肝癌早期診斷試劑盒及其應用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物檢測領(lǐng)域，具體設及一種肝癌早期診斷試劑盒及其應用。
【背景技術(shù)】
[0002] 國際衛(wèi)生組織統(tǒng)計結(jié)果顯示，2013年全球有101萬肝癌新發(fā)病例，76萬肝癌死亡 病例，男、女新發(fā)病例分別位于當年惡性腫瘤發(fā)病率的第五位及第^；：位，而男、女死亡病例 分別位于當年惡性腫瘤死亡率的第二位及第六位。在所有肝癌患者中，肝細胞癌為最常見 的一種組織學類型，占所有肝癌患者的70% -85%。
[0003] 肝癌惡性程度高，病情發(fā)展迅速，若治療不及時或治療不當，則可使病情迅速惡化 而致死亡。近年來，隨著人們生活方式的改變及其他各種因素的影響，我國肝癌發(fā)病率仍有 逐年上升趨勢，我國每年死于肝癌的患者約有12萬人，約占世界肝癌死亡人數(shù)的46%，目 前肝癌已經(jīng)成為我國僅次于胃癌、食管癌第=位的惡性腫瘤死亡原因。
[0004] PIVKA-II(ProteinInducedbyVitaminKAbsenceorAntagonist-II)也被稱 作脫-駿基凝血酶原值es-carbo巧-prot虹ombin,DCP),是一種異常的凝血酶原，最早于 1984年由Liebman從肝細胞癌化巧atoeellularcarcinoma,肥C)患者的血清中發(fā)現(xiàn)，其 形成的確切機制不明。與正常的凝血酶原相比，W往文獻表明PIVKA-II和AFP沒有相關(guān) 性，兩者聯(lián)合檢測能提高陽性率。PIVKA-II，尤其是和AFP聯(lián)合，可W作為肝癌早期檢測 的一個理想標志物。
[0005] 檢測血清DCP受多種非特異物理吸附或者非特異結(jié)合的影響，比如凝血素、凝血 酶和纖維素及其類似物等的干擾比較大，因此多克隆DCP抗體在免疫分析上受到很大影 響，制約其應用。隨著分子生物學和基因工程的發(fā)展，DCP抗體應用到免疫分析檢測上，純 化的DCP單克隆抗體的出現(xiàn)更是解決了交叉性大的問題。作為血清學標志物，DCP抗體出 現(xiàn)后，人們試圖建立各種免疫分析方法用于DCP的檢測.目前文獻中報道的方法有：電化 學發(fā)光免疫分析技術(shù)、液相親和免疫方法、免疫沉淀法、westernblot、ELISA等。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的是提供一種靈敏度、特異度更高的肝癌早期診斷試劑盒。本發(fā)明的 技術(shù)方案如下：一種肝癌早期診斷試劑盒，所述的診斷試劑盒組成如下：DCP標準品溶液， 辣根過氧化物酶（HR巧標記的DCP單克隆抗體溶液，對照緩沖液，清洗緩沖液，底物液，顯色 液，終止液和DCP多克隆抗體包被酶標板。
[0007] DCP標準品溶液為取相應量DCP標準品溶解于含有3g/LOVA的20mmol/L的PBS 緩沖液，DCP標準品濃度依次為lOmAU/l，80mAU/L，200mAU/L，800mAU/L和 2000mAU/L.
[000引所述包被酶標板的制備過程為：將包被用DCP多克隆抗體用0. 05M碳酸鹽緩沖液 (抑值為9.W稀釋后加入酶標板各孔，每孔100y1，吸附過夜，用0. 05M磯酸鹽緩沖液（pH 值為9. 5)洗板，再用封閉液封閉過夜，甩干后驚干，即獲得單克隆抗體包被酶標板。所述封 閉液為含5g/L的明膠、0. 5g/L的庶糖和1. 5g/L的蛋清白蛋白（OVA)的20mmol/LPBS緩沖 液，抑值為9. 5。
[0009] 辣根過氧化酶標記的DCP單克隆抗體溶液的制備方法為：先將2mgDCP單克隆 抗體和20mgHRP，加入1ml的lOOmmol/LPBS緩沖液加值7. 4)中，在4°C旋轉(zhuǎn)混合，緩慢 加入4ml的1 %戊二醒溶液，25°C放置2小時，加入0. 1ml200mmol/L的賴氨酸溶液，4°C放 置化，裝入透析袋，透析過夜，向透析產(chǎn)物加入等體積的60%甘油，混勻，加入終濃度為5g/ L的OVA。
[0010] 對照緩沖液為20mmol/L的PBS(抑7. 4)緩沖液；
[0011] 底物液為磯酸-巧樣酸緩沖液（pH7. 4)配制的3 %過氧化氨溶液，并且溶液中 0.Img/L的焦磯酸二氨鋼；
[001引顯色液為四甲基聯(lián)苯胺（TMB)的甲醇溶液，濃度為0.Img/ml;
[001引終止液為3mol/L硫酸；
[0014] 清洗緩沖液為15臟〇1/1的口85(口肪4)配制的0.05%吐溫20溶液。
[0015] 本發(fā)明所述肝癌早期診斷試劑盒對DCP的最低檢測限可W達到2.OmAU/mU并且 穩(wěn)定性極佳，在室溫條件下可保存1年，在4°C下可保存3年。
【具體實施方式】
[0016] 下面將進一步的詳細說明本發(fā)明。需要指出的是，W下說明僅僅是對本發(fā)明要求 保護的技術(shù)方案的舉例說明，并非對該些技術(shù)方案的任何限制。本發(fā)明的保護范圍W所附 權(quán)利要求書記載的內(nèi)容為準。
[0017] 下列實施例中未注明具體實驗條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，分子克隆實 驗指南（SambrookJ,etal. 2008.MolecularCloning:AL油oratoryManual,化dEd.)中 所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
[001引實施例1
[0019] 一種肝癌早期診斷試劑盒，所述的診斷試劑盒組成如下：
[0020] DCP標準品溶液，辣根過氧化物酶（HR巧標記的DCP單克隆抗體溶液，對照緩沖液， 清洗緩沖液，底物液，顯色液，終止液和DCP多克隆抗體包被酶標板.
[0021]DCP標準品取相應量DCP標準品溶解于含有3g/LOVA的20mmol/L的PBS緩沖液， DCP標準品濃度依次為lOmAU/l，80mAU/L，200mAU/L，800mAU/L和 2000mAU/L.
[0022] 所述包被酶標板的制備過程為：將包被用DCP多克隆抗體用0. 05M碳酸鹽緩沖液 (抑值為9. 5)稀釋后加入酶標板各孔，每孔100y1，吸附過夜，用0. 05M磯酸鹽緩沖液（pH 值為9. 5)洗板，再用封閉液封閉過夜，甩干后驚干，即獲得單克隆抗體包被酶標板。所述封 閉液為含5g/L的明膠、0. 5g/L的庶糖和1. 5g/L的蛋清白蛋白（OVA)的20mmol/LPBS緩沖 液，抑值為9. 5。
[0023] 辣根過氧化酶標記的DCP單克隆抗體溶液的制備方法為：先將2mgDCP單克隆 抗體和20mgHRP，加入1ml的lOOmmol/LPBS緩沖液加值7. 4)中，在4°C旋轉(zhuǎn)混合，緩慢 加入4ml的1 %戊二醒溶液，25°C放置2小時，加入0. 1ml200mmol/L的賴氨酸溶液，4°C放 置化，裝入透析袋，透析過夜，向透析產(chǎn)物加入等體積的60%甘油，混勻，加入終濃度為5g/ L的OVA。
[0024] 本實施例中DCP單克隆抗體和DCP多克隆抗體購自美國rapi化io(RB)公司。
[0025] 對照緩沖液為20mmol/L的PBS(抑7. 4