葡萄酒中多種吡唑類殺菌劑的固相萃取-液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于食品檢測領(lǐng)域，涉及固相萃取-液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（LC-MS/MS)，具 體是指一種葡萄酒中戊苯吡菌胺、氟唑菌酰胺、吡唑萘菌胺、吡咪唑、聯(lián)苯吡菌胺、呋吡菌胺 等6種吡唑類殺菌劑的檢測方法，尤其適用于葡萄酒。
【背景技術(shù)】
[0002] 葡萄酒生產(chǎn)主要原料的葡萄在田間管理過程中，為防止病蟲害發(fā)生，通常會噴施 一定量的農(nóng)藥，有些農(nóng)藥在葡萄酒生產(chǎn)發(fā)酵過程中不易去除分解，會不同程度地殘留在葡 萄酒中，給飲用者健康帶來潛在的危害。同樣果汁類或其他農(nóng)作物加工葡萄酒同樣存在上 述問題。
[0003] 殺菌劑是用于防治由各種病原微生物引起的植物病害的一類低毒農(nóng)藥，主要指殺 真菌劑。目前，吡唑類化合物因其具有高效、低毒以及吡唑環(huán)上取代基可多方位變換等優(yōu) 勢，已成為新型殺菌劑開發(fā)的熱點之一。這些殺菌劑具有特殊的作用方式，并有多種生物活 性。例如，唑菌胺酯（Pyraclostrobin)為甲氧基丙烯酸酯類線粒體電子傳遞抑制劑，顯示 了對許多植物真菌廣泛的抑制作用。而呋批菌胺（furametpyr)和聯(lián)苯批菌胺（bixafen)， 屬于琥珀酸脫氫酶抑制劑（SDHI)，可以抑制真菌呼吸的復合II琥珀酸脫氫酶。近些年來， 多種吡唑類殺菌劑被越來越廣泛地應用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的植物病害控制，如谷物，蔬菜和水 果等。
[0004] 因此，食品產(chǎn)品中出現(xiàn)殺菌劑殘留物并不意外。這些吡唑類殺菌劑雖然對環(huán)境相 對友好，但若在農(nóng)產(chǎn)品中使用不當，會造成其在食品中的高殘留問題，威脅人體健康。因此， 建立準確、可靠地測定葡萄酒中戊苯吡菌胺、氟唑菌酰胺、吡唑萘菌胺、吡咪唑、聯(lián)苯吡菌 胺、呋吡菌胺等6種吡唑類殺菌劑的含量非常重要。
[0005]目前，常規(guī)的分析方法可分為定性分析、定量分析和定性定量分析技術(shù)。定量分析 一般采用色譜技術(shù)和色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，色譜技術(shù)有氣相色譜和液相色譜等方法，色譜質(zhì) 譜聯(lián)用技術(shù)有液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用和氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用等方法；定性定量分析則要兼具 兩種技術(shù)為一體，檢測結(jié)果要同時提供目標物的結(jié)構(gòu)信息和數(shù)量信息，根據(jù)歐盟委員會非 強制執(zhí)行法案2002/657/EC的規(guī)定，對禁用藥物進行確證檢測的方法必須能提供結(jié)構(gòu)方面 的信息，且要達到該法案規(guī)定的4個確證點。
[0006]目前，由于國內(nèi)外無相關(guān)標準或文獻可循，因此，有必要對葡萄酒尤其是葡萄酒中 的戊苯吡菌胺、氟唑菌酰胺、吡唑萘菌胺、吡咪唑、聯(lián)苯吡菌胺、呋吡菌胺等6種吡唑類殺菌 劑的檢測方法進行研究，從而對葡萄酒中吡唑類殺菌劑進行監(jiān)測，同時為國內(nèi)葡萄酒企業(yè) 出口到歐盟等地區(qū)時，能出具符合歐盟委員會非強制執(zhí)行法案2002/657/EC的規(guī)定的檢測 數(shù)據(jù)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的是為了克服現(xiàn)有技術(shù)存在的缺點和不足，而提供一種一種葡萄酒中 吡唑類殺菌劑的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測方法。該方法結(jié)合固相萃取-液相色譜_串聯(lián)質(zhì) 譜法，能夠?qū)ζ咸丫浦形毂竭辆?、氟唑菌酰胺、吡唑萘菌胺、吡咪唑、?lián)苯吡菌胺、呋吡菌 胺等6種吡唑類殺菌劑同時進行測定，該方法具有準確、快速、靈敏度高的優(yōu)點，為葡萄酒 的快速檢測提供了可靠的檢測方法支持。
[0008] 為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案是包括以下步驟： (一) 待測樣品的制備：稱取4. 7-5. 3g葡萄酒樣本，葡萄酒樣本中加入超純水，混勻后得 到待檢液； (二） 待檢液的凈化：將固定相萃取柱進行預處理，將步驟(一）制備的待檢液上固定相 萃取柱，經(jīng)水和甲醇/水溶液淋洗除去雜質(zhì)，再用洗脫溶劑洗脫固定相萃取柱上的戊苯吡 菌胺、氟唑菌酰胺、吡唑萘菌胺、吡咪唑、聯(lián)苯吡菌胺、呋吡菌胺得到洗脫液，將洗脫液濃縮 富集后，用甲醇溶劑稀釋并經(jīng)〇. 22ym微孔濾膜過濾后得到待測樣品溶液； (三） 待測樣品溶液的檢測：分別配制戊苯吡菌胺、氟唑菌酰胺、吡唑萘菌胺、吡咪唑、聯(lián) 苯吡菌胺和呋吡菌胺溶液階梯濃度的混合標準工作溶液（〇. 4，1. 0，2. 0，5. 0，10. 0ng/ mL)，將步驟(二)中的待測樣品溶液和混合標準工作溶液在液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀上分別進 樣，獲得以標準溶液中戊苯吡菌胺、氟唑菌酰胺、吡唑萘菌胺、吡咪唑、聯(lián)苯吡菌胺和呋吡菌 胺的濃度為橫坐標，再以標準溶液中戊苯吡菌胺、氟唑菌酰胺、吡唑萘菌胺、吡咪唑、聯(lián)苯吡 菌胺和呋吡菌胺的峰面積為縱坐標的工作曲線，還有獲得可以確定母離子的戊苯吡菌胺、 氟唑菌酰胺、吡唑萘菌胺、吡咪唑、聯(lián)苯吡菌胺和呋吡菌胺的一級質(zhì)譜圖，確定母離子后，采 用子離子掃描獲得二級質(zhì)譜圖，然后從二級質(zhì)譜圖中選取定量離子和定性離子，然后用工 作曲線對定量離子進行定量計算獲得待測樣品溶液中戊苯吡菌胺、氟唑菌酰胺、吡唑萘菌 胺、吡咪唑、聯(lián)苯吡菌胺、呋吡菌胺的濃度。
[0009] 進一步設(shè)置是所述步驟(二)中的固定相萃取柱為WatersOasisHLBSPE柱，并通 過甲醇、水對SPE柱進行活化處理。
[0010] 進一步設(shè)置是所述步驟(二）中的淋洗溶劑為水和體積比為2/3的甲醇水混合溶 液，洗脫溶劑為甲醇。
[0011] 進一步設(shè)置是所述的步驟(三）中液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀的檢測參數(shù)為： 色譜柱：AgilentZORBAXEclipsePlus018反相柱； 流速：〇? 25ml,/min； 流動相：A為0. 1%乙酸水溶液；B為乙腈； 進樣量：5iiL; 色譜柱溫度：30 °C; 電噴霧離子源：負離子掃描，電壓為4500V; 離子源溫度：450 °C; 霧化氣壓力：50psi; 輔助氣流速：40psi; 氣簾氣壓力：20psi; 碰撞氣壓力：20psi。
[0012] 本發(fā)明的的原理和優(yōu)點： 采用上述方案，首先，本發(fā)明通過加入超純水對葡萄酒樣品進行稀釋， 其次，本發(fā)明還對由超純水稀釋得到的待檢液進行凈化處理，該凈化處理包括純化和 富集的過程。第一步純化：先將待檢液通過固相萃取小柱，依次經(jīng)過經(jīng)水和甲醇/水溶液淋 洗、甲醇洗脫；第二步富集：將第一步中純化的待檢液氮氣濃縮近干，然后加入甲醇溶液溶 解、經(jīng)0. 22ym微孔濾膜過濾，得到凈化的待檢液。該凈化后的待檢液則不會對檢測儀器造 成污染。本發(fā)明中固相萃取的SPE柱為WatersOasisHLBSPE柱，由于6種吡唑類殺菌劑 和其他雜質(zhì)的極性大小存在差異，在固相萃取柱上吸附產(chǎn)生保留差異，然后通過優(yōu)選的淋 洗條件和洗脫條件，達到凈化富集香料的目的。
[0013] 再次，本發(fā)明對于葡萄酒中戊苯吡菌胺、氟唑菌酰胺、吡唑萘菌胺、吡咪唑、聯(lián)苯吡 菌胺、呋吡菌胺等6種吡唑類殺菌劑成分的定性定量檢測分析是通過液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜 儀（LC-MS/MS)分析。先配置一組階梯形的標準工作溶液，然后將標準工作液和待檢液在液 相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀上分別進樣。待檢液中出現(xiàn)的色譜峰保留時間與標準工作溶液一致， 允許偏差小于±2.5 %，該色譜峰所對應的質(zhì)譜定性離子的相對豐度與濃度相當?shù)臉藴使?作溶液的相對豐度一致，而且相對豐度偏差不超過規(guī)定，則可確定該待檢液中含有吡唑類 殺菌劑。
[0014] 下面結(jié)合說明書附圖和【具體