗生素，可用于治療豬、牛、禽及水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物的細(xì)菌性疾病。
[0003] 氯霉素（Chloramphenicol,CAP)作為第一代氯霉素類抗生素，其結(jié)構(gòu)上的-N02基 團(tuán)與抑制造血功能有關(guān)，因此CAP具有脊髓造血功能抑制毒性，可引起可逆性的血細(xì)胞減 少，引發(fā)不可逆再生障礙性貧血的幾率為1:30000。FF用-CH3S02基團(tuán)取代了 -N02基團(tuán)， 無潛在再生障礙性貧血危險(xiǎn)。同時(shí)，F(xiàn)F對耐氯霉素和甲砜霉素（Thiamphenicol，TAP)的耐 藥菌株仍有抗菌作用。氟苯尼考作為靶向藥物來發(fā)揮生物效應(yīng)，用藥劑量小，見效快，半衰 期延長，血藥濃度高，可長時(shí)間維持血藥，廣泛用于動(dòng)物疾病的預(yù)防和控制。2000年我國批 準(zhǔn)氟苯尼考為國家二類新獸藥，在水產(chǎn)養(yǎng)殖上可用于治療鰻麵愛德華氏病和赤鰭病。
[0004] 在動(dòng)物體內(nèi)FF代謝較快，主要代謝產(chǎn)物為氟苯尼考草氨酸、氟苯尼考胺 (Florenicolamine,FFA)、氟苯尼考醇等，但是FFA是大部分可食動(dòng)物組織中最主要的代謝 產(chǎn)物，因此FFA被作為休藥期計(jì)算的標(biāo)志殘留物。雖然郭桂芳等認(rèn)為FF注射液無明顯的急 性毒性和亞慢性毒性，但是有研究表明高劑量的FF可以小鼠胸腺、脾臟的重量降低，國外 的研究也表明FF可以抑制小鼠的體液免疫和細(xì)胞免疫，這郭桂芳得出的結(jié)論相互印證，表 明FF具有較強(qiáng)的免疫毒性。FF在養(yǎng)殖業(yè)中的大量應(yīng)用會(huì)導(dǎo)其在動(dòng)物性食品中的殘留，為了 保障公眾健康，我國對動(dòng)物組織中氟苯尼考的最大殘留量做了規(guī)定，要求的肌肉殘留限量 為200yg/Kg、肝臟殘留限量為3000yg/Kg、腎臟殘留限量為300yg/Kg。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明針對氟苯尼考?xì)埩舻默F(xiàn)狀，以及其對人體的危害，設(shè)計(jì)發(fā)明提供一種能夠 快速、簡便、準(zhǔn)確、現(xiàn)場檢測氟苯尼考和其代謝產(chǎn)物氟苯尼考胺的檢測試劑盒及其制備、使 用方法。
[0006] 本發(fā)明的技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)如下
[0007] 氟苯尼考快速檢測試劑盒，其特殊之處在于包括自下而上排列的支撐體5、用于快 速吸收檢測試劑的吸水層3、由硝酸纖維素膜制成的檢測層2、帶通孔1的蓋板4 ;保藏號(hào) 為：CCTCC一C201575雜交瘤細(xì)胞FFA-C所分泌的、膠體金標(biāo)記的抗氟苯尼考胺單克隆抗體 C(簡稱：金標(biāo)單抗C);A液：含 1-5%PEG20000、0. 05-0. 25%吐溫-20 的 0. 01mol/L磷酸鹽 緩沖液（PBS) ;B液：含0. 01-0. 25%吐溫-20的0.Olmol/L磷酸鹽緩沖液（PBS);
[0008] 所述金標(biāo)單抗C是由堿水解法制備氟苯尼考胺（FFA)半抗原與牛血清白蛋白 (BSA)通過戊二醛法偶聯(lián)合成氟苯尼考胺-牛血清白蛋白（FFA-BSA)完全抗原，將其作為免 疫原而制備的抗氟苯尼考胺單克隆抗體，經(jīng)膠體金標(biāo)記后而致；
[0009] 所述的膠體金標(biāo)記的單克隆抗體C的制備步驟如下：
[0010] 1、以公知的膠體金的制備工藝制備膠體金溶液，制得的膠體金的顆粒大小為 l〇-20nm；
[0011] 2、將單克隆抗體C(0. 5-lg/L抗體蛋白），按150-500y1加入到上述的100ml膠體 金溶液中，慢攪混勻；
[0012] 3、向混合溶液中加入PEG20000,使其終濃度為1-5%，靜置過夜；
[0013] 4、將其離心8000-10000轉(zhuǎn)/分，1-1. 5小時(shí)，棄上清；
[0014] 5、取離心沉淀，用含有1-5%?￡620000、0.05-0.25%吐溫-20、0.02%疊氮化鈉的 0. 01mol/L磷酸鹽緩沖液懸起，制成金標(biāo)單抗C;
[0015] 所述磷酸鹽緩沖液的PH值為7. 4,其中含有KCI0? 2g、NaCI8. 0g、KH2P040 . 2g、 Na2HP0412H20 2. 9g、蒸餾水 1000ml;
[0016] 所述步驟2中單克隆抗體C與膠體金溶液慢攪混勾30-60min。
[0017] 氟苯尼考快速檢測試劑盒的使用方法，其特殊之處在于包括以下步驟：
[0018] 1、取待測溶液5y1，點(diǎn)在蓋板4的通孔1中的硝酸纖維素膜上，晾干；
[0019] 2、在其上加含 1-5%PEG20000、0.05-0.25 % 吐溫-20 的 0.01mol/LPBS的A液 100y1滲入，進(jìn)行封閉；
[0020] 3、加入100y1金標(biāo)單抗C，滲入；
[0021] 4、加入含 0? 05-0. 25%吐溫-20 的 0?Olmol/LPBS的B液 100y1 滲入；
[0022] 5、結(jié)果顯示：硝酸纖維素膜上出現(xiàn)紅色斑點(diǎn)為陽性，表示檢測到有氟苯尼考或者 氟苯尼考胺殘留；無紅色斑點(diǎn)為陰性，表示檢測不到氟苯尼考或者氟苯尼考胺，或者是兩者 濃度低于l〇ug/ml。
[0023] 本發(fā)明氟苯尼考快速檢測試劑盒檢測原理：
[0024] 將待測樣品滴加到硝酸纖維素膜上晾干固定，加封閉液A液封閉之后滴加金標(biāo)單 抗C，金標(biāo)單抗C特異性和氟苯尼考或氟苯尼考胺進(jìn)行結(jié)合，加洗液B液清洗之后，洗去未結(jié) 合的金標(biāo)抗體，利用膠體金紅色顆粒顯色原理呈現(xiàn)檢測結(jié)果，在檢測層硝酸纖維素膜上呈 現(xiàn)紅色斑點(diǎn)，表示有氟苯尼考或是氟苯尼考胺殘留；無紅色斑點(diǎn)，表示無氟苯尼考或是氟苯 尼考胺或殘留量極低。
[0025] 本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)：
[0026] 1、本發(fā)明的氟苯尼考快速檢測試劑盒，從實(shí)際的養(yǎng)殖需要出發(fā)，將藥物殘留的檢 測搬到的養(yǎng)殖現(xiàn)場，使用時(shí)無需專門設(shè)施和操作技術(shù)，適合普通養(yǎng)殖戶養(yǎng)殖現(xiàn)場檢測，應(yīng)用 簡單。2、具有檢測快速、簡便、準(zhǔn)確、靈敏等特點(diǎn)，并具有較高的穩(wěn)定性，在5-10min之內(nèi)便 可顯示檢測結(jié)果，一旦檢出超標(biāo)可以將養(yǎng)殖動(dòng)物多養(yǎng)一段時(shí)間，讓藥物代謝直至殘留低于 國家標(biāo)準(zhǔn)，可以安全上市，這是最方便的一種解決藥殘問題的方法，減少了因藥物殘留對人 體的傷害和養(yǎng)殖戶因藥殘超標(biāo)被退貨造成巨大的損失，并改善因藥殘留送檢麻煩，周期長， 收費(fèi)高等原因造成99%以上養(yǎng)殖戶在養(yǎng)殖動(dòng)物上市前是不送檢藥殘留的情況。3、在整個(gè)膠 體金標(biāo)記和試劑盒使用過程中起到防止非特異結(jié)合和起到封閉作用的牛血清白蛋白，均以 適當(dāng)濃度的、分子量為20000的PEG所代替，這樣可杜絕因牛血清白蛋白而致的交叉反應(yīng)， 進(jìn)一步保證了試劑盒的特異性（因?yàn)閱慰寺】贵w制備中免疫原是有牛血清白蛋白為載體 蛋白的）。
【附圖說明】
[0027] 圖1 :本發(fā)明氟苯尼考快速檢測試劑盒的結(jié)構(gòu)示意圖；
[0028] 圖2 :FFA-BSA的紫外特征圖譜；
[0029] 圖3 :FFA的紫外特征圖譜；
[0030] 圖4 :BSA的紫外特征圖譜；
[0031] 圖5 :FFA-BSA、BSA、FFA三組圖譜擬合后的紫外特征圖譜；
[0032] 圖6 :0VA的紫外特征圖譜；
[0033] 圖7 :FFA-〇VA的紫外特征圖譜；
[0034] 圖8 :FFA的紫外特征圖譜；
[0035] 圖9 :FFA-〇VA，OVA，F(xiàn)FA三組圖譜擬合后的紫外特征圖譜。
[0036] 雜交瘤細(xì)胞株FFA-C，其保藏編號(hào)為：CCTCC一C201575 ;保藏單位全稱及簡稱： 中國典型培養(yǎng)物保藏中心（CCTCC);保藏單位地址：湖北省武漢市武昌珞珈山武漢大學(xué)保 藏中心；保藏日期：2015年5月21日。
【具體實(shí)施方式】
[0037] 本發(fā)明的實(shí)施例結(jié)合附圖進(jìn)一步描述如下：
[0038] 實(shí)施例1
[0039] 氟苯尼考胺的合成：按照摩爾比為1:1，稱取FF10. 74g，氫氧化鈉2. 56g，加入35ml 蒸餾水溶解，加熱攪拌至完全溶解，此時(shí)溶液為酒紅色澄清，再加入6. 0g氯化鈉，攪拌至完 全溶解，冷卻后用薄層層析板層析混合液，用碘熏蒸顯色，測得Rf?(原點(diǎn)到斑點(diǎn)中心的距離 與原點(diǎn)到溶劑前沿的距離的比值）值與FF不同，證明有FFA生成，將溶液室溫放置過夜，用 濾紙過濾、蒸餾水洗滌至流出液體為無色、干燥之后的FFA半抗原，合成路線如下所示：
[0040]
[0041] 實(shí)施例2
[0042] 氟苯尼考胺完全抗原的制備：稱取25mg氟苯尼考胺溶于2mLN，N-二甲基甲酰胺 (DMF)中；稱量66mgBSA溶解于10mlPH7. 4的PBS緩沖液中；將氟苯尼考胺逐滴加入到上述 BSA溶液中，4°C條件下攪拌，然后逐滴加入100yL戊二醛于