一種基于熒光開關(guān)的快速超分辨顯微方法和裝置制造方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種基于熒光開關(guān)的快速超分辨顯微方法，在激活光對樣品的熒光分子激活后，利用激光經(jīng)兩個渥拉斯頓棱鏡形成兩束垂直偏振光（s光）和兩束平行偏振光（p光），這四束線偏光聚焦在樣品上形成的干涉光斑對熒光樣品進行漂白，再用激發(fā)光激發(fā)未被漂白的部分，也就是干涉光斑的暗斑部分并發(fā)出熒光，以實現(xiàn)快速超分辨顯微，直接成像。本發(fā)明還公開了一種基于熒光開關(guān)的快速超分辨顯微裝置。本發(fā)明裝置結(jié)構(gòu)簡單，數(shù)據(jù)處理方便；能夠?qū)崿F(xiàn)對標記熒光開關(guān)的樣品進行快速的超分辨顯微，無需對獲取的圖像進行高斯擬合以確定熒光分子中心位置；激活光能夠激活更高密度的熒光分子。
【專利說明】一種基于熒光開關(guān)的快速超分辨顯微方法和裝置
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于超分辨顯微領(lǐng)域，特別涉及一種基于熒光開關(guān)的快速超分辨顯微方法和裝置。
【背景技術(shù)】
[0002]當普通的光學顯微鏡需要分辨兩個或者更多點光源位置時難以突破衍射極限，其分辨率約為250nm，但當顯微鏡視野內(nèi)僅有單個熒光分子時，通過高斯擬合單分子的點擴散函數(shù)可以很容易的突破常規(guī)光學顯微鏡分辨率的極限，實現(xiàn)超分辨顯微。
[0003]基于單分子定位理論，Betzig于2006年提出了光激活定位顯微術(shù)(photoactivated localization microscopy, PALM),同年底，美國的華裔科學家莊曉薇提出了一種類似PALM的方法并命名為隨機光學重構(gòu)顯微術(shù)(stochastic opticalreconstruction microscopy, STORM)。這兩種光學超分辨技術(shù)都是利用突光分子的光開關(guān)效應，首先采用一束特定波長的激活光使得同一時間只有極少數(shù)稀疏的熒光分子被激活，并具備發(fā)射熒光的能力，此時這些熒光分子所發(fā)出的熒光將不會由于衍射效應而發(fā)生空間上的串擾，再利用另一個波長的激光來觀察、精確定位并漂白這些熒光分子，相應的熒光分子就可以被一一區(qū)分并通過PSF數(shù)字化的方法計算出中心位置，反復這一過程逐個獲取數(shù)微米尺度范圍內(nèi)所有熒光分子的中心位置，最后疊加重構(gòu)成一幅完整的圖像，即可實現(xiàn)超分辨顯微。
[0004]上述兩種方法需對熒光分子進行稀疏的激活，以保證被激發(fā)的熒光不會由于衍射效應而發(fā)生空間上的串擾，同時要對最后獲取的圖像進行高斯擬合以確定熒光分子的中心位置。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明提供了一種基于熒光開關(guān)的快速超分辨顯微方法和裝置，裝置結(jié)構(gòu)簡單，便于操作，能夠?qū)崿F(xiàn)基于熒光開關(guān)的快速超分辨顯微成像，可用于光學顯微成像領(lǐng)域。
[0006]一種基于熒光開關(guān)的快速超分辨顯微方法，包括以下步驟:
[0007]I)將第一激光光束聚焦到熒光樣品表面，對熒光樣品進行激活；
[0008]2)將第二激光光束分為偏振方向互相垂直的第一線偏光和第二線偏光,再將所述的第一線偏光分為第一平行偏振光和第一垂直偏振光，同時所述的第二線偏光分為第二平行偏振光和第二垂直偏振光，然后將四束偏振光(指第一平行偏振光、第一垂直偏振光、第二平行偏振光和第二垂直偏振光)聚焦至熒光樣品表面并發(fā)生干涉形成干涉光斑，所述干涉光斑中的亮斑部分對熒光樣品進行漂白；
[0009]3)將第三激光光束聚焦到突光樣品表面,激發(fā)所述突光樣品中未被漂白的突光分子發(fā)出突光；
[0010]4)利用探測器收集所述熒光的信息，并通過計算機對該信息進行數(shù)據(jù)處理，完成對樣品的掃描。[0011]本發(fā)明中，在激活光對樣品的熒光分子激活后，利用激光經(jīng)兩個渥拉斯頓棱鏡形成兩束垂直偏振光(s光)和兩束平行偏振光(P光)，這四束線偏光聚焦在樣品上形成的干涉光斑對熒光樣品進行漂白，再用激發(fā)光激發(fā)未被漂白的部分，也就是干涉光斑的暗斑部分并發(fā)出熒光，以實現(xiàn)快速超分辨顯微，直接成像。
[0012]在所述的步驟2)中，所述的第二激光光束經(jīng)第一渥拉斯頓棱鏡分為第一線偏光和第二線偏光，第一線偏光和第二線偏光具有在振動方向和角度互相垂直的特性；
[0013]所述的第一線偏光經(jīng)第二渥拉斯頓棱鏡分為第一平行偏振光(P光)和第一垂直偏振光(s光)；
[0014]所述的第二線偏光經(jīng)第二渥拉斯頓棱鏡分為第二平行偏振光(P光)和第二垂直偏振光(s光)。
[0015]在所述步驟2)的干涉光斑中，相鄰兩亮斑或兩暗斑中心的最小距離為D=X /2NA，λ為波長，NA為聚焦用物鏡的數(shù)值孔徑。
[0016]在聚焦用物鏡的入瞳處，第一平行偏振光和第一垂直偏振光的光斑中心連線垂直于所述第二平行偏振光和第二垂直偏振光的光斑中心連線。
[0017]將所述的熒光樣品放置在納米平移臺上，并通過計算機控制納米平移臺在垂直光軸方向上移動，重復步驟I)~步驟4)，完成對熒光樣品的二維平面掃描。
[0018]本發(fā)明還提供了一種基于熒光開關(guān)的快速超分辨顯微裝置，包括:
[0019]第一激光器，用于發(fā)出激活熒光樣品的激活光；
[0020]第二激光器，用于發(fā)出漂白熒光樣品的漂白光；
[0021]第三激光器，用于發(fā)出激發(fā)未被漂白的熒光樣品產(chǎn)生熒光的激發(fā)光；
[0022]沿所述第二激光器光路依次布置的雙折射偏光器件、準直透鏡、物鏡和納米平移臺，所述的物鏡用于將所述的激活光、漂白光和激發(fā)光聚焦于納米平移臺上的熒光樣品；
[0023]用于收集所述熒光信息的探測器；
[0024]以及與所述探測器和納米平移臺連接的計算機。
[0025]所述的雙折射偏光器件為依次布置的第一渥拉斯頓棱鏡和第二渥拉斯頓棱鏡；
[0026]所述的第一渥拉斯頓棱鏡用于將漂白光分為偏振方向互相垂直的第一線偏光和第二線偏光；
[0027]所述的第二渥拉斯頓棱鏡用于將第一線偏光分為第一平行偏振光和第一垂直偏振光，并將第二線偏光分為第二平行偏振光和第二垂直偏振光。
[0028]在所述物鏡的入瞳處,第一平行偏振光和第一垂直偏振光的光斑中心連線垂直于所述第二平行偏振光和第二垂直偏振光的光斑中心連線。
[0029]本發(fā)明原理如下:
[0030]在基于突光開光的快速超分辨顯微中，首先利用一束激活光對樣品的突光分子進行激活，然后另一束激光經(jīng)過兩個渥拉斯頓棱鏡，在系統(tǒng)入瞳處形成四束線偏振光，如圖2所示。這四束偏振光經(jīng)物鏡聚焦到樣品表面發(fā)生干涉并形成干涉光斑，干涉光斑如圖3所示，其中兩亮斑或兩暗斑中心的最小距離為?=λ /2ΝΑ，大小恰好等于一個艾里斑的直徑，其中NA為物鏡的數(shù)值孔徑。干涉光斑中的亮斑部分對熒光樣品漂白，因此最后的激發(fā)光實際只能夠激發(fā)干涉光斑中暗斑的熒光分子，而暗斑的大小遠小于衍射極限，這樣就能夠?qū)崿F(xiàn)對熒光分子的定位，同時兩暗斑之間的距離恰好等于一個艾里斑的直徑，而暗斑的大小遠小于衍射極限，所以相比于原有的基于熒光開光的單分子定位方法，激活光能夠激活更高密度的熒光分子，并能保證不會由于衍射效應發(fā)生空間上的串擾。熒光樣品發(fā)出熒光后被探測器接收完成單點掃描，接著計算機控制納米平移臺使樣品完成二維掃描成像，實現(xiàn)快速的超分辨成像。同原有的基于熒光開光的單分子定位方法相比，本發(fā)明無需對獲取的圖像進行高斯擬合以確定熒光分子的中心位置，同時激活光能夠激活更高密度的熒光分子，實現(xiàn)更快速的超分辨成像。
[0031]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益的技術(shù)效果:
[0032](I)相對于原有的基于熒光開光的單分子定位方法，激活光能夠激活更高密度的突光分子；
[0033](2)能夠?qū)崿F(xiàn)對標記熒光開關(guān)的樣品進行快速的超分辨顯微，無需對獲取的圖像進行高斯擬合以確定熒光分子中心位置；
[0034](3)裝置結(jié)構(gòu)簡單，數(shù)據(jù)處理方便。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0035]圖1為針對熒光樣品的一種基于熒光開關(guān)的快速超分辨顯微裝置示意圖；
[0036]圖2為第二激光器發(fā)出的光束在入瞳處形成的四束線偏光光斑圖樣；
[0037]圖3為四束線偏光經(jīng)物鏡透射聚焦到熒光樣品表面，發(fā)生干涉形成的干涉光斑圖樣；
[0038]圖4為干涉光斑圖樣中截取的部分示意圖。
【具體實施方式】
[0039]如圖1所示，一種針對熒光樣品的基于熒光開關(guān)的快速超分辨顯微裝置，包括第二激光器I，第一渥拉斯頓棱鏡2,第二渥拉斯頓棱鏡3,第二透鏡4,第一雙色鏡5,第二雙色鏡6，第三雙色鏡7，物鏡9，熒光樣品10，納米平移臺11，第一透鏡12，第一激光器13，第三透鏡14，第三激光器15，濾波片16，探測器17，計算機18。
[0040]第一激光器13，用于發(fā)出激活光，實現(xiàn)對熒光樣品的激活；第二激光器1，用于發(fā)出激光，實現(xiàn)對熒光樣品的漂白；第三激光器15，用于發(fā)出激發(fā)光，實現(xiàn)對熒光樣品的激發(fā)，使其發(fā)出熒光。
[0041]第一透鏡12、第二透鏡4和第三透鏡14分別用于將對應激光器發(fā)出的光束進行準直。
[0042]第一渥拉斯頓棱鏡2的作用是將所述第二激光器發(fā)出的激光分成兩束分開的，角度、振動方向互相垂直的線偏光，第二渥拉斯頓棱鏡4的作用是將這兩束線偏光分別分成平行偏振光(P光)和垂直偏振光(s光)。這樣在系統(tǒng)入瞳處就得到四束線偏光，分別是兩束平行偏振光(P光)，兩束垂直偏振光(S光),且入瞳處,第一平行偏振光(P光)和第一垂直偏振光(S光)的光斑中心連線垂直于所述第二平行偏振光(P光)和第二垂直偏振光(S光)的光斑中心連線，如圖2所不，圖中四束線偏光的光斑分別用abed來編號,其中，a和c為兩束垂直偏振光(s光)的光斑，b和d為兩束平行偏振光(P光)的光斑。
[0043]第一雙色鏡5用于全部反射第一激光器13發(fā)出的激活光和全部透射的第二激光器I發(fā)出的激光；第二雙色鏡6用于全部反射第三激光器15發(fā)出的激發(fā)光和全部透射經(jīng)第一雙色鏡5全部透射的激光；第三雙色鏡7用于全部透射經(jīng)第二雙色鏡6全部透射的激光和全部反射物鏡9收集的樣品被激發(fā)出的熒光。
[0044]濾波片16的作用是將物鏡9收集的非信號光波段過濾；計算機18的作用是用于處理探測器17的信號，同時控制納米平移臺11完成對樣品的二維平面掃描。
[0045]采用圖1所示的裝置實現(xiàn)針對熒光樣品的基于熒光開關(guān)的快速超分辨顯微方法，其過程如下:
[0046](1)第一激光器13發(fā)出激活光，經(jīng)第一透鏡12準直后形成準直光，準直光經(jīng)第一雙色鏡5全部反射，再經(jīng)第二雙色鏡6和第三雙色鏡7全部透射，最后經(jīng)物鏡9聚焦到熒光樣品10表面,激活突光樣品10的突光分子；
[0047](2)第二激光器I發(fā)出激光，經(jīng)第一渥拉斯頓棱鏡2和第二渥拉斯頓棱鏡3后形成四束偏振光，這四束偏振光經(jīng)第二透鏡4透射后，再經(jīng)第一雙色鏡5，第二雙色鏡6和第三雙色鏡7全部透射，在入瞳8處形成如圖2所示的光斑，最后經(jīng)物鏡9聚焦到熒光樣品10表面，四束偏振光發(fā)生干涉形成干涉光斑，其中亮斑部分漂白熒光樣品10中的熒光分子，四束線偏光形成的干涉光斑如圖3所示，其中兩亮點的最小距離為?=λ/2ΝΑ，λ為激光波長，NA為物鏡的數(shù)值孔徑，詳見圖4 ；
[0048](3)第三激光器15發(fā)出激發(fā)光，經(jīng)第三透鏡14準直后形成準直光，準直光經(jīng)第二雙色鏡6全部反射，再經(jīng)第三雙色鏡7全部透射，最后經(jīng)物鏡9聚焦到熒光樣品10的表面，激發(fā)熒光樣品10中未被漂白的也就是第二激光器發(fā)出的光束形成的干涉光斑中暗斑部分的突光分子；
[0049](4)熒光樣品10熒光被激發(fā)，得到的激發(fā)熒光被物鏡9收集， 并經(jīng)第三雙色鏡7全部反射，再經(jīng)濾波片16過濾掉非信號光波段，最后被探測器17所接收，所述探測器17將光信號轉(zhuǎn)化為電信號傳至計算機18 ；
[0050](5)計算機18將信號進行數(shù)據(jù)處理，完成第一次掃描；
[0051](6)突光樣品10所在的納米平臺11與計算機18相連,通過計算機18來控制納米平移臺11使熒光樣品10在垂直光軸面內(nèi)移動完成二維掃描成像。
【權(quán)利要求】
1.一種基于熒光開關(guān)的快速超分辨顯微方法，其特征在于，包括以下步驟: 1)將第一激光光束聚焦到熒光樣品表面，對熒光樣品進行激活； 2)將第二激光光束分為偏振方向互相垂直的第一線偏光和第二線偏光，再將所述的第一線偏光分為第一平行偏振光和第一垂直偏振光，同時所述的第二線偏光分為第二平行偏振光和第二垂直偏振光，然后將四束偏振光聚焦至熒光樣品表面并發(fā)生干涉形成干涉光斑，所述干涉光斑中的亮斑部分對熒光樣品進行漂白； 3)將第三激光光束聚焦到熒光樣品表面，激發(fā)所述熒光樣品中未被漂白的熒光分子發(fā)出熒光； 4)利用探測器收集所述熒光的信息，并通過計算機對該信息進行數(shù)據(jù)處理，完成對樣品的掃描。
2.如權(quán)利要求1所述的基于熒光開關(guān)的快速超分辨顯微方法，其特征在于，在所述的步驟2)中，所述的第二激光光束經(jīng)第一渥拉斯頓棱鏡分為第一線偏光和第二線偏光； 所述的第一線偏光經(jīng)第二渥拉斯頓棱鏡分為第一平行偏振光和第一垂直偏振光； 所述的第二線偏光經(jīng)第二渥拉斯頓棱鏡分為第二平行偏振光和第二垂直偏振光。
3.如權(quán)利要求1所述的基于熒光開關(guān)的快速超分辨顯微方法，其特征在于，在所述步驟2)的干涉光斑中，相鄰兩亮斑或兩暗斑中心的最小距離為D=X /2NA，λ為波長，NA為聚焦用物鏡的數(shù)值孔徑。
4.如權(quán)利要求1所述的基于熒光開關(guān)的快速超分辨顯微方法，其特征在于，在聚焦用物鏡的入瞳處，第一平行偏振光和第一垂直偏振光的光斑中心連線垂直于所述第二平行偏振光和第二垂直偏振光的.光斑中心連線。
5.如權(quán)利要求1所述的基于熒光開關(guān)的快速超分辨顯微方法，其特征在于，將所述的熒光樣品放置在納米平移臺上，并通過計算機控制納米平移臺在垂直光軸方向上移動，重復步驟I)~步驟4)，完成對熒光樣品的二維平面掃描。
6.一種基于熒光開關(guān)的快速超分辨顯微裝置，其特征在于，包括: 第一激光器，用于發(fā)出激活熒光樣品的激活光； 第二激光器，用于發(fā)出漂白熒光樣品的漂白光； 第三激光器，用于發(fā)出激發(fā)未被漂白的熒光樣品產(chǎn)生熒光的激發(fā)光； 沿所述第二激光器光路依次布置的雙折射偏光器件、準直透鏡、物鏡和納米平移臺，所述的物鏡用于將所述的激活光、漂白光和激發(fā)光聚焦于納米平移臺上的熒光樣品； 用于收集所述熒光信息的探測器； 以及與所述探測器和納米平移臺連接的計算機。
7.如權(quán)利要求6所述的基于熒光開關(guān)的快速超分辨顯微裝置，其特征在于，所述的雙折射偏光器件為依次布置的第一渥拉斯頓棱鏡和第二渥拉斯頓棱鏡； 所述的第一渥拉斯頓棱鏡用于將漂白光分為偏振方向互相垂直的第一線偏光和第二線偏光； 所述的第二渥拉斯頓棱鏡用于將第一線偏光分為第一平行偏振光和第一垂直偏振光，并將第二線偏光分為第二平行偏振光和第二垂直偏振光。
8.如權(quán)利要求7所述的基于熒光開關(guān)的快速超分辨顯微裝置，其特征在于，在所述物鏡的入瞳處，第一平行偏振光和第一垂直偏振光的光斑中心連線垂直于所述第二平行偏振光和第二垂直偏振光的.光斑中心連線。
【文檔編號】G01N21/64GK103472042SQ201310389145
【公開日】2013年12月25日 申請日期:2013年8月30日 優(yōu)先權(quán)日:2013年8月30日
【發(fā)明者】葛劍虹, 蔡歡慶, 匡翠方, 劉旭 申請人:浙江大學