專利名稱：一種肝癌早期診斷試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物制劑技術(shù)領(lǐng)域，具體說是一種肝癌早期診斷試劑盒。
背景技術(shù)：
肝癌是目前最常見的惡性腫瘤之一，為當(dāng)今世界第三位致死性腫瘤，占我國腫瘤死亡原因的第二位，全世界約有100萬患者，每年約有30萬新增病例。在新增的病例中，45% 發(fā)生在中國，主要分布在東南及沿海流域。肝癌的發(fā)生是多因素、多途徑、多步驟長期作用的結(jié)果，包括外環(huán)境致癌因素(病毒、寄生蟲、細(xì)菌的感染、黃曲霉毒素的攝入、水源污染以及吸煙、飲酒)和自身遺傳因素(癌基因的激活和抑癌基因的失活)。在眾多病因中，乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV )和黃曲霉素誘導(dǎo)的癌基因激活和抑癌基因失活是引起肝細(xì)胞癌變的主要原因。根據(jù)流行病學(xué)調(diào)查，我國目前約有9300萬HBV攜帶者，其中患者98萬余人，約有4000萬HCV感染者，其中患者7萬余人。而且近年來，隨著乙型肝炎病毒的流行，我國肝癌的地域分布及發(fā)病趨勢發(fā)生明顯變化，其發(fā)病年齡高峰移向青壯年，死亡率也向小年齡組推移。這一基本現(xiàn)狀是造成我國肝癌發(fā)生率在今后一個較長的時期內(nèi)仍處于較高水平的重要原因。諸多研究結(jié)果表明，早期發(fā)現(xiàn)是提高肝癌治療效果、降低病死率的有效手段。國際上對肝癌主要應(yīng)用甲胎蛋白(AFP)、超聲和其他影像學(xué)相結(jié)合的診斷技術(shù)進(jìn)行篩查，但是超聲檢查依賴于操作者的經(jīng)驗和設(shè)備，而其他影像學(xué)手段需要高昂的費用，廣泛應(yīng)用受到限制。目前市場上用的肝癌診斷試劑盒存在以下缺點1.對早期肝癌的檢出率不高，極大限制了現(xiàn)有肝癌治療手段的療效；2.操作手段繁瑣，檢測時必須加入標(biāo)準(zhǔn)抗原作為參照，檢測的成本較高；
1 ^ -^MSSBl (a disintegrin and metalloproteases, ADAMs) g I M 跨膜分泌型糖蛋白家族，也稱金屬蛋白酶解聚素或MDC (metalloprotease/disintegrin/ cysteinerich)，ADAM基因編碼的蛋白質(zhì)通常由800-1200個氨基酸組成，包含有8個結(jié)構(gòu)域，自N-端至C-端依次為信號域、前導(dǎo)域、類金屬蛋白酶功能域、解整合素樣功能域、富含半胱氨酸功能域、類表皮生長因子功能域、跨膜域和胞質(zhì)尾域。ADAMs家族的作用廣泛，涉及膜組織融和、細(xì)胞因子和生長因子的解離脫落、細(xì)胞遷移的控制，以及一些諸如受精，肌肉發(fā)育，神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞的生長發(fā)育過程的調(diào)控等；ADAMs在調(diào)節(jié)細(xì)胞-細(xì)胞和細(xì)胞-基質(zhì)的相互作用中至關(guān)重要。近年來研究發(fā)現(xiàn)該家族成員在炎癥反應(yīng)、腫瘤發(fā)生發(fā)展轉(zhuǎn)移、免疫性疾病和過敏反應(yīng)疾病中有著重要作用。迄今為止，文獻(xiàn)報道的ADAMs家族成員共有30余種。 ADAM7是ADAMs家族的成員之一，其編碼的蛋白ADAM7是具有擬4個氨基酸的膜蛋白，具有金屬蛋白酶活性，參與一系列與膜結(jié)合的受體、細(xì)胞因子等蛋白的水解過程。ADAM7和其他去整合素金屬蛋白酶家族成員雖然來源不同，但是基本結(jié)構(gòu)均由高度保守的序列組成，含8 個結(jié)構(gòu)域。RT-PCR是研究檢測特定基因表達(dá)的一個簡便、準(zhǔn)確的方法。通過RT-PCR在mRNA 水平上檢測某個基因的表達(dá)情況，可以提高檢測的準(zhǔn)確率。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明針對現(xiàn)有技術(shù)存在的缺點和不足，提供一種肝癌早期診斷試劑盒。本發(fā)明試劑盒是一種體外診斷試劑，通過檢測早期肝癌患者血清中金屬蛋白酶ADAM7核心基因的相對表達(dá)量診斷早期肝癌，適用于一般PCR儀，操作簡單，特異性和敏感性好，市場前景廣闊。一種肝癌早期診斷試劑盒，采用以下技術(shù)方案
一、肝癌早期診斷試劑盒的組成
該試劑盒有RNA提取試劑，RT-PCR反應(yīng)試劑，ADAM7核心基因引物和beta-act in核心基因引物，陰性質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品組成；以下以一個可以檢測20位病人的試劑盒為例說明本發(fā)明試劑盒各組份及其用量
1、RNA提取試劑=Trizol :10ml ；氯仿:10ml ；異丙醇:10ml ；75% 乙醇:40ml ；無 RNA 酶的無菌水2ml ；
2、RT-PCR反應(yīng)試劑50μ mol/L隨機(jī)六聚體引物20 μ 1 ；10 mmol/L dNTP混合物 20 μ 1 ；40 U/μ 1 RNA酶抑制因子10μ 1 ；200 U/μ 1 AMV反轉(zhuǎn)錄酶20μ 1 ；5倍反轉(zhuǎn)錄酶反應(yīng)緩沖液1ml ；10 倍PCR緩沖液1ml ；25 mmol/L MgCl2 lml; 5U/μ 1 Taq酶10 μ 1 ；
3,10 μ mol/L ADAM7 基因上游引物100 μ 1 ； 10 μ mol/LADAM7 基因下游引物100 μ 1 ； lOymol/Lbeta-actin 基因上游引物100 μ 1 ；10 μ mol/L beta-actin 基因下游引物 100μ 1 ；
ADAM7核心基因引物序列為
上游引物5，-CTGATACAGAAGCGAGAT-3，
下游引物 5，-GAATAATTGGCACCATAC-3， beta-actin核心基因引物序列為
上游引物5’ -GTGGACATCCGCAAAGAC-3，
下游引物5，- AAAGGGTGTAACGCAACTAA-3， 4、陰性質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品正常人血清2ml ；
二、本試劑盒的檢測方法
1、RNA提取分別提取待檢測病人血清RNA和陰性質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品(正常人血清)RNA,提取方法如下
把0. Iml待測血清或正常對照血清加入裝有0. 5mlTrizol的1. 5ml離心管中立即振蕩攪拌，室溫靜置5min，于4°C，12000 g，離心10 min。小心吸取上清液轉(zhuǎn)入新的1. 5 ml離心管，向勻漿液中加入0. 5ml氯仿，蓋緊離心管蓋，用力震蕩離心管，在15-30°C放置3 min。 于4°C，12000 g，離心15 min。從離心機(jī)中小心地取出離心管，吸取上清至另一 1. 5 ml離心管。向上清加入0. 5ml異丙醇，輕輕顛倒離心管充分混勻液體，在15-30°C放置10 min。 于4°C，12000 g，離心10 min。棄去上清，緩慢地沿管壁加入75%乙醇1 ml，輕輕顛倒洗滌離心管管壁，小心棄去乙醇。再加入75 %乙醇Iml，在渦旋器上短暫渦旋；于4°C，SOOOg 離心10 min。小心棄上清，短暫離心，用移液槍吸去所有上清，在超凈工作臺中干燥沉淀5 min。加入無RNA酶的無菌水50 μ 1完全溶解RNA沉淀后，_80°C保存，備用；
2、取待病人血清RNA和正常人血清RNA分別進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)
DRT反應(yīng)a、在PCR管a中配制下列混合液 50μπιΟ1/1隨機(jī)六聚體引物1 μ 10 mmol/L dNTP 混合物 1 μ 1 待測血清RNA 3 μ 1
無RNA酶的無菌水5μ1
總體積10 μ 1
在PCR儀上進(jìn)行65°C 5 min變性、退火反應(yīng)，冰上急冷，得到反應(yīng)液；
b、在上述PCR管a中加入反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液
5倍反轉(zhuǎn)錄酶反應(yīng)緩沖液4 μ 1
40 υ/μ 1 RNA酶抑制因子0. 5 μ 1
200 U/ μ 1 AMV 反轉(zhuǎn)錄酶1 μ 1
無RNA酶的無菌水4. 5 μ
總體積20 μ 1
在PCR儀上30°C，10 min ；42°C,30 min ；95°C 5 min進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)后，然后置于冰上，得到cDNA模板溶液； 2) PCR反應(yīng)
在PCR管b中配置下列PCR反應(yīng)液 10倍PCR緩沖液2. 5 μ
25 mmol/L MgCl21. 5 μ 1
10 mmol/L dNTP 混合物0. 5 μ 1
cDNA 模板1 μ 1
10 μπιοΙ/L ADAM7核心基因上游引物 0.75 μ 1 10 ymol/L ADAM7核心基因下游引物 0.75 μ 1 5υ/μ 1 Taq 酶0. 15 μ 1
H2O17. 85 μ 1
總體積25 μ 1
在PCR管c中配置下列PCR反應(yīng)液 10倍PCR緩沖液2. 5 μ
25 mmol/L MgCl21. 5 μ 1
10 mmol/L dNTP 混合物0. 5 μ 1
cDNA 模板1 μ 1
10 μπιοΙ/L beta-actin 核心基因上游引物 0.75 μ 1 10 μ mol/L beta-actin核心基因下游引物 0.75 μ 1 5υ/μ 1 Taq 酶0· 15 μ 1
H2O17. 85 μ 1
總體積25 μ 1
將上述PCR管b、c置于PCR儀中進(jìn)行PCR擴(kuò)增，條件為94°C預(yù)變性3 min,然后進(jìn)行 94°C變性，1 min，55°C退火1.5 min，72°C延伸1 min，進(jìn)行觀個循環(huán)擴(kuò)增；最后進(jìn)行72°C， 10 min終延伸，擴(kuò)增出ADAM7核心基因片段(基因序列如序列表序列1)和beta-actin核心基因片段(基因序列如序列表序列2)；
3、檢測結(jié)果分析取RT-PCR反應(yīng)產(chǎn)物5 μ 1進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統(tǒng)照相，利用Gel Pro 4. 0軟件計算ADAM7核心基因和beta-atctin核心基因條帶灰度值；被檢測的ADAM7核心基因相對表達(dá)量=ADAM7核心基因條帶灰度值/beta-actin核酸條帶灰度值。待測血清樣本中ADAM7核心基因相對表達(dá)量是陰性質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品的1. 5倍以上定義為待測樣本中ADAM7核心基因的相對表達(dá)量顯著上調(diào)表達(dá)，可判斷為待測病人患肝癌；
本試劑盒的檢測依據(jù)及工作原理
1、通過對30例肝癌組織及相應(yīng)的癌旁組織和5例正常肝組織運用RT-PCR方法檢測 ADAM7 mRNA的表達(dá)水平，免疫組化法對ADAM8蛋白表達(dá)進(jìn)行定位和半定量分析顯示ADAM7 mRNA在肝癌組織及癌旁組織中均有表達(dá)，癌組織明顯高于癌旁，在正常組織中僅有少量表達(dá)；ADAM7蛋白高表達(dá)于肝癌組織，癌旁組織也有所表達(dá)，在正常組織僅有少量表達(dá)。且其表達(dá)與患者的年齡、性別無關(guān)，但在腫瘤大小超過3cm、細(xì)胞低分化、伴門靜脈栓塞及有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的肝癌組織中表達(dá)明顯升高；
2、通過在體外培養(yǎng)的人肝癌細(xì)胞株OfepG^與正常肝細(xì)胞株(L02)中分別加入人 ADAM7分子，來觀察ADAM7分子對正常肝細(xì)胞和肝癌細(xì)胞增殖與凋亡的影響。結(jié)果表明，加入ADAM7分子后，促進(jìn)了正常肝細(xì)胞的增殖，對肝癌細(xì)胞增殖幾乎沒什么影響；增加了肝癌細(xì)胞對TNF-α誘導(dǎo)凋亡的抵抗性，對TNF-α誘導(dǎo)正常肝細(xì)胞的凋亡無明顯影響；
3、通過對肝癌患者和正常人血清ADAM7的表達(dá)水平的檢測，發(fā)現(xiàn)ADAM7在肝癌患者的血清中顯著上調(diào)表達(dá)，而在其它類型的癌癥患者中，ADAM7表達(dá)無顯著差異。而且半定量RT-PCR結(jié)果顯示，肝癌患者肝組織中金屬蛋白酶ADAM7基因的相對表達(dá)量(被檢測的 ADAM7基因相對表達(dá)量=ADAM7核酸條帶灰度值/beta-actin核酸條帶灰度值)是正常對照的1. 5倍甚至兩倍以上，證明ADAM7基因的相對表達(dá)量比正常增高1. 5倍以上可以判斷為肝癌；
4、通過實驗證明ADAM7核心基因片段(序列表序列1)的相對表達(dá)量(ADAM7核心基因片段相對表達(dá)量=ADAM7核心基因條帶灰度值/beta-actin核心基因條帶灰度值)，是正常對照相對表達(dá)量的1. 5倍以上也可以判斷為肝癌，其中beta-actin核心基因序列如序列表序列2。通過Gel Pro 4. 0軟件分析ADAM7核心基因片段相對表達(dá)量，檢測結(jié)果準(zhǔn)確可靠。
本發(fā)明試劑盒和現(xiàn)有技術(shù)相比有以下優(yōu)點
1、半定量RT-PCR的檢測方法從基因水平進(jìn)行檢測早期肝癌血清中高表達(dá)且不易被降解的金屬蛋白酶ADAM7來提高早期肝癌的診斷效果結(jié)果更加準(zhǔn)確可靠；
2、本發(fā)明的試劑盒適用于一般PCR儀，操作簡便，可重復(fù)性高；
3、通過GelPro 4. 0軟件對結(jié)果進(jìn)行分析快速準(zhǔn)確，顯著提高了方法的實用性和技術(shù)水準(zhǔn)，便于大規(guī)模推廣應(yīng)用；
4、檢測成本低，特異性和敏感性好；


圖1為待測患者1、2、3、4、5和6試劑盒檢測瓊脂糖凝膠電泳圖2為待測患者1、2、3、4、5和6試劑盒檢測結(jié)果分析圖3為待測患者7、8、9、10、11和12的試劑盒檢測瓊脂糖凝膠電泳圖4為待測患者7、8、9、10、11和12的試劑盒檢測結(jié)果分析圖；圖5為待測患者13、14、15、16、17、、18的試劑盒瓊脂糖凝膠電泳圖； 圖6為待測患者13、14、15、16、17、、18試劑盒檢測結(jié)果分析圖； 圖中標(biāo)號C為正常對照；DC 待測患者；*和**分別代表與正常對照相比在O°<0. 05) 和(7X0.01)水平上有顯著差異；
具體實施例方式
結(jié)合下列實施例進(jìn)一步闡述本發(fā)明試劑盒的檢測方法和檢測效果。本試劑盒中包括RNA提取試劑、RT-PCR反應(yīng)試劑、ADAM7核心基因引物、 beta-actin核心基因引物和陰性質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品；其中RNA提取試劑由分裝的Trizol、氯仿、異丙醇、75%乙醇和無RNA酶的無菌水組成；RT-PCR反應(yīng)試劑由分裝的隨機(jī)六聚體引物、dNTP 混合物、RNA酶抑制因子、AMV反轉(zhuǎn)錄酶、5倍反轉(zhuǎn)錄酶反應(yīng)緩沖液、10倍PCR緩沖液、MgCl2 和Taq酶組成；
ADAM7核心基因引物序列為 上游引物5，-CTGATACAGAAGCGAGAT-3， 下游引物 5，-GAATAATTGGCACCATAC-3，； beta-actin核心基因引物序列為 上游引物5’ -GTGGACATCCGCAAAGAC-3， 下游引物5，- AAAGGGTGTAACGCAACTAA-3，； 陰性質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品為正常人血清。本發(fā)明試劑盒用于檢測18名待測病人是否患肝癌
1、RNA提取分別提取18名待測病人血清RNA和陰性質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品(正常人血清)RNA，提取方法如下
把0. Iml待測血清或正常對照血清加入裝有0. 5mlTrizol的1. 5ml離心管中立即振蕩攪拌，室溫靜置5min，于4°C，12000 g，離心10 min。小心吸取上清液轉(zhuǎn)入新的1. 5 ml離心管，向勻漿液中加入0. 5ml氯仿，蓋緊離心管蓋，用力震蕩離心管，在15-30°C放置3 min。 于4°C，12000 g，離心15 min。從離心機(jī)中小心地取出離心管，吸取上清至另一 1. 5 ml離心管。向上清加入0. 5ml異丙醇，輕輕顛倒離心管充分混勻液體，在15-30°C放置10 min。 于4°C，12000 g，離心10 min。棄去上清，緩慢地沿管壁加入75%乙醇1 ml，輕輕顛倒洗滌離心管管壁，小心棄去乙醇。再加入75%乙醇1ml，在渦旋器上短暫渦旋；于4°C，8000g 離心10 min。小心棄上清，短暫離心，用移液槍吸去所有上清，在超凈工作臺中干燥沉淀5 min。加入無RNA酶的無菌水50 μ 1完全溶解RNA沉淀后，即得到RNA溶液，-80°C保存，
2、取步欒1所提取的18名待測病人血清RNA和陰性質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品RNA分別進(jìn)行RT-PCR 反應(yīng)，操作方法如下 DRT反應(yīng)
a、在PCR管a中配制下列混合液
50μπιΟ1/1隨機(jī)六聚體引物1 μ
10 mmol/LdNTP 混合物1 μ 1
待測血清RNA3 μ 1
無RNA酶的無菌水5μ1總體積10 μ 1
在PCR儀上進(jìn)行65°C 5 min變性、退火反應(yīng)，然后置于冰上，得到反應(yīng)液；
b、在上述PCR管a中加入反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液
5倍反轉(zhuǎn)錄酶反應(yīng)緩沖液4 μ 1
40 υ/μ 1 RNA酶抑制因子0. 5 μ 1
200 U/ μ 1 AMV 反轉(zhuǎn)錄酶1 μ 1
無RNA酶的無菌水4. 5 μ
總體積20 μ 1
在PCR儀上30°C，10 min ；42°C,30 min ；95°C 5 min進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)后，然后置于冰上，得到cDNA模板溶液； 2) PCR反應(yīng)
在PCR管b中配置下列PCR反應(yīng)液 10倍PCR緩沖液2. 5 μ
25 mmol/L MgCl21. 5 μ 1
10 mmol/LdNTP 混合物0. 5 μ 1
cDNA 模板1 μ 1
10 ymol/LADAM7核心基因上游引物 0.75 μ 1 10 ymol/L ADAM7核心基因下游引物 0.75 μ 1 5υ/μ 1 Taq 酶0. 15 μ 1
H2O17. 85 μ 1
總體積25 μ 1
在PCR管c中配置下列PCR反應(yīng)液 10倍PCR緩沖液2. 5 μ
25 mmol/L MgCl21. 5 μ 1
lOmmol/LdNTP 混合物0. 5 μ 1
cDNA 模板1 μ 1
ΙΟμπιοΙ/L beta-actin 核心基因上游引物 0.75 μ 1 ΙΟμπιοΙ/L beta-actin 核心基因下游引物 0.75 μ 1 Taq 酶(5υ/μ 1)0. 15 μ 1
H2O17. 85 μ 1
總體積25 μ 1
將上述PCR管b、c置于PCR儀中進(jìn)行PCR擴(kuò)增，條件為94°C預(yù)變性3 min,然后進(jìn)行 94°C變性，1 min，55°C退火1.5 min，72°C延伸1 min，進(jìn)行洲個循環(huán)擴(kuò)增；最后進(jìn)行72°C， 10 min終延伸；擴(kuò)增出的ADAM7核心基因(基因序列如序列表序列1)和beta-actin核心基因(基因序列如序列表序列2)；
3、檢測結(jié)果分析取RT-PCR反應(yīng)產(chǎn)物5 μ 1進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統(tǒng)照相，利用Gel Pro 4. 0軟件計算ADAM7核心基因和beta-atctin核心基因條帶灰度值；被檢測的ADAM7核心基因相對表達(dá)量=ADAM7核心基因條帶灰度值/beta-actin核心基因灰度值。待測樣本中ADAM7核心基因相對表達(dá)量比陰性質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品高于1. 5倍的定義為待測樣本中ADAM7核心基因的相對表達(dá)量顯著上調(diào)表達(dá)，可判斷為待測病人患肝癌；檢測結(jié)果(如附圖1-附圖6)顯示金屬蛋白酶ADAM7在待測患者3、4、5、6、9、10、11、12、15、16、17、18的血清中的相對表達(dá)量是正常對照血清中ADAM7相對表達(dá)量的1. 5倍以上，可以判斷為肝癌。 待測患者1、2、7、8、13、14血清中ADAM7的相對表達(dá)量與正常對照相比小于1. 5倍，則不是肝癌患者。*和**分別代表和正常對照相比在0°<0.0幻和(/X0. 01)水平上有顯著差異； 4、利用CT和肝組織活檢病理分析對18名待測患者進(jìn)行肝癌診斷，診斷結(jié)果如表1，患者3、4、5、6、9、10、11、12、15、16、17和18診斷為肝癌，患者1、2、7、8、13和14診斷為不是肝癌患者。此結(jié)果和試劑盒檢測結(jié)果完全一致，說明本試劑盒檢測結(jié)果準(zhǔn)確。 表1、CT和肝組織活檢病理分析對18名待測患者肝癌診斷結(jié)果
權(quán)利要求
1. 一種肝癌早期診斷試劑盒，其特征在于試劑盒中包括RNA提取試劑、RT-PCR反應(yīng)試劑、ADAM7核心基因引物、beta-actin核心基因引物和陰性質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品；其中RNA提取試劑由分裝的Trizol、氯仿、異丙醇、75%乙醇和無RNA酶的無菌水組成； RT-PCR反應(yīng)試劑由分裝的隨機(jī)六聚體引物、dNTP混合物、RNA酶抑制因子、AMV反轉(zhuǎn)錄酶、 5倍反轉(zhuǎn)錄酶反應(yīng)緩沖液、10倍PCR緩沖液、MgCl2和Taq酶組成； ADAM7核心基因引物序列為 上游引物5，-CTGATACAGAAGCGAGAT-3， 下游引物 5，-GAATAATTGGCACCATAC-3，； beta-actin核心基因引物序列為 上游引物5’ -GTGGACATCCGCAAAGAC-3， 下游引物5，- AAAGGGTGTAACGCAACTAA-3，； 陰性質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品為正常人血清。
全文摘要
一種肝癌早期診斷試劑盒，該試劑盒中包括RNA提取試劑、RT-PCR反應(yīng)試劑、ADAM7核心基因引物、beta-actin核心基因引物和陰性質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品，通過半定量RT-PCR方法從基因水平上檢測早期肝癌患者血清中高表達(dá)且不易被降解的金屬蛋白酶ADAM7進(jìn)行早期肝癌的診斷，通過GelPro4.0軟件對結(jié)果進(jìn)行分析，檢測結(jié)果準(zhǔn)確可靠。該試劑盒特異性和靈敏度高，簡單容易操作，可重復(fù)性高，檢測成本低，便于大規(guī)模推廣應(yīng)用。
文檔編號C12Q1/68GK102433388SQ20121000073
公開日2012年5月2日 申請日期2012年1月4日 優(yōu)先權(quán)日2012年1月4日
發(fā)明者馮書營, 馮艷銘, 席守民, 李三強(qiáng), 李世朋, 楊五彪, 蒙宏葉, 馬靈筠 申請人:河南科技大學(xué)