5]本發(fā)明的有益效果是:本發(fā)明采用雙光楔調(diào)節(jié)損耗光的光程，結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，光程補(bǔ)償精度更高，操作更加快速簡(jiǎn)便；采用超連續(xù)譜脈沖光源同時(shí)作為激發(fā)光光源和損耗光光源，簡(jiǎn)化了儀器結(jié)構(gòu)，減小了光照對(duì)熒光物質(zhì)的漂白影響。
【附圖說(shuō)明】
[0036]圖1為本發(fā)明所述的對(duì)熒光物質(zhì)進(jìn)行成像的超分辨顯微鏡的結(jié)構(gòu)示意圖。
[0037]圖2為激發(fā)光和損耗光從光源出發(fā)，在進(jìn)入第一二色鏡時(shí)的波列示意圖，圖中此時(shí)激發(fā)光和損耗光波列行進(jìn)的光程相同。
[0038]圖3為損耗光在進(jìn)過(guò)雙光楔光程補(bǔ)償裝置后，與激發(fā)光波列所形成光程差的示意圖。
[0039]圖4為本發(fā)明所述的對(duì)熒光物質(zhì)進(jìn)行成像的超分辨顯微鏡中雙光楔光程補(bǔ)償裝置的工作原理示意圖。
[0040]圖5為激發(fā)光和損耗光的轉(zhuǎn)變示意圖，陰影部分表示有光，空白處表示無(wú)光，其中，(a)表不損耗光未經(jīng)過(guò)相位板時(shí)的光斑圖，和激發(fā)光一樣，為實(shí)心光斑；(b)表不損耗光經(jīng)過(guò)相位板后，由實(shí)心光斑變?yōu)橹虚g無(wú)光周圈有光的同心環(huán)光斑；(C)表示激發(fā)光將熒光物質(zhì)激發(fā)后，處于激發(fā)態(tài)的焚光粒子即將形成的焚光實(shí)心光斑；(d)表不損耗光照射焚光粒子產(chǎn)生受激輻射后，所形成的較小的熒光實(shí)心光斑。
【具體實(shí)施方式】
[0041]下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的詳細(xì)說(shuō)明，以令本領(lǐng)域技術(shù)人員參照說(shuō)明書(shū)文字能夠據(jù)以實(shí)施。
[0042]如圖1所示，本案涉及一種對(duì)熒光物質(zhì)進(jìn)行成像的超分辨顯微鏡，它包括以下構(gòu)件:光源1、第一二色鏡2、第一濾光片3、第二濾光片4、反射鏡5、第二二色鏡6、第三二色鏡7、相位板8、雙光楔光程補(bǔ)償裝置(第一光楔9和第二光楔10)、物鏡11、三維納米位移臺(tái)
12、第三濾光片13、透鏡14、針孔15、熒光探測(cè)系統(tǒng)(光電倍增管16)和分析控制系統(tǒng)17。
[0043]其中，每個(gè)構(gòu)件的功能分別是:
[0044]光源1，其為超連續(xù)譜脈沖激光源，用于發(fā)射波長(zhǎng)范圍較寬的脈沖光。
[0045]第一二色鏡2，位于光源I的光路上，用于將光源I發(fā)出的波長(zhǎng)范圍較寬的脈沖光分解為長(zhǎng)波長(zhǎng)和短波長(zhǎng)兩路光，其中短波長(zhǎng)光波行進(jìn)的光路為激發(fā)光光路，長(zhǎng)波長(zhǎng)光波行進(jìn)的光路為損耗光光路；第一二色鏡2能夠透射短波長(zhǎng)光波，反射長(zhǎng)波長(zhǎng)光波。
[0046]第一濾光片3，其位于激發(fā)光光路上，且只允許一個(gè)特定波長(zhǎng)的激光透射，該透射出的特定波長(zhǎng)的激光稱(chēng)為激發(fā)光，激發(fā)光用于激發(fā)熒光物質(zhì)，使熒光物質(zhì)中的熒光粒子由基態(tài)躍迀至激發(fā)態(tài)，并發(fā)出熒光。
[0047]第二濾光片4，其位于損耗光光路上，且也只允許一個(gè)特定波長(zhǎng)的激光透射，該透射出的特定波長(zhǎng)的激光稱(chēng)為損耗光，損耗光用于將處于激發(fā)態(tài)的熒光粒子退激發(fā)，不再產(chǎn)生熒光。
[0048]反射鏡5，其位于第二濾光片4和相位板8之間，用于反射損耗光；
[0049]第二二色鏡6，其位于第三濾光片13和物鏡11之間，用于反射激發(fā)光和透射熒光;
[0050]第三二色鏡7，其位于第二二色鏡6和物鏡11之間，用于反射損耗光，透射激發(fā)光和熒光；
[0051]激發(fā)光和損耗光均優(yōu)選垂直照射于熒光物質(zhì)上的同一位置。(如圖1所示)
[0052]相位板8，其在損耗光的光路上，位于反射鏡5和第一光楔9之間，相位板8具有O?2 的渦旋相位分布，用于將損耗光的照射面由實(shí)心的光斑轉(zhuǎn)變?yōu)橹虚g無(wú)光周圈有光的空心圓環(huán)光斑。(如圖5(1)所示)
[0053]雙光楔光程補(bǔ)償裝置，其位于損耗光的光路上，由折射率大于空氣折射率的第一光楔9和第二光楔10組成，當(dāng)損耗光穿過(guò)雙光楔光程補(bǔ)償裝置時(shí)，損耗光的傳播速度小于它在空氣中的傳播速度(若換算成光在真空下傳播的距離，則相當(dāng)于損耗光在雙光楔光程補(bǔ)償裝置里的光程變長(zhǎng))，從而使得激發(fā)光和損耗光產(chǎn)生一個(gè)時(shí)間差并先后到達(dá)熒光物質(zhì)，且因激發(fā)光一直在空氣中傳播(空氣的折射率η為I)，它將先于損耗光到達(dá)熒光物質(zhì)，雙光楔光程補(bǔ)償裝置通過(guò)自由調(diào)節(jié)損耗光在雙光楔光程補(bǔ)償裝置中的傳播距離，來(lái)控制時(shí)間差的大??；雙光楔光程補(bǔ)償裝置所含的兩個(gè)光楔均各自?xún)?yōu)選含有一條斜邊，且兩個(gè)光楔的斜邊能夠彼此貼合可滑動(dòng)的移動(dòng)，光穿過(guò)兩個(gè)光楔的貼合部分，通過(guò)滑動(dòng)來(lái)調(diào)節(jié)激光在兩個(gè)光楔中的傳播距離。更優(yōu)選的是，第一光楔9和第二光楔10呈直角梯形或直角三角形。
[0054]三維納米位移臺(tái)12，其與分析控制系統(tǒng)17電連接，用于承載熒光物質(zhì)，并在X、Y、Z方向自由地進(jìn)行以納米為單位的移動(dòng)，移動(dòng)精度最高可達(dá)lnm。
[0055]物鏡11，其位于熒光物質(zhì)上方，三維納米位移臺(tái)12和第三二色鏡7之間，用于聚焦激發(fā)光和損耗光，并收集由熒光物質(zhì)發(fā)出的熒光；
[0056]第三濾光片13，其位于熒光光路上，第二二色鏡6和透鏡14之間用于濾除殘留的激發(fā)光和損耗光等干擾光，并透射熒光；
[0057]透鏡14，其位于第三濾光片13和熒光探測(cè)系統(tǒng)之間，用于聚焦熒光；
[0058]針孔15，其位于透鏡14和熒光探測(cè)系統(tǒng)之間，用于濾除干擾光。
[0059]熒光探測(cè)系統(tǒng)，其為一個(gè)光電倍增管16，用于檢測(cè)熒光及其強(qiáng)度。
[0060]分析控制系統(tǒng)17，其與熒光探測(cè)系統(tǒng)電連接，用于記錄和分析熒光強(qiáng)度，并最終實(shí)現(xiàn)顯微成像。
[0061]其中，通過(guò)調(diào)節(jié)雙光楔光程補(bǔ)償裝置來(lái)改變時(shí)間差的大小，以使得激發(fā)光先照射熒光物質(zhì)，待熒光物質(zhì)中的熒光粒子從基態(tài)躍迀至激發(fā)態(tài)之后，且在該處于激發(fā)態(tài)的熒光粒子發(fā)出熒光之前，損耗光剛好照射到熒光物質(zhì)，使熒光物質(zhì)受激輻射，以迫使已經(jīng)處于激發(fā)態(tài)的熒光粒子立刻回到基態(tài)，從而失去發(fā)射熒光的能力，因而，損耗光又被稱(chēng)作耗損光；呈中間無(wú)光周圈有光的同心環(huán)光斑的損耗光使熒光物質(zhì)受激輻射后，熒光物質(zhì)中剩余的還處于激發(fā)態(tài)的熒光粒子只能從損耗光中中間無(wú)光區(qū)域發(fā)射出熒光；也就是說(shuō)，剩下的可發(fā)射的熒光被限制在小于衍射極限區(qū)域內(nèi)，從而獲得了一個(gè)小于衍射極限的發(fā)光點(diǎn)，提高了成像分辨率。(如圖5 (II)所示)
[0062]此外，激發(fā)光和損耗光到達(dá)熒光物質(zhì)的時(shí)間差約比光源發(fā)出的單個(gè)光脈沖的持續(xù)時(shí)間多幾個(gè)皮秒。
[0063]該超分辨顯微鏡中各構(gòu)件的位置關(guān)系為:
[0064]激發(fā)光從光源I出發(fā)，依次經(jīng)過(guò)第一二色鏡2、第一濾光片3、第二二色鏡6、第三二色鏡7和物鏡11，最終到達(dá)熒光物質(zhì)。
[0065]損耗光從光源I出發(fā)，依次經(jīng)過(guò)第一二色鏡2、第二濾光片4、反射鏡5、相位板8、雙光楔光程補(bǔ)償裝置(第一光楔9和第二光楔10)、第三二色鏡7和物鏡11，最終到達(dá)樣本焚光物質(zhì)。
[0066]熒光物質(zhì)發(fā)出的熒光依次經(jīng)過(guò)物鏡11、第三二色鏡7、第二二色鏡6、第三濾光片
13、透鏡14和針孔15，最終到達(dá)熒光探測(cè)系統(tǒng)(光電倍增管16)。
[0067]該超分辨顯微鏡的工作流程為:
[0068]見(jiàn)圖1，光源I發(fā)出寬波段的脈沖激光，經(jīng)第一二色鏡2分解為長(zhǎng)波長(zhǎng)和短波長(zhǎng)兩條光路，其中，短波長(zhǎng)光波從第一二色鏡2透射出去，長(zhǎng)波長(zhǎng)光波從第一二色鏡2反射出去，短波長(zhǎng)光波經(jīng)第一濾光片3后得到激發(fā)光，隨后激發(fā)光經(jīng)第二二色鏡6反射、第三二色鏡7透射、物鏡11聚焦后照射到位于三維納米位移臺(tái)上的熒光物質(zhì)上的某一點(diǎn)，并激發(fā)該點(diǎn)上的熒光粒子，使其從基態(tài)躍迀至激發(fā)態(tài)；長(zhǎng)波長(zhǎng)光波經(jīng)第二濾光片4后得到損耗光，隨后損耗光經(jīng)反射鏡5反射、相位板8后，原本的實(shí)心光斑轉(zhuǎn)變成圓環(huán)狀光斑，圓環(huán)的內(nèi)圓區(qū)域沒(méi)有光，之后損耗光經(jīng)由雙光楔組成的雙光楔光程補(bǔ)償裝置后，傳播速度得到降低，從而可以使得激發(fā)光先激發(fā)熒光物質(zhì)，損