免疫熒光是一種用于使用熒光顯微鏡的光學(xué)顯微技術(shù)的技術(shù)，并且主要用于微生物樣品。該技術(shù)利用抗體對(duì)其抗原的特異性，使熒光染料靶向細(xì)胞內(nèi)的特定生物分子靶標(biāo)，因此通過(guò)樣品使靶標(biāo)分子的分布可視化。免疫熒光是廣泛使用的免疫染色的實(shí)例，并且是利用熒光團(tuán)使抗體的位置可視的免疫組織化學(xué)的具體實(shí)例。CN103642261、WO2013153687、JP2012224646、US2012296098、WO2012149180、EP2312317、US20110143387、JP2010037511和US4937198描述了熒光探針及其用途的實(shí)例。

Nielsen等(Methods 22，71-76，2000)、WO9613722、WO2009078876、EP0957365、WO2010141249和US2006105397描述了熒光偏振免疫測(cè)定法，并且其可用于快速、準(zhǔn)確地檢測(cè)抗體或抗原。該測(cè)定法是基于溶液中小分子的旋轉(zhuǎn)比大分子更快以及旋轉(zhuǎn)率可通過(guò)熒光偏振確定的原則。當(dāng)樣品中的抗體與標(biāo)記有熒光探針的抗體的特異性抗原一起孵育時(shí)，可以通過(guò)熒光偏振檢測(cè)樣品中抗體-抗原復(fù)合物的存在。該技術(shù)的問(wèn)題是，為了檢測(cè)給定的抗體，需要該抗體的特異性抗原，這使得該測(cè)定對(duì)許多公司來(lái)說(shuō)是昂貴的。該技術(shù)的另一個(gè)問(wèn)題是不適合用于定量檢測(cè)樣品中的抗體。

日本專利申請(qǐng)?zhí)?005-337805描述了一種使用熒光偏振測(cè)定抗體或抗原的方法，在一個(gè)實(shí)施方案中，使用重組通用(generic)抗體結(jié)合蛋白(蛋白A)和短壽命熒光染料(Alexa 647)的綴合物定量測(cè)定人IgG。該日本文獻(xiàn)描述了使用濃度為1nM或10nM的熒光標(biāo)記蛋白A，其分別相當(dāng)于0.00005或0.0005mg/ml。預(yù)期該蛋白A與抗體按1:1的比例結(jié)合，并且由于它們的分子量分別為50,000Da和150,000Da，這意味著按1:3的重量比結(jié)合。從而1mg的蛋白A將結(jié)合3mg的抗體，因此將是“飽和的”，所述“飽和的”意味著抗體濃度的任何增加不應(yīng)導(dǎo)致偏振值的增加，因?yàn)椴粫?huì)發(fā)生更多的結(jié)合。因此，1nM和10nM的蛋白A將具有在0.000015mg/ml和0.00015mg/ml抗體濃度的IgG濃度下飽和(即不增加任何更多的特異性結(jié)合)的FP信號(hào)。這顯然不會(huì)出現(xiàn)在該日本專利的附圖中。唯一明顯的增加發(fā)生在該飽和極限之后，其中偏振的任何變化不是由于蛋白A與抗體的特異性結(jié)合，而是由于人為效應(yīng)，例如隨著抗體濃度增加粘度增加。因此，該文獻(xiàn)中呈現(xiàn)的數(shù)據(jù)表明，在實(shí)踐中該發(fā)明不起作用。

本發(fā)明的目的是克服上述問(wèn)題中的至少一個(gè)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明是基于如下發(fā)現(xiàn)：可以使用熒光偏振和示蹤劑來(lái)測(cè)定樣品中的準(zhǔn)確和靈敏的抗體濃度或滴度，所述示蹤劑包括與通用免疫球蛋白結(jié)合蛋白(如蛋白A、蛋白G、蛋白A/G或蛋白L(以下稱為“通用抗體結(jié)合蛋白”))綴合的長(zhǎng)壽命熒光染料。這些蛋白質(zhì)結(jié)合到所有免疫球蛋白G(IgG)分子的恒定區(qū)，并且因此可以用于測(cè)定任何IgG分子的濃度。圖6顯示了使用與短壽命染料相比的長(zhǎng)壽命染料的影響。此外，本申請(qǐng)人已經(jīng)出乎意料地發(fā)現(xiàn)，除去蛋白質(zhì)的一部分(例如，除去了一個(gè)或多個(gè)抗體結(jié)合位點(diǎn)或非抗體結(jié)合位點(diǎn))的截短通用抗體結(jié)合蛋白的使用提供了靈敏度的進(jìn)一步提高。圖7顯示了使用與部分截短蛋白質(zhì)(mw29KD)相比的高度截短IgG結(jié)合蛋白(mw7kD)的影響。

在第一方面中，本發(fā)明提供了一種測(cè)定液體樣品中抗體滴度的方法，包括以下步驟：

將液體樣品與抗體結(jié)合探針在反應(yīng)室中一起孵育以提供反應(yīng)混合物，所述抗體結(jié)合探針包括與熒光染料(通常為長(zhǎng)壽命熒光染料)綴合的通用抗體結(jié)合蛋白；

測(cè)定反應(yīng)室中的反應(yīng)混合物的熒光偏振，以檢測(cè)激發(fā)光和發(fā)射光之間的偏振變化；和

使偏振變化與所述樣品的抗體滴度相關(guān)聯(lián)。

在使用長(zhǎng)壽命熒光染料的實(shí)施方案中，優(yōu)選地，所述長(zhǎng)壽命熒光染料的熒光壽命為至少4ns。優(yōu)選地，所述長(zhǎng)壽命熒光染料的熒光壽命為至少5ns。優(yōu)選地，所述長(zhǎng)壽命熒光染料的熒光壽命為至少6ns。優(yōu)選地，所述長(zhǎng)壽命熒光染料的熒光壽命為至少7ns。優(yōu)選地，所述長(zhǎng)壽命熒光染料的熒光壽命為至少8ns。優(yōu)選地，所述長(zhǎng)壽命熒光染料的熒光壽命為至少9ns。優(yōu)選地，所述長(zhǎng)壽命熒光染料的熒光壽命為至少10ns。優(yōu)選地，所述長(zhǎng)壽命熒光染料的熒光壽命為至少15ns。優(yōu)選地，所述長(zhǎng)壽命熒光染料的熒光壽命為至少20ns。

優(yōu)選地，所述熒光染料是FITC。優(yōu)選地，所述熒光染料選自FITC和壽命為至少5ns的長(zhǎng)壽命熒光探針。

優(yōu)選地，所述通用抗體結(jié)合蛋白是蛋白A或蛋白。

優(yōu)選地，所述通用抗體結(jié)合蛋白是截短通用抗體結(jié)合蛋白。

優(yōu)選地，所述樣品是細(xì)胞培養(yǎng)液。

優(yōu)選地，所述細(xì)胞是真核的或原核的生產(chǎn)細(xì)胞。

優(yōu)選地，所述反應(yīng)室是多孔板的孔。

優(yōu)選地，所述通用抗體結(jié)合蛋白(即通用IgG結(jié)合蛋白)的分子量不大于15kD以及所述熒光染料的壽命為至少5ns(理想地為至少10或15ns)。更優(yōu)選地，所述通用抗體結(jié)合蛋白(即通用IgG結(jié)合蛋白)的分子量不大于10kD以及所述熒光染料的壽命為至少5ns(理想地為至少10或15ns)。理想地，所述通用抗體結(jié)合蛋白(即通用IgG結(jié)合蛋白)的分子量不大于5kD以及所述熒光染料的壽命為至少5ns(理想地為至少10或15ns)。

在第二方面中，本發(fā)明涉及測(cè)定多個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)樣本中抗體滴度的快速、高通量的方法，所述細(xì)胞培養(yǎng)樣品包括抗體生產(chǎn)細(xì)胞(通常是IgG生產(chǎn)細(xì)胞，理想地是單克隆IgG生產(chǎn)細(xì)胞)，所述方法包括以下步驟：

將微量滴定板的單個(gè)孔中的每個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)樣品與抗體結(jié)合探針一起孵育以提供多個(gè)反應(yīng)混合物，所述抗體結(jié)合探針包括與長(zhǎng)壽命熒光染料綴合的通用抗體結(jié)合蛋白(即通用IgG結(jié)合蛋白)；

測(cè)定孔中的反應(yīng)混合物的熒光偏振，以檢測(cè)激發(fā)光和發(fā)射光之間的偏振變化；和

使偏振變化與所述細(xì)胞培養(yǎng)樣品的抗體滴度相關(guān)聯(lián)。

在一個(gè)實(shí)施方案中，所述多個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)樣品包括一組克隆生產(chǎn)細(xì)胞。因此，本發(fā)明還涉及測(cè)定一組克隆生產(chǎn)細(xì)胞中的抗體滴度的快速、高通量的方法。

通常，該方法使用能夠同時(shí)在微量滴定板的多個(gè)孔上進(jìn)行熒光偏振測(cè)定的熒光偏振分析儀。

本發(fā)明還提供了適于實(shí)施本發(fā)明方法的試劑盒，以及其包含(a)包含與熒光染料(優(yōu)選長(zhǎng)壽命熒光染料)綴合的通用抗體結(jié)合蛋白的抗體結(jié)合探針，和(b)熒光偏振分析儀。

優(yōu)選地，所述通用抗體結(jié)合蛋白是截短的。

優(yōu)選地，所述通用抗體結(jié)合蛋白是IgG結(jié)合蛋白。

優(yōu)選地，所述IgG結(jié)合蛋白是蛋白G。

優(yōu)選地，所述通用抗體結(jié)合蛋白包括分子量小于15kD或10kD的截短蛋白G。

優(yōu)選地，所述熒光染料是FITC或其熒光壽命為至少5ns。

本發(fā)明還涉及一種熒光染料與通用抗體結(jié)合蛋白的綴合物。

在一個(gè)實(shí)施方案中，所述通用抗體結(jié)合蛋白是截短的。

在一個(gè)實(shí)施方案中，所述通用抗體結(jié)合蛋白的分子量小于30kD。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述通用抗體結(jié)合蛋白的分子量小于25kD。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述通用抗體結(jié)合蛋白的分子量小于20kD。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述通用抗體結(jié)合蛋白的分子量小于15kD。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述通用抗體結(jié)合蛋白的分子量小于10kD。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述通用抗體結(jié)合蛋白的分子量小于8kD。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述通用抗體結(jié)合蛋白的分子量小于5kD。

在一個(gè)實(shí)施方案中，所述熒光染料是長(zhǎng)壽命熒光染料。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述熒光染料的壽命為至少4ns。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述熒光染料的壽命為至少5ns。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述熒光染料是FITC或其壽命為至少4ns。

通常，該方法能夠準(zhǔn)確地測(cè)定抗體濃度的濃度范圍為1-30mg/L，優(yōu)選為1-40mg/L，并理想地為1-50mg/L。

附圖說(shuō)明

圖1：在存在IgG的情況下，丹磺酰標(biāo)記的蛋白A的熒光偏振影響。

圖2：在存在IgG的情況下，F(xiàn)ITC標(biāo)記的蛋白G的熒光偏振影響。

圖3：在存在稀釋在CD-CHO培養(yǎng)基中的IgG的情況下，F(xiàn)ITC標(biāo)記的蛋白G的熒光偏振影響。

圖4：在存在稀釋在水中的IgG的情況下，F(xiàn)ITC標(biāo)記的蛋白G的熒光偏振影響。

圖5：在存在稀釋在水中的未標(biāo)記的蛋白A的情況下，F(xiàn)ITC標(biāo)記的蛋白G的熒光偏振影響，。圖6：在存在不同濃度的稀釋在CD-CHO中的IgG的情況下，三種不同的示蹤劑的熒光偏振影響。所述示蹤劑是蛋白質(zhì)G與(1)BIODOPY(壽命為5ns)、(2)FITC(壽命為4ns)和(3)Alexa647(壽命為1ns)偶聯(lián)的綴合物。所述短壽命染料(Alexa 647)提供一個(gè)可以忽略不計(jì)的信號(hào)，而較長(zhǎng)壽命染料提供很好的信號(hào)。

圖7：在存在不同濃度的稀釋在CD-CHO中的IgG的情況下，兩種不同的示蹤劑的熒光偏振影響。所述示蹤劑是FITC(壽命為4ns)與(1)蛋白G(完整的G)和(2)截去兩個(gè)IgG結(jié)合位點(diǎn)的截短蛋白G(gb1)偶聯(lián)的綴合物。顯然，使用包含高度截短的蛋白G的綴合物產(chǎn)生最大的信號(hào)。

圖8：在存在不同濃度的稀釋在CD-CHO中的IgG的情況下，不同示蹤劑的熒光偏振影響。所述示蹤劑是蛋白G與方酸菁輪烷染料偶聯(lián)的綴合物，所述方酸菁輪烷染料在405nm下吸收并且壽命為約9ns。顯然，使用更長(zhǎng)壽命的染料提供了很好的信號(hào)。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明涉及一種測(cè)定(優(yōu)選定量測(cè)定)在液體樣品(通常是細(xì)胞培養(yǎng)樣品，以及理想地為包括單克隆抗體生產(chǎn)細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)樣品)中抗體(通常是IgG抗體)的存在的方法。該方法使用熒光偏振分析來(lái)檢測(cè)抗體(通常是IgG抗體)和通用抗體結(jié)合探針之間的結(jié)合。所述抗體結(jié)合探針包括通用抗體結(jié)合蛋白，例如與熒光探針(染料)(通常是長(zhǎng)壽命熒光探針(染料)，如丹磺酰)綴合的通用IgG結(jié)合蛋白(如蛋白A、G、L、A/G)。由于所述探針包括通用IgG結(jié)合示蹤劑，其能夠用于任何IgG抗體的測(cè)定中，并且不針對(duì)任何特定的IgG抗體。在使用中，將所述樣品與抗體結(jié)合探針一起孵育，分析通過(guò)所述樣品或每個(gè)樣品中的探針發(fā)射的光以檢測(cè)熒光偏振，并且使檢測(cè)的熒光偏振的水平與所述樣品或每個(gè)樣品中的抗體滴度相關(guān)聯(lián)。

在本說(shuō)明書(shū)中，術(shù)語(yǔ)“抗體”應(yīng)理解為是指人源化或非人源化的免疫球蛋白，例如單克隆或多克隆形式的IgG，IgA，IgE或IgM免疫球蛋白或它們的片段。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述抗體是IgG分子，優(yōu)選單克隆IgG分子。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述抗體是人抗體。

在本說(shuō)明書(shū)中，術(shù)語(yǔ)“測(cè)定反應(yīng)室中樣品的熒光偏振”應(yīng)理解為是指用與熒光染料的激發(fā)波長(zhǎng)相對(duì)應(yīng)波長(zhǎng)的平面偏振光激發(fā)樣品，并且在兩個(gè)平面中檢測(cè)由熒光染料以適當(dāng)?shù)陌l(fā)射波長(zhǎng)發(fā)射的光強(qiáng)度，其中一個(gè)平面是平行于激發(fā)平面的平面，以及其中一個(gè)平面是垂直于激發(fā)光的平面。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述激發(fā)平面是垂直或水平的，并且在垂直和水平平面中檢測(cè)發(fā)射光。發(fā)射強(qiáng)度從激發(fā)平面(即垂直的)移動(dòng)到垂直平面(即水平的)的程度(即激發(fā)光和發(fā)射光之間的偏振的變化)是熒光染料的旋轉(zhuǎn)度的函數(shù)。當(dāng)探針標(biāo)記的抗體結(jié)合蛋白與抗體結(jié)合時(shí)，該復(fù)合物將比探針標(biāo)記的抗體結(jié)合蛋白旋轉(zhuǎn)得慢，導(dǎo)致發(fā)射光的偏振增加。

術(shù)語(yǔ)“使偏振的變化與抗體濃度相關(guān)聯(lián)”應(yīng)理解為是指基于由熒光探針發(fā)射的光的偏振的變化計(jì)算樣品的抗體濃度。計(jì)算抗體濃度的方法包括從抗體的已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線推算抗體濃度，或通過(guò)計(jì)算解離常數(shù)和必要參數(shù)，并從第一性原理推算濃度。也可以使用競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合測(cè)定法來(lái)計(jì)算抗體濃度。

在本說(shuō)明書(shū)中，術(shù)語(yǔ)“快速，高通量”應(yīng)理解為是指該方法可以在1小時(shí)或更短時(shí)間內(nèi)進(jìn)行，優(yōu)選小于30分鐘。

本文所用的術(shù)語(yǔ)“抗體滴度”或“抗體濃度”是指在給定時(shí)間點(diǎn)存在于樣品中的抗體的量，通常是重組抗體，理想地是重組單克隆抗體。通常，所述樣品是細(xì)胞培養(yǎng)樣品。優(yōu)選地，所述樣品是來(lái)自細(xì)胞培養(yǎng)樣品的上清液。所述滴度或濃度可以以絕對(duì)術(shù)語(yǔ)或相對(duì)術(shù)語(yǔ)進(jìn)行定量。通常，滴度或濃度是指單位體積培養(yǎng)物中產(chǎn)物的重量-克/升(g/L)是常用的度量。

本文所用的術(shù)語(yǔ)“樣品”應(yīng)理解為是指液體樣品，例如細(xì)胞培養(yǎng)樣品或源自細(xì)胞培養(yǎng)樣品的上清液。優(yōu)選地，所述細(xì)胞是生產(chǎn)細(xì)胞(即經(jīng)基因改良以產(chǎn)生重組蛋白的細(xì)胞)，例如原核生產(chǎn)細(xì)胞(即大腸桿菌)或真核生產(chǎn)細(xì)胞(即CHO細(xì)胞)。原核生產(chǎn)細(xì)胞和真核生產(chǎn)細(xì)胞的實(shí)例都是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。所述樣品也可以是血液或血液衍生物，例如血漿或血清。優(yōu)選地，在確定抗體濃度之前，從樣品中除去細(xì)胞。

術(shù)語(yǔ)“通用抗體結(jié)合蛋白”應(yīng)理解為是指結(jié)合到抗體(例如IgG、IgA、IgE或IgM抗體)恒定區(qū)的蛋白質(zhì)、肽、多肽或非蛋白配體(如適配體)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述通用抗體結(jié)合蛋白是通常對(duì)IgG抗體具有特異性的通用IgG結(jié)合蛋白，或IgG結(jié)合變體或其片段。通用IgG結(jié)合蛋白的實(shí)例包括蛋白A、蛋白G、蛋白A/G，和蛋白質(zhì)L，或抗體結(jié)合變體或它們的片段(http://www.piercenet.com/method/antibody-igg-binding-proteins)。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述通用抗體結(jié)合蛋白是截短通用抗體結(jié)合蛋白，優(yōu)選是通常包含多個(gè)同源抗體結(jié)合結(jié)構(gòu)域的蛋白，并且其被修飾以除去一個(gè)或多個(gè)抗體結(jié)合結(jié)構(gòu)域。優(yōu)選地，所述抗體結(jié)合蛋白是蛋白G。優(yōu)選地，所述抗體結(jié)合蛋白是截短蛋白G。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述蛋白質(zhì)是從Sigma Aldrich(Paisley，UK)獲得的截短蛋白G。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述通用抗體結(jié)合蛋白的分子量小于30kD。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述通用抗體結(jié)合蛋白的分子量小于25kD。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述通用抗體結(jié)合蛋白的分子量小于20kD。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述通用抗體結(jié)合蛋白的分子量小于15kD。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述通用抗體結(jié)合蛋白的分子量小于10kD。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述通用抗體結(jié)合蛋白的分子量小于8kD。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述通用抗體結(jié)合蛋白的分子量小于5kD。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述通用抗體結(jié)合蛋白是適配體(即DNA適配體)。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述通用抗體結(jié)合蛋白是抗體的片段，例如單鏈可變片段。

在本說(shuō)明書(shū)中，術(shù)語(yǔ)“截短通用抗體結(jié)合蛋白”應(yīng)理解為是指被修飾以除去部分蛋白質(zhì)的通用抗體結(jié)合蛋白。在熒光偏振測(cè)定中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，減少通用抗體結(jié)合蛋白的MW會(huì)增加綴合物的信號(hào)。在一個(gè)實(shí)施方案中，除去至少一個(gè)抗體結(jié)合區(qū)。在一個(gè)實(shí)施方案中，除去不參與抗體結(jié)合的蛋白部分。該術(shù)語(yǔ)通常包括截短蛋白質(zhì)和通用抗體結(jié)合蛋白的片段。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述片段包括至少一個(gè)抗體結(jié)合結(jié)構(gòu)域(例如實(shí)施例7中的gb1)。以截短蛋白G為例，可以除去三個(gè)抗體結(jié)合區(qū)中的一個(gè)或兩個(gè)。以截短蛋白A為例，可以除去四個(gè)抗體結(jié)合區(qū)中的一個(gè)、兩個(gè)或三個(gè)。截短蛋白質(zhì)的實(shí)例是來(lái)自Sigma、Abcam和Molecular Probes的重組蛋白G，其分子量為約20kD的并且被修飾為除去了至少一個(gè)IgG結(jié)合結(jié)構(gòu)域。另一個(gè)實(shí)例是肽gb1(參見(jiàn)以下的實(shí)施例7)，其是蛋白G的片段和分子量為7kD的組氨酸標(biāo)簽(his-tag)。Wilton等描述了截短蛋白G的片段(Proteins:Structure,Function and Bioinformatics,Vol.71,Issue 3,P1432-1440)。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述截短通用抗體結(jié)合蛋白是MW小于30kD的截短蛋白G。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述截短通用抗體結(jié)合蛋白是MW小于25kD的截短蛋白G。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述截短通用抗體結(jié)合蛋白是MW小于20kD的截短蛋白G。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述截短通用抗體結(jié)合蛋白是MW小于15kD的截短蛋白G。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述截短通用抗體結(jié)合蛋白是MW小于10kD的截短蛋白G。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述截短通用抗體結(jié)合蛋白是MW小于8kD的截短蛋白G。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述截短通用抗體結(jié)合蛋白是MW小于55kD的截短蛋白A。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述截短通用抗體結(jié)合蛋白是MW小于50kD的截短蛋白A。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述截短通用抗體結(jié)合蛋白是MW小于40kD的截短蛋白A。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述截短通用抗體結(jié)合蛋白是MW小于30kD的截短蛋白A。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述截短通用抗體結(jié)合蛋白是MW小于20kD的截短蛋白A。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述截短通用抗體結(jié)合蛋白是MW小于15kD的截短蛋白A。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述截短通用抗體結(jié)合蛋白是MW小于10kD的截短蛋白A。

術(shù)語(yǔ)“變體”還意欲包括通用抗體結(jié)合蛋白的模擬物(即肽模擬物)和化學(xué)衍生物，即其中通用抗體結(jié)合蛋白的一個(gè)或多個(gè)殘基是通過(guò)功能側(cè)基的反應(yīng)而化學(xué)衍生的。術(shù)語(yǔ)變體中還包括通用抗體結(jié)合蛋白，其中天然存在的氨基酸殘基被氨基酸類似物替代。Dinon等描述了通用抗體結(jié)合蛋白變體的實(shí)例(J.Mol.Recognit.2011Nov-Dec；24(6))。

本發(fā)明中的和用于本發(fā)明的蛋白質(zhì)和多肽(包括它們的變體和片段)可以全部或部分通過(guò)化學(xué)合成或通過(guò)核酸表達(dá)而產(chǎn)生。本發(fā)明中的和用于本發(fā)明的蛋白質(zhì)和肽可以很容易地根據(jù)本領(lǐng)域公知的現(xiàn)有的標(biāo)準(zhǔn)液體或優(yōu)選固相肽合成方法來(lái)制備(例如，參見(jiàn)J.M.Stewart and J.D.Young,Solid Phase Peptide Synthesis,2nd edition,Pierce Chemical Company,Rockford,Illinois(1984),in M.Bodanzsky and A.Bodanzsky,The Practice of Peptide Synthesis,Springer Verlag,New York(1984)。

在本說(shuō)明書(shū)中，術(shù)語(yǔ)“熒光探針”或“熒光染料”或“熒光團(tuán)”應(yīng)理解為是指可在光激發(fā)下重新發(fā)光的熒光化學(xué)物質(zhì)。熒光探針的實(shí)例是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的，包括熒光蛋白質(zhì)如GFP、YFP和RFP，以及非蛋白質(zhì)有機(jī)熒光團(tuán)，其包括四吡咯衍生物、芘衍生物、呫噸衍生物和花青衍生物。

在本說(shuō)明書(shū)中，術(shù)語(yǔ)“長(zhǎng)壽命熒光染料”應(yīng)理解為是指熒光壽命為至少3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、18或20納秒的熒光染料。優(yōu)選地，所述熒光染料的熒光壽命為至少4ns。優(yōu)選地，所述熒光染料的熒光壽命為至少5ns。優(yōu)選地，所述熒光染料的熒光壽命為5-100ns、5-50ns、5-40ns、5-30ns或5-25ns，通常為10-100ns、10-50ns、10-40ns、10-30ns或5-25ns，以及理想地為15-100ns、15-50ns、15-40ns、15-30ns或15-25ns。優(yōu)選地，所述熒光染料的熒光壽命為4-100ns、4-50ns、4-40ns、4-30ns或4-25ns，通常為10-100ns、10-50ns、10-40ns、10-30ns或5-25ns，以及理想地為15-100ns、15-50ns、15-40ns、15-30ns或15-25ns。在下表中提供了熒光染料的實(shí)例，包括長(zhǎng)壽命熒光染料。

術(shù)語(yǔ)“生產(chǎn)細(xì)胞”是指用于產(chǎn)生特定的所需蛋白質(zhì)的細(xì)胞。通常，基因修飾所述細(xì)胞以包括編碼所需蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)基因的一個(gè)或多個(gè)副本，其通常在特定啟動(dòng)子的控制下。因此，所述特定蛋白質(zhì)通常是重組蛋白質(zhì)。生產(chǎn)細(xì)胞是本領(lǐng)域公知的，并且包括例如中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO)細(xì)胞或幼倉(cāng)鼠腎(BHK)細(xì)胞。理想地，所述生產(chǎn)細(xì)胞是CHO細(xì)胞。通常，所述生產(chǎn)細(xì)胞是單克隆抗體生產(chǎn)細(xì)胞。

在本說(shuō)明書(shū)中，術(shù)語(yǔ)“高通量”應(yīng)理解為是指可以同時(shí)測(cè)定大量樣品(例如至少20、50、90、120，即20-500)的方法。

在本說(shuō)明書(shū)中，術(shù)語(yǔ)“多孔板”是指具有多個(gè)孔(例如至少10、15、20、30、40、50、60、70、80、90、100或384個(gè)孔)的板。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述板可以是實(shí)心的非柔性板，或者可以作為柔性材料卷提供。

在本說(shuō)明書(shū)中，術(shù)語(yǔ)“克隆生產(chǎn)細(xì)胞的組”應(yīng)理解為是指來(lái)源于單細(xì)胞系并包含2至500或更多個(gè)克隆生產(chǎn)細(xì)胞群的克隆生產(chǎn)細(xì)胞群的組。產(chǎn)生克隆生產(chǎn)細(xì)胞的組的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的，并被描述于Production of recombinant protein therapeutics in cultivated mammalian cells(2004),Wurm,Florian M,New York,NY,Nature Biotechnology 22(2004),S.1393-1398。通常，所述克隆生產(chǎn)細(xì)胞群的組包括10-500、20-500、30-500、40-500、50-500、60-500、70-500、80-500、90-500或100-500個(gè)克隆細(xì)胞群。通常，所述克隆生產(chǎn)細(xì)胞群的組包括100-500、100-400、150-400、150-350個(gè)克隆細(xì)胞群。

在本說(shuō)明書(shū)中，術(shù)語(yǔ)“熒光偏振分析儀”應(yīng)理解為是指一儀器，其能夠接收樣品并用波長(zhǎng)對(duì)應(yīng)于熒光染料的激發(fā)波長(zhǎng)的平面偏振光激發(fā)樣品，在兩個(gè)平面中檢測(cè)熒光染料以適當(dāng)?shù)陌l(fā)射波長(zhǎng)發(fā)射的光強(qiáng)度，其中一個(gè)平面平行于發(fā)射平面并且另一個(gè)平面垂直于發(fā)射平面，以及通常確定激發(fā)光和發(fā)射光之間的偏振的變化。通常，該儀器能夠接收和讀取包含在多孔板中的多個(gè)樣品，通常以高通量方式。熒光偏振分析儀的例子包括BMG PheraStar、BMG ClarioStar、Tecan Infinite F500。

實(shí)驗(yàn)

使用熒光標(biāo)記的通用IgG結(jié)合蛋白評(píng)估IgG含量的實(shí)驗(yàn)方法。

丹磺酰蛋白A是由丹磺酰氯(5-(二甲氨基)萘-1-磺酰氯)(Sigma，UK)與來(lái)自金黃色葡萄球菌(staphylococcus aerueus)(Sigma，UK)的重組蛋白A的共價(jià)連接產(chǎn)生。

FITC標(biāo)記的截短蛋白G是從Sigma,UK獲得的。

免疫球蛋白G(人，活性)是從Abcam(Cambridge,UK)獲得的。

使用BMG ClarioStar(Bucks，UK)進(jìn)行熒光偏振測(cè)量。在黑色半?yún)^(qū)96‘非結(jié)合表面’的孔板(Corning,UK,產(chǎn)品3686)中進(jìn)行讀數(shù)。作為陰性對(duì)照的目標(biāo)mP值為70mP。從熒光減去空白計(jì)算mP值。

評(píng)估丹磺酰標(biāo)記的截短蛋白A綴合物。

這里將25ul的0.03mg/mL的稀釋在水中的丹磺酰蛋白A與25ul的稀釋在水中的全長(zhǎng)人活性IgG1混合。樣品混合后立即讀數(shù)。圖1顯示了存在IgG的情況下，丹磺酰標(biāo)記的蛋白A的熒光偏振影響。顯然，使用該技術(shù)可以在該范圍內(nèi)精確定量IgG。隨著IgG濃度的變化，mP有明顯的劑量響應(yīng)變化。

評(píng)估FITC截短蛋白G綴合物

使用市售FITC綴合的截短蛋白G(Sigma等)重復(fù)此技術(shù)。這里將25ul的0.03mg/mL的稀釋在水中的FITC蛋白G與25μl的稀釋在水中至各種濃度的全長(zhǎng)人活性IgG1(Abcam等)混合。圖2和4顯示了存在IgG的情況下，F(xiàn)ITC標(biāo)記的蛋白G的熒光偏振影響。顯然，該方法可用于在所觀察的范圍內(nèi)給出IgG的精確定量。分辨率顯然很高，并且可以容易觀察到0.01g/L的差異。這表明該方法可以使用較短壽命的熒光團(tuán)如FITC(異硫氰酸熒光素)。

比較短壽命熒光團(tuán)與長(zhǎng)壽命熒光團(tuán)。

使用三種探針重復(fù)該技術(shù)，即(1)FITC-截短蛋白G，(2)BIODOPY-截短蛋白G和(3)Alexa647-截短蛋白G。這里，將30ul的0.02mg/mL的稀釋在蛋白G結(jié)合緩沖液(sigma，UK)中的綴合物與30ul的稀釋在CD-CHO中至各種濃度的全長(zhǎng)人活性IgG1(Abcam等)混合。圖6顯示了在存在IgG的情況下，三種綴合物的熒光偏振影響。顯然，該方法可用于在所觀察的范圍內(nèi)給出IgG的精確定量。同樣明顯的是，使用具有較長(zhǎng)壽命探針(FITC＝4ns，BIODOPY＝5ns)的綴合物獲得的信號(hào)明顯優(yōu)于使用短壽命探針(Alexa647＝1ns)的綴合物獲得的信號(hào)。

比較截短蛋白G與蛋白G片段

使用兩種探針(即(1)與截短蛋白G綴合的FITC和(2)與含有單個(gè)IgG結(jié)合結(jié)構(gòu)域的蛋白G的片段(gb1)綴合的FITC)重復(fù)該技術(shù)。這里，將30ul的0.02mg/mL的稀釋在蛋白G結(jié)合緩沖液(sigma，UK)中的每種綴合物與25ul的稀釋在CD-CHO中至各種濃度的全長(zhǎng)人活性IgG1(Abcam等)混合。圖7顯示了在存在IgG的情況下，兩種綴合物的熒光偏振影響。顯然，使用蛋白G片段(<10kD)獲得的信號(hào)明顯優(yōu)于使用截短蛋白G(20kD)獲得的信號(hào)。

評(píng)估方酸菁輪烷染料(squarene rotoxane dye)-截短蛋白G綴合物。

使用方酸菁輪烷綴合的截短蛋白質(zhì)G重復(fù)該技術(shù)。這里將30ul的0.02mg/mL的稀釋在蛋白G結(jié)合緩沖液(sigma，UK)中的方酸菁輪烷蛋白G與30ul的稀釋在CD-CHO培養(yǎng)基中至各種濃度的全長(zhǎng)人活性IgG1(Abcam等)混合。圖7顯示了在存在IgG的情況下，綴合物的熒光偏振影響。顯然，該方法可用于在所觀察的范圍內(nèi)給出IgG的精確含量。方酸菁輪烷染料描述于http://chem.isc.kharkov.com/dep9/research-achievements。

評(píng)估熒光偏振法定量哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)基中的IgG。

評(píng)價(jià)稀釋在培養(yǎng)基中的IgG樣品的影響。這里將25ul的0.03mg/mL的稀釋在水中的FITC蛋白G與25ul的稀釋在CD-CHO(Life Technologies,Paisley,UK)中的全長(zhǎng)人活性IgG1(Abcam等)的各種稀釋液混合。圖3顯示了在存在稀釋在CD-CHO培養(yǎng)基中的IgG的情況下，F(xiàn)ITC標(biāo)記的蛋白G的熒光偏振影響。

在存在非靶蛋白的情況下，評(píng)估m(xù)P的陰性對(duì)照。

作為陰性對(duì)照，將FITC蛋白G加入到與IgG濃度相當(dāng)?shù)臐舛鹊母鞣N濃度的未標(biāo)記的蛋白A中。圖5顯示了在存在稀釋在水中的未標(biāo)記蛋白A的情況下，F(xiàn)ITC標(biāo)記的蛋白G的熒光偏振影響。在這里，顯然，當(dāng)使用非靶蛋白時(shí)，偏振沒(méi)有系統(tǒng)性變化。

上述結(jié)果清楚地表明，本發(fā)明的方法可用于快速、經(jīng)濟(jì)和高通量的IgG抗體的定量。

本發(fā)明不限于上述實(shí)施例，在不脫離本發(fā)明的精神的情況下，可以在結(jié)構(gòu)和細(xì)節(jié)上進(jìn)行改變。