/MWCNTs的腸癌腫瘤標(biāo)志物免疫傳感器的制備方法及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種基于Pd/V205/MWCNTs的腸癌腫瘤標(biāo)志物免疫傳感器的制備方法及應(yīng)用。具體是采用Pd/V205/MWCNTs作為檢測(cè)抗體標(biāo)記物，制備一種檢測(cè)腸癌腫瘤標(biāo)志物的夾心型電化學(xué)免疫傳感器，屬于新型功能材料、免疫分析以及生物傳感檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]腸癌是是胃腸道中常見(jiàn)的惡性腫瘤，其發(fā)病率和死亡率近年來(lái)明顯上升。腸癌的早期診斷可以大大提高治愈率，提高患者的生存質(zhì)量，在臨床研究上，發(fā)展快速、簡(jiǎn)便、靈敏的檢測(cè)腸癌腫瘤標(biāo)志物方法是十分重要的。
[0003]目前已有的癌癥標(biāo)志物的臨床檢測(cè)方法很多，如放射免疫分析法、免疫放射分析法、酶標(biāo)記免疫分析法、化學(xué)免疫發(fā)光分析法、時(shí)間分辨熒光免疫分析法等，但多數(shù)檢測(cè)方法繁瑣，操作復(fù)雜，費(fèi)用昂貴，檢出限高，因此，建立一種快速、簡(jiǎn)便、靈敏的檢測(cè)方法具有重要意義。
[0004]免疫傳感器是將免疫學(xué)方法與分析化學(xué)方法相結(jié)合的一種生物傳感器，通過(guò)抗原與抗體之間的特異性結(jié)合，使得它具有靈敏度高、選擇性好、結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、操作簡(jiǎn)便、易于小型化、可連續(xù)、快速自動(dòng)化檢測(cè)分析等優(yōu)點(diǎn)，因此本發(fā)明制備了一種應(yīng)用二氧化錫摻雜的石墨烯、金納米粒子作為基底材料和以Pd/V205/MWCNTs為標(biāo)記物的腸癌免疫傳感器，實(shí)現(xiàn)了對(duì)腸癌腫瘤標(biāo)志物的檢測(cè)。
[0005]而構(gòu)建電化學(xué)免疫傳感器的關(guān)鍵有兩點(diǎn):其一是采用簡(jiǎn)單、快速、有效的方法將抗原抗體等生物分子固定在電極表面；其二是開(kāi)發(fā)傳感器的信號(hào)放大技術(shù)。
[0006]一■氧化錫慘雜的石墨稀具有良好的導(dǎo)電性能，金納米粒子、Pd及V2O5具有良好的催化性能，MffCNTs以其大的比表面積能夠很好的固載抗體，能夠加速電子傳遞，對(duì)于提高傳感器靈敏度具有重要作用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明的目的之一是基于Pd/V205/MWCNTs作為檢測(cè)抗體標(biāo)記物，構(gòu)建了一種快速超靈敏的夾心型電化學(xué)免疫傳感器。
[0008]本發(fā)明的目的之二是將該夾心型電化學(xué)免疫傳感器應(yīng)用于腸癌腫瘤標(biāo)志物的檢測(cè)。
[0009]本發(fā)明的技術(shù)方案如下:
1.一種基于Pd/V205/MWCNTs的腸癌腫瘤標(biāo)志物免疫傳感器的制備方法，其特征在于，步驟如下:
(1)將直徑為3~ 5mm的玻碳電極用Al2O3拋光粉打磨，超純水清洗干凈；
(2)將6μ?、1.0-2.0 mg/mL的二氧化錫摻雜的石墨烯溶液滴涂在電極表面，晾干，用超純水沖洗，晾干； (3)滴涂6μ?的金納米粒子溶液于電極表面，晾干，超純水沖洗，晾干；
(4)滴涂6μ?、8 ~ 12 Pg/mL的腸癌腫瘤標(biāo)志物捕獲抗體Ab1溶液于電極表面，4 °C冰箱中干燥；
(5)超純水沖洗掉未結(jié)合的捕獲抗體々匕后，滴加將6PL、質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1-1.0%的牛血清白蛋白BSA溶液于電極表面，4°C冰箱中晾干；
(6)超純水沖洗掉未結(jié)合的BSA后，滴加6PL、0.lpg/mL~ 50 ng/mL的一系列不同濃度的腸癌腫瘤標(biāo)志物抗原標(biāo)準(zhǔn)溶液于電極表面，室溫孵化lh，超純水清洗，置于4°C冰箱中干燥；
(7)將6μ?、1 ~ 3 mg/mL的檢測(cè)抗體孵化物Pd/V205/MWCNTs/Ab2溶液滴涂于電極表面上，室溫孵化Ih，超純水清洗干凈，置于4°C冰箱中晾干，制得一種基于Pd/V205/ MffCNTs的腸癌腫瘤標(biāo)志物免疫傳感器。
[0010]2.如權(quán)利要求1所述的一種基于Pd/V205/MWCNTs的腸癌腫瘤標(biāo)志物免疫傳感器的制備方法，所述的二氧化錫摻雜的石墨烯、金納米粒子溶液、檢測(cè)抗體孵化物Pd/v205/MffCNTs /^132溶液，其特征在于，制備步驟如下:
(O二氧化錫摻雜的石墨烯的制備
取0.1g干燥的氧化石墨烯分散在500 mL超純水中，超聲90 min分散均勻，制得氧化石墨烯懸濁液；
將2.2 ~ 2.6 g五水氯化錫溶解于20 mL超純水中，加入6 ~ 10 mL的氧化石墨烯懸濁液混合，攪拌反應(yīng)5 h后，以8000 r ^min1的轉(zhuǎn)速下，離心分離，除去上清液，所得的固體在氬氣保護(hù)下500°C加熱2 h，制得二氧化錫摻雜的石墨烯；
(2)金納米粒子溶液的制備
將4.0?4.2 mL, 1%氯金酸加入到95.8 mL超純水中，邊攪拌邊加入10 mL、38.8 mmol/L的檸檬酸鈉，在100°C下回流15 min，離心分離，棄去沉淀，分散均勻的酒紅色的上清液即為金納米粒子溶液；
(3)檢測(cè)抗體孵化物Pd/V205/MWCNTs/^132溶液的制備
①Pd納米粒子溶液的制備
將100 ~ 110 mg聚乙烯吡咯烷酮PVP、170 ~ 190mg檸檬酸、34.4 mg氯化鈀溶于3mL乙醇和8 mL超純水的混合液中，80°C下磁力攪拌3h，冷卻至室溫，加入6 ~ 10 mL苯甲醇離心，棄去上清液；用超純水洗滌三次，倒掉上清液，剩余的黑色液體即為Pd納米粒子溶液；
②V205/MWCNTs的制備
將0.6~0.8g多壁碳納米管分散在40 mL硫酸和硝酸以H2S04:HN03=3:1的比例的混合溶液中，40°C反應(yīng)2h ;冷卻到室溫，離心洗滌至溶液成中性，50°C真空干燥，制得純化的多壁碳納米管；
將0.95~1.15g V2O5粉末溶于80mL、30%的雙氧水，當(dāng)形成紅色的澄清溶液30 min后，加入0.18 g上述純化的多壁碳納米管，攪拌6 ~ 8h，陳化24h，形成膠態(tài)懸池液；將上述懸濁液轉(zhuǎn)移到聚四氟乙烯高壓反應(yīng)釜，恒溫180°C下反應(yīng)72h ;離心分離，并用超純水洗滌，直至上清液無(wú)色，35°C真空干燥8h，制得黑色粉末V205/MWCNTs ;
③Pd/V205/MWCNTs 的制備將20~30 mg的V205/MWCNTs加入至Pd納米粒子溶液中，超聲15min，磁力攪拌3h，離心，除去上清液，加入20 mL乙酸，加熱至60°C，反應(yīng)30min，離心，除去上清液，無(wú)水乙醇洗
3次，35°C 真空干燥，制得 Pd /V205/MWCNTs ；
④Pd/V205/MWCNTs /^132溶液的制備
在 2 mL、2~4 mg/mL 的 Pd/V205/MWCNTs 溶液中，加入 1~3 mL、8~12 Pg/mL 的腸癌腫瘤標(biāo)志物檢測(cè)抗體Ab2S液，4 °C恒溫振蕩培養(yǎng)箱中振蕩孵化12 h ;離心分離后，加入I mL的pH=7.4磷酸鹽緩沖溶液，得到檢測(cè)抗體孵化物Pd/V205/MWCNTs/Ab2溶液，4 0C下保存?zhèn)溆谩?br>[0011]3.如權(quán)利要求1所述的制備方法制備的一種基于Pd/V205/MWCNTs的腸癌腫瘤標(biāo)志物免疫傳感器用于腸癌腫瘤標(biāo)志物的檢測(cè)，步驟如下:
(1)使用電化學(xué)工作站以三電極體系進(jìn)行測(cè)試，飽和甘汞電極為參比電極，鉑絲電極為輔助電極，所制備的傳感器為工作電極，在10 mL、50 mmol/L的pH 5.6~ 8.0磷酸鹽緩沖溶液中進(jìn)行測(cè)試；
(2)用計(jì)時(shí)電流法對(duì)腸癌腫瘤標(biāo)志物進(jìn)行檢測(cè)，輸入電壓為-0.4 V，取樣間隔0.1 S，運(yùn)行時(shí)間400 s ；
(3)當(dāng)背景電流趨于穩(wěn)定后，每隔50s向10 mL、50 mmol/L的pH=7.4的磷酸鹽緩沖溶液中加入10μ?、5 mo I/L的雙氧水溶液，記錄電流變化。
[0012]4.如權(quán)利要求1所述的一種基于Pd/V205/MWCNTs的腸癌腫瘤標(biāo)志物免疫傳感器的制備方法，所述腸癌腫瘤標(biāo)志物選自下列之一:CA19-9和CA242。
[0013]本發(fā)明的有益成果
(I)本發(fā)明的發(fā)明人首次將Pd/V205/MWCNTs納米粒子作為檢測(cè)抗體標(biāo)記物引入到腸癌腫瘤標(biāo)志物的電化學(xué)免疫傳感器的制備當(dāng)中，利用Pd/V205/MffCNTS優(yōu)異的生物相容性和高的催化性能，使所制作的傳感器具有高的靈敏度和寬的檢測(cè)范圍，檢測(cè)CA19-9的線性范圍為 0.10pg/mL ~ 50ng/mL，檢測(cè)限為 0.020 pg/mL ;檢測(cè) CA242 的線性范圍為 0.12pg/mL ~50 ng/mL，檢測(cè)限為 0.024pg/mL。
[0014](2)利用具有良好催化效果的金納米粒子，實(shí)現(xiàn)信號(hào)放大；二氧化錫雜化的石墨烯，可以提高比表面積和電子轉(zhuǎn)移速率，實(shí)現(xiàn)了電化學(xué)信號(hào)的雙重放大，進(jìn)一步提高了傳感器的靈敏度。
[0015](3)使用完全相同的納米材料和修飾方法，利用抗原與抗體的特異性結(jié)合，只需改變腸癌腫瘤標(biāo)志物種類即可實(shí)現(xiàn)不同腸癌腫瘤標(biāo)志物的高靈敏、特異性檢測(cè)，此方法操作簡(jiǎn)單，檢測(cè)速度快，可在短時(shí)間內(nèi)實(shí)現(xiàn)大量樣品的測(cè)定，有利于腫瘤標(biāo)志物傳感器的商品化。
[0016](4)將Pd/V205/MWCNTs納米粒子與腸癌腫瘤標(biāo)志物檢測(cè)抗體直接孵化，在檢測(cè)抗體的標(biāo)記物中不必使用酶，避免了因酶的失活和泄漏造成的檢測(cè)誤差，簡(jiǎn)化了檢測(cè)抗體標(biāo)記物的制作步驟，顯著提高了電化學(xué)免疫傳感器的重現(xiàn)性和穩(wěn)定性。
【具體實(shí)施方式】
[0017]現(xiàn)將本發(fā)明通過(guò)【具體實(shí)施方式】進(jìn)一步說(shuō)明，但不限于此
實(shí)施例1.一種基于Pd/v205/ MffCNTs的腸癌腫瘤標(biāo)志物免疫傳感器的制備方法，其特征在于，步驟如下: (1)將直徑為3mm的玻碳電極用Al2O3拋光粉打磨，超純水清洗干凈；
(2)將6μ?,Ι.0 mg/mL的二氧化錫摻雜的石墨烯溶液滴涂在電極表面，晾干，用超純水沖洗，晾干；
(3)滴涂6μ?的金納米粒子溶液于電極表面，晾干，超純水沖洗，晾干；
(4)滴涂6μ?、