耗光最后經第三二色鏡7反射、物鏡11聚焦后，照射到熒光物質上的同一點，使已經處于激發(fā)態(tài)的熒光粒子回到基態(tài)，喪失發(fā)射熒光的能力，而沒有被損耗光照射到的區(qū)域，即損耗光的光斑中圓環(huán)內圓沒有光的區(qū)域，處于激發(fā)態(tài)的熒光粒子可以從這個區(qū)域內發(fā)射出熒光。發(fā)出的熒光經物鏡11收集聚焦、第三二色鏡7透射、第二二色鏡6透射、第三濾光片13過濾雜光、透鏡14聚焦、針孔15過濾雜光后，被光電倍增管16所接收，通過分析控制系統(tǒng)17控制三維納米位移臺12的移動，可對熒光物質的每一個點進行激發(fā)和探測，從而得到每一個點的熒光光強參數(shù)，綜合這些參數(shù)可最終生成熒光物質的熒光圖像，實現(xiàn)顯微成像的目的。
[0069]通過雙光楔光程補償裝置來精密地調整損耗光的光程，以保證激發(fā)光和損耗光光程差滿足預期要求。激發(fā)光和損耗光的波長不是隨意選擇的，而是要根據(jù)熒光物質的特性進行選擇，不同的熒光物質，其能夠使它激發(fā)的激發(fā)光的波長和能夠使它損耗的損耗光的波長均不同，而激發(fā)光和損耗光的選擇可根據(jù)所要成像的熒光物質去查閱已有文獻。例如，當熒光物質為市售的型號為Alexa Fluor 488的熒光染料產品時，激發(fā)光的波長須為488nm，損耗光的波長須為592nm，所發(fā)出的熒光的波長為519nm，所用光源的波長范圍為400 ?1700nmo
[0070]激發(fā)光和損耗光光程補償原理說明(參見圖2和圖3):這里所說的光程指光波從光源出射到進入物鏡光束行進的距離換算為其在真空中行進的距離，由于激發(fā)光和損耗光均從同一個光源發(fā)出，剛從光源出射時，激發(fā)光波列和損耗光波列行進了相同的光程，是并列的(如圖2所示)，STED系統(tǒng)要求激發(fā)光先進入物鏡，之后間隔幾個皮秒損耗光脈沖才能進入物鏡，因而損耗光的光程要比激發(fā)光的光程長(或者說，要讓損耗光傳播的速度慢一點)，為此，本案采用的手段是增加一個雙光楔光程補償裝置，參見圖3，光程差為Wt =w0+Wl, ^為激發(fā)光波列的長度，Wtl為兩個波列的空間間隔，約為幾個皮秒對應的光程，激發(fā)光波列的長度為W1= tXc，t為光源脈沖的持續(xù)時間，c為真空中的光速。
[0071]雙光楔調節(jié)光程的原理說明:參見圖4，假設兩個光楔材料的折射率為n，光軸和光楔斜面的夾角為α，初始位置光束在光楔中傳播的距離為Itl,則光束傳播的光程為nX Itl(此處光程已等效換算成光在真空中行進的距離)，當采用雙光楔調節(jié)光程時，光楔I相對于光楔2沿斜面滑動了距離d，為簡便起見，假定第二光楔10不動，第一光楔9沿斜面滑動了距離d，此時光束在光楔中傳播的距離為I1，對應光束傳播的光程為IiXl1，則調節(jié)前后光束在光楔中傳播的距離變化為I1-1tl= dXcosa，光程變化量為(n-1) X (I ^ltl)=dXcosa X (n-1)，空氣中的折射率為I。
[0072]盡管本發(fā)明的實施方案已公開如上，但其并不僅僅限于說明書和實施方式中所列運用，它完全可以被適用于各種適合本發(fā)明的領域，對于熟悉本領域的人員而言，可容易地實現(xiàn)另外的修改，因此在不背離權利要求及等同范圍所限定的一般概念下，本發(fā)明并不限于特定的細節(jié)和這里示出與描述的圖例。
【主權項】
1.一種對熒光物質進行成像的超分辨顯微鏡，其特征在于，包括: 第一光路，其中的光線的波長選擇為適于激發(fā)該待成像的熒光物質產生處于激發(fā)態(tài)的焚光粒子的波長； 第二光路，其中設置有相位板，以使所述第二光路的照射面形成為環(huán)形光斑，且所述第二光路中光線的波長選擇為不能激發(fā)該待成像的熒光物質產生處于激發(fā)態(tài)的熒光粒子的波長； 雙光楔光程補償裝置，其設置在所述第二光路中，所述雙光楔光程補償裝置由折射率大于空氣折射率的透光材料制成，且所述光程調節(jié)器包括兩個含斜邊的光楔，兩個光楔的斜邊彼此可滑動移動地貼合，所述第二光路中的光線穿過兩個光楔的貼合部分。
2.如權利要求1所述的對熒光物質進行成像的超分辨顯微鏡，其特征在于，包括: 光源，其為超連續(xù)譜脈沖激光源，發(fā)出寬波長的脈沖光； 第一二色鏡，其位于所述光源的光路上，用于將所述寬波長的脈沖光分解為長波長和短波長兩路光，其中，短波長光波行進的光路為激發(fā)光光路，長波長光波行進的光路為損耗光光路； 第一濾光片，其位于所述激發(fā)光光路上，且只允許一個特定波長的激光透射，該透射出的特定波長的激光為激發(fā)光； 第二濾光片，其位于所述損耗光光路上，且只允許一個特定波長的激光透射，該透射出的特定波長的激光為損耗光； 熒光探測系統(tǒng)，其用于檢測熒光及其強度； 分析控制系統(tǒng)，其與所述熒光探測系統(tǒng)電連接，用于記錄和分析熒光強度，并最終實現(xiàn)顯微成像，以及三維納米位移臺的控制； 其中，所述相位板具有O?2 31的渦旋相位分布，用于將所述損耗光光束調制為空心光
3.如權利要求1所述的對熒光物質進行成像的超分辨顯微鏡，其特征在于，所述光楔呈直角梯形或直角三角形。
4.如權利要求2所述的對熒光物質進行成像的超分辨顯微鏡，其特征在于，還包括: 三維納米位移臺，其與所述分析控制系統(tǒng)電連接，用于承載熒光物質，并在X、Y、Z方向自由移動； 物鏡，其位于熒光物質上方，用于聚焦激發(fā)光和損耗光，并收集由熒光物質發(fā)出的熒光; 第三濾光片，其位于熒光光路上，用于濾除干擾光，透射熒光； 透鏡，其位于所述第三濾光片和熒光探測系統(tǒng)之間，用于聚焦熒光； 針孔，其位于所述透鏡和熒光探測系統(tǒng)之間，用于濾除干擾光。
5.如權利要求4所述的對熒光物質進行成像的超分辨顯微鏡，其特征在于，還包括: 反射鏡，其位于所述第二濾光片和相位板之間，用于反射損耗光； 第二二色鏡，其位于所述第三濾光片和物鏡之間，用于反射所述激發(fā)光和透射熒光；第三二色鏡，其位于所述第二二色鏡和物鏡之間，用于反射所述損耗光，透射激發(fā)光和熒光。
6.如權利要求5所述的對熒光物質進行成像的超分辨顯微鏡，其特征在于，所述激發(fā)光從所述光源出發(fā)，依次經過第一二色鏡、第一濾光片、第二二色鏡、第三二色鏡和物鏡，最終到達熒光物質。
7.根據(jù)權利要求5所述的對熒光物質進行成像的超分辨顯微鏡，其特征在于，所述損耗光從所述光源出發(fā)，依次經過第一二色鏡、第二濾光片、反射鏡、相位板、雙光楔光程補償裝置、第三二色鏡和物鏡，最終到達熒光物質。
8.根據(jù)權利要求5所述的對熒光物質進行成像的超分辨顯微鏡，其特征在于，所述熒光物質發(fā)出的熒光依次經過物鏡、第三二色鏡、第二二色鏡、第三濾光片、透鏡和針孔，最終到達熒光探測系統(tǒng)。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種基于雙光楔光程補償?shù)某直骘@微鏡，它利用激發(fā)光光束激發(fā)熒光物質發(fā)出熒光，在損耗光光路中引入雙光楔光程補償裝置，損耗光經過0-2π相位板調制形成空心光束，通過雙光楔光程補償裝置對光程進行補償，以使損耗光和激發(fā)光的光程滿足顯微鏡對損耗光和激發(fā)光的光程差的特定要求。樣本中的熒光物質被激發(fā)光激發(fā)，并且被損耗光損耗后剩下的熒光成分被物鏡收集，通過分析該熒光物質中每個位置的熒光強度來實現(xiàn)成像功能。本發(fā)明采用雙光楔調節(jié)損耗光的光程，結構簡單，光程補償精度更高，操作更加快速簡便；采用超連續(xù)譜脈沖光源同時作為激發(fā)光光源和損耗光光源，簡化了儀器結構，減小了光照對熒光物質的漂白影響。
【IPC分類】G01N21-64
【公開號】CN104568874
【申請?zhí)枴緾N201410804305
【發(fā)明人】張運海, 昌劍
【申請人】中國科學院蘇州生物醫(yī)學工程技術研究所
【公開日】2015年4月29日
【申請日】2014年12月22日