一種基于生物活性檢測的火麻仁質(zhì)量控制評價方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及中藥質(zhì)量控制評價，特別是一種基于生物活性檢測的火麻仁質(zhì)量控制 評價方法。
【背景技術】
[0002] 當前中藥的質(zhì)量控制方法是主要測定其所含的一種或兩種化學成分，所測定的化 學成分稱為指標性成分，通過對指標性成分的定性或定量測定以反應該中藥合格與否或評 價質(zhì)量優(yōu)劣。由于目前絕大多數(shù)中藥藥效物質(zhì)不明確，所測定指標性成分并不能直接關聯(lián) 其藥效，所以對于這類中藥來說這種模式難以關聯(lián)或反映其臨床使用的安全性和有效性。 《中國藥典》2010年版編制大綱明確指出，要建立符合中醫(yī)藥特點的質(zhì)量標準體系，逐步由 單一指標性成分定性定量向活性、有效成分及生物測定的綜合檢測過渡，向多成分及和指 紋或特征圖譜整體質(zhì)量控制模式轉(zhuǎn)化。由此而制定的"中藥生物活性測定指導原則"已被 《中國藥典》（一部）2010年版附錄收載。
[0003] 對于成分復雜的中藥，《中國藥典》提倡建立與其功效相關的生物活性測定方法， 將生物活性測定法（又稱生物檢定bioassay)引入中藥質(zhì)量控制和評價體系，對于成分多 樣、結(jié)構(gòu)復雜、理化方法不能表征其含量、理化測定不能反映生物活性和療效的中藥能凸顯 其優(yōu)越性。
[0004] 當前，一種新的研宄日益受到重視：很多疾病的發(fā)生發(fā)展與腸道菌群結(jié)構(gòu)失調(diào)有 密切關系，許多中藥就是通過改善腸道菌群結(jié)構(gòu)來發(fā)揮療效的。如近日研宄發(fā)現(xiàn)，中藥黃 連治療糖尿病機制是黃連中的小檗堿在穿過腸道時，可能會改善腸道菌群的結(jié)構(gòu)，消滅 "有害菌"催生"有益菌"，減少內(nèi)毒素入血，減輕慢性炎癥，從而達到治療或者預防糖尿 病等代謝疾病的目的。
[0005] 傳統(tǒng)中藥火麻仁（Semen Cannabis)為?？浦参锎舐椋–annabis stativa L.)的干 燥成熟種子，具有潤腸通便，滋養(yǎng)補虛的功效，常用治療老年虛性便秘和習慣性便秘。據(jù)報 道，世界五大長壽地區(qū)之一，我國廣西巴馬瑤族自治縣百歲以上老人，其長壽原因除環(huán)境因 素之外，均有獨特的常年食用火麻仁油的生活習慣，他們的心血管疾病及老年性便秘的發(fā) 病率極小。同時，有研宄表明這些長壽老人腸道內(nèi)的益生菌群比例比其他地區(qū)的要高。上 述研宄結(jié)果提示火麻仁可能是通過調(diào)整腸道菌群而有益于人體健康。雖然火麻仁為常用中 藥，但是當前尚缺乏相應的生物活性測定方法用于火麻仁質(zhì)量控制評價。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 針對上述情況，為克服現(xiàn)有技術之缺陷，本發(fā)明之目的就是提供一種基于生物活 性檢測的火麻仁質(zhì)量控制評價方法，可有效解決火麻仁質(zhì)量控制評價的問題。
[0007] 本發(fā)明解決的技術方案是，由以下步驟實現(xiàn)：
[0008] (1)制備火麻仁供試藥物：
[0009] 火麻仁凈選去皮，115-125°C炒制13-17分鐘，榨油，得火麻仁油，即為火麻仁供試 藥物，密封于棕色玻璃瓶內(nèi)，避光、4 °C保存?zhèn)溆茫?br>[0010] ⑵制備梯度藥物培養(yǎng)基：
[0011] 稱取營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基16-20g，加入蒸餾水950-1050mL，攪拌加熱煮沸溶解成培養(yǎng) 基溶液，在培養(yǎng)基溶液中加入火麻仁供試藥物，制成火麻仁油體積濃度為12. 5%的液體培 養(yǎng)基，再進行倍比梯度稀釋，方法是，在火麻仁油體積濃度為12. 5%的液體培養(yǎng)基中加入同 體積培養(yǎng)基溶液（如ImL的火麻仁油體積濃度為12. 5 %的液體培養(yǎng)基再加入ImL的培養(yǎng)基 溶液），如此多次稀釋，共呈7個濃度梯度的含火麻仁油的梯度液體培養(yǎng)基，用0.1 M的HCL 分別調(diào)PH7. 20,120-125°C高壓滅菌15min，冷至常溫，備用；
[0012] ⑶細菌培養(yǎng)：
[0013] 分別取乳酸菌濃度為0. 5麥氏濁度的菌液20 μ L，接種于步驟（2)制備的7個濃度 梯度的含火麻仁油的梯度液體培養(yǎng)基中，35-39°C厭氧培養(yǎng)26-30小時；
[0014] 所述的乳酸菌為保加利亞乳桿菌、乳雙歧桿菌、嗜酸乳桿菌的一種；
[0015] (4)菌液最大吸收波長篩查：
[0016] 采用分光光度計測定菌液中乳酸菌的相對數(shù)量和波長，取菌液200 μ L加入96孔 板，加3個復孔，用多個波段掃描，繪制吸光度與波長關系圖，確定最大吸收波長；
[0017] (5)梯度液體培養(yǎng)基中細菌相對數(shù)量的測定與比較：
[0018] 將每梯度濃度的梯度液體培養(yǎng)基菌液各取200 μ L加入96孔板，同時對應取含相 同濃度火麻仁油培養(yǎng)基各200 μ L加入96孔板作為背景扣除，然后將96孔板放入酶標儀， 調(diào)整至菌液最大吸收波長，振搖5秒，測吸光度OD差值；
[0019] 實驗組吸光度差值為X，對照吸光值差值Υ，即：
[0020] X =實驗組OD-背景OD ;Y =對照組OD-背景OD
[0021] E = X-Y ;Ε > 0,表示對細菌增值，E < 0表示對細菌無增值；
[0022] T = [(X-Y)/Y] X 100 %
[0023] T :促菌率或抑菌率，正值是促菌，負值為抑菌；
[0024] (6)效價測定與計算：
[0025] 選擇果寡糖為對照品，供試藥物效價測定步驟同步驟（1)-(5)，為效價計算方便， 根據(jù)預實驗與對供試藥物的效價估計，對供試藥物與對照品的加樣量要保證反應時促菌 率T在45-55%，并保證供試藥物與對照品反應的量效關系曲線平行；當對照品效價值為 10.0 U 根據(jù)平行線測定原理，依照2010版《中國藥典》二部附錄XIV生物檢定統(tǒng)計法 項下規(guī)定的量反應平行線測定法中的2. 2法，進行供試藥物與對照品效價的對比檢定，實 現(xiàn)對火麻仁質(zhì)量控制評價；
[0026] 所述的火麻仁油劑量的線性量效范圍為0. 0075g · mL-1~0. 0625g · mL ―1，果聚糖 劑量的線性量效范圍為〇. 0030g · mL-1~0. 0120g · mL ―1，相關系數(shù)R > 98%。
[0027] 本發(fā)明首次建立以藥效為基礎的火麻仁質(zhì)量生物測定技術，作為藥典常規(guī)和化學 測定的補充與提高，能夠從多重角度共同把關其內(nèi)在質(zhì)量，完善現(xiàn)行質(zhì)量控制和評價方法 與標準，并能為其它藥效物質(zhì)不明確的中藥質(zhì)量控制與品質(zhì)評價研宄提供新的技術途徑， 易操作，實用性強，應用面廣，是中藥質(zhì)量控制和評價上的創(chuàng)新。
【附圖說明】
[0028] 圖1為本發(fā)明的火麻仁體外促進乳酸桿菌的研宄與測定的工藝路線圖。
[0029] 圖2為本發(fā)明的菌液最大吸收波長篩查的結(jié)果示意圖。
[0030] 圖3為本發(fā)明的不同培養(yǎng)液中細菌相對數(shù)量的測定與比較實驗的具體加樣設計 圖。
[0031] 圖4為本發(fā)明的不同培養(yǎng)液中細菌相對數(shù)量的測定與比較實驗的結(jié)果示意圖。
[0032] 圖5為本發(fā)明的供試品與工作對照品的量效關系曲線圖。
[0033] 圖6為本發(fā)明的16個批次的火麻仁樣品的促菌活性檢測結(jié)果的SPSS19. 0聚類分 析圖。
【具體實施方式】
[0034] 以下結(jié)合實施例對本發(fā)明的【具體實施方式】作詳細說明。
[0035] 本發(fā)明在具體實施中，可由以下實施例給出。
[0036] 實施例1
[0037] 本發(fā)明在具體實施中，由以下步驟實現(xiàn)：
[0038] (1)制備火麻仁供試藥物：
[0039] 火麻仁凈選去皮，120°C炒制15分鐘，榨油，得火麻仁油，即為火麻仁供試藥物，密 封于棕色玻璃瓶內(nèi)，避光、4°C保存?zhèn)溆茫?br>[0040] ⑵制備梯度藥物培養(yǎng)基：
[0041] 稱取營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基18g，加入蒸餾水lOOOmL，攪拌加熱煮沸溶解成培養(yǎng)基溶液， 在培養(yǎng)基溶液中加入火麻仁供試藥物，制成火麻仁油體積濃度為12. 5%的液體培養(yǎng)基，再 進行倍比梯度稀釋，方法是，在火麻仁油體積濃度為12. 5%的液體培養(yǎng)基中加入同體積培 養(yǎng)基溶液（如ImL的火麻仁油體積濃度為12. 5 %的液體培養(yǎng)基再加入ImL的培養(yǎng)基溶液）， 如此多次稀釋，共呈7個濃度梯度的含火麻仁油的梯度液體培養(yǎng)基，用0.1 M的HCL分別調(diào) pH7.20，121°C高壓滅菌15min，待冷至常溫，備用；
[0042] (3)細菌培養(yǎng)：
[0043] 分別取保加利亞乳桿菌濃度為0. 5麥氏濁度的菌液20