專利名稱：用于血紅蛋白和細(xì)胞分析的組合物與方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于手工或自動(dòng)測(cè)定血樣中總血紅蛋白濃度及用于同時(shí)進(jìn)行白細(xì)胞計(jì)數(shù)或白細(xì)胞亞群的分類計(jì)數(shù)的溶解劑組合物、稀釋劑以及方法。
現(xiàn)有技術(shù)的討論總血紅蛋白的測(cè)定是全血攜氧容量的指示。測(cè)定血樣中血紅蛋白(Hgb)的能力是診斷分析的十分重要的部分，在監(jiān)控對(duì)影響血紅蛋白之疾病的療法的反應(yīng)以及對(duì)針對(duì)其它疾病但可能對(duì)血紅蛋白水平產(chǎn)生不利影響的療法的反應(yīng)中也是重要的。
正常人外周血液中的白細(xì)胞是由五種類型組成的，即，淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞。后三種類型的白細(xì)胞一起被稱作粒細(xì)胞。不同類型的白細(xì)胞具有不同的生物功能。血樣中的不同類型白細(xì)胞的計(jì)數(shù)和分類為臨床診斷提供了有價(jià)值的信息。
白細(xì)胞的分類和計(jì)數(shù)通常通過(guò)分類計(jì)數(shù)法(也稱為手工方法)進(jìn)行。自動(dòng)血液分析儀也常用于白細(xì)胞計(jì)數(shù)，該儀器使用溶血試劑以溶解紅細(xì)胞并制備僅包含白細(xì)胞的樣品。然后樣品混合物通過(guò)阻抗方法分析。現(xiàn)已開(kāi)發(fā)了一種更先進(jìn)的裝置，該裝置對(duì)包括淋巴樣細(xì)胞(淋巴細(xì)胞)和髓樣細(xì)胞(單核細(xì)胞和粒細(xì)胞)的不同類型的白細(xì)胞數(shù)量計(jì)數(shù)(分類計(jì)數(shù))(Ledis等的美國(guó)專利4286963)。白細(xì)胞還被進(jìn)一步區(qū)別為三種亞群，即單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和粒細(xì)胞(Ledis等的美國(guó)專利4485185)。理想地，人們希望能在同一個(gè)自動(dòng)步驟中完成多項(xiàng)診斷分析，如血紅蛋白測(cè)定和白細(xì)胞計(jì)數(shù)或白細(xì)胞亞群分類計(jì)數(shù)。
在許多用于血紅蛋白測(cè)定的已知方法中，氰化物血紅蛋白方法被國(guó)際血液學(xué)標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)推薦為標(biāo)準(zhǔn)方法。Matsubara和Okuzono對(duì)該方法的改良導(dǎo)致其在臨床實(shí)驗(yàn)室中廣泛地應(yīng)用。按照該方法，在紅細(xì)胞的所有血紅蛋白形式的血紅素基的鐵離子由鐵氰化鉀氧化成高鐵血紅蛋白。然后高鐵血紅蛋白和氰陰離子(其對(duì)血紅素鐵離子具有十分高的親和性)結(jié)合，形成氰化正鐵血紅蛋白色原。這種極端穩(wěn)定的色原在540nm具有最大吸光度，這可以通過(guò)紫外光譜測(cè)定法人工測(cè)定。
盡管通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)的氰化正鐵血紅蛋白方法及其改良的自動(dòng)方法形成的色原穩(wěn)定，然而，由于使用氰化鉀，試劑廢物引起了巨大的環(huán)境關(guān)注。在過(guò)去十年中，人們付出了巨大的努力以開(kāi)發(fā)不使用氰化物的自動(dòng)血紅蛋白分析方法。
Oshiro等(臨床生物化學(xué)(Clin．Biochem．)，1583(1982))報(bào)道了一種用于血紅蛋白分析的試劑，該試劑包含十二烷基硫酸鈉(SLS)和Triton X-100(非離子型表面活性劑)，為中性pH(7．2)。SLS用于溶解紅細(xì)胞，并被認(rèn)為進(jìn)一步產(chǎn)生SLS-血紅蛋白復(fù)合物，它在539nm處具有最大吸光度并在572nm處有肩峰。反應(yīng)在5-10分鐘內(nèi)完成，總血紅蛋白測(cè)定是定量的。然而，如后來(lái)在Satata的美國(guó)專利5，242，832中所解釋的，使用Oshiro方法不可能在進(jìn)行血紅蛋白測(cè)定的同時(shí)分析白細(xì)胞。
Sakata的美國(guó)專利5，242，832公開(kāi)了用于對(duì)血樣白細(xì)胞計(jì)數(shù)并測(cè)定血紅蛋白濃度的無(wú)氰化物溶解劑。該溶解劑包含至少一種第一表面活性劑(季銨鹽)、至少一種第二表面活性劑(包括陽(yáng)離子表面活性劑和兼性表面活性劑)以及至少一種選自下列化合物的血紅蛋白穩(wěn)定劑Tiron、8-羥喹啉、聯(lián)吡啶、1-10-菲咯啉、酚類化合物、雙酚、吡唑及其衍生物、2-苯基5-吡唑啉酮及其衍生物、苯基3-吡唑啉酮以及咪唑及其衍生物。Sakata指出將白細(xì)胞分離成兩個(gè)或三個(gè)組(包括淋巴細(xì)胞的聚集體，單核細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞的聚集體以及嗜中性粒細(xì)胞的聚集體)只有通過(guò)使用至少兩種適合的表面活性劑和嚴(yán)格控制表面活性劑濃度才能完成。Sakata還指出溶解劑優(yōu)選的pH值是5．0-8．0。如果pH值是3．0或更小，對(duì)白細(xì)胞的破壞增加，這樣使白細(xì)胞的測(cè)定困難，如果pH值是9．0或更大，血紅蛋白的穩(wěn)定性隨時(shí)間變差。
Kim的美國(guó)專利5612223公開(kāi)了用于測(cè)定全血樣中的血紅蛋白的無(wú)氰化物方法與試劑。該試劑包括配體(選自下列化合物咪唑及其衍生物、N-羥乙酰胺、H-羥胺、吡啶、噁唑、噻唑、吡唑、嘧啶、嘌呤、喹啉和異喹啉)以及一種強(qiáng)紅細(xì)胞溶解能力的表面活性劑(選自十二烷基二甲基胺氧化物和辛基苯氧基多乙氧基乙醇)。該分析方法快速，不到10秒。然而，該試劑僅在極端堿性(pH值11-14)條件下操作。此外，Kim沒(méi)有說(shuō)明白細(xì)胞計(jì)數(shù)或區(qū)別白細(xì)胞亞群的能力。
Stephanos等在“單體血紅蛋白的鐵配體識(shí)別”(Biochimica etBiophysica Acta，1295(1996)p209-221)中公開(kāi)了與血紅蛋白單體結(jié)合的有機(jī)配體。
Benezra等的美國(guó)專利4852338描述了測(cè)定血樣中血紅蛋白濃度的方法。該方法包括如下步驟(1)將血樣與一種包括濃度為2-4％的離子表面活性劑的試劑組合物接觸形成反應(yīng)混合物，其中試劑組合物的pH為11．3-約13．7并且不含離子性氰化物；(2)測(cè)定吸光度。該方法僅用于測(cè)定血紅蛋白的濃度。Benezra等沒(méi)有教導(dǎo)白細(xì)胞計(jì)數(shù)或區(qū)別白細(xì)胞亞群。
Toda等的美國(guó)專利5250437描述了測(cè)定血紅蛋白和分析白細(xì)胞的一種試劑。該試劑不含氰化物，但含有(1)至少一種季銨鹽與另一種表面活性劑的組合，所述表面活性劑包括季銨鹽、非離子表面活性劑、吡啶鎓鹽、兩性表面活性劑和式R1R2R3N-CH2Ph(其中R1、R2和R3是烷基)的陽(yáng)離子表面活性劑；和(2)至少一種能氧化血紅蛋白中血紅素的氧化劑。該試劑能將白細(xì)胞區(qū)分為至少兩個(gè)部分。該方法需要使血紅蛋白變性并氧化血紅素。
Larsen的美國(guó)專利4529705描述了一種用于白細(xì)胞電子計(jì)數(shù)和血紅蛋白濃度測(cè)定的即可稀釋又可溶解血樣的試劑。該試劑包含下列成分的水溶液(1)溶解樣品中血紅細(xì)胞的季銨鹽去污劑(detergent)；(2)至少一種防止血樣中血小板聚集的陰離子，其選自硫酸根、碳酸根、甲酸根和乙酸根；和(3)用于將血紅蛋白轉(zhuǎn)化為色原的堿金屬氰化物。該方法提供了使用單一試劑稀釋和溶解血樣用于白細(xì)胞計(jì)數(shù)并測(cè)定血紅蛋白濃度的便捷性。但血紅蛋白的測(cè)定仍需有氰化物的存在。
如上所述，目前的血紅蛋白測(cè)量試劑和方法或存在毒性或缺乏在同一個(gè)自動(dòng)化步驟中就可完成多項(xiàng)診斷分析的能力，例如血紅蛋白測(cè)定以及白細(xì)胞的計(jì)數(shù)或白細(xì)胞亞群的分類計(jì)數(shù)。
這就需要新的無(wú)氰化物血紅蛋白測(cè)定方法和多功能試劑以在同一個(gè)自動(dòng)化步驟中可以完成多項(xiàng)診斷分析。
發(fā)明概述綜上所述，本發(fā)明的目的是提供一種用于測(cè)定血樣中的血紅蛋白濃度并對(duì)白細(xì)胞計(jì)數(shù)的即可稀釋又可溶解血樣的新的無(wú)氰化物溶解劑組合物。
該無(wú)氰化物溶解劑組合物包含足以溶解紅細(xì)胞并釋放血紅蛋白量的季銨鹽或吡啶鎓鹽、和足以與血紅蛋白形成穩(wěn)定的色原量的有機(jī)配體、和足以調(diào)節(jié)用于阻抗測(cè)定之溶解試劑電導(dǎo)率量的鹽的水溶液，所述有機(jī)配體選自三唑及其衍生物、四唑及其衍生物、4，6-二羥基-1，3，5-三嗪-2-羧酸(oxonic acid)的堿金屬鹽、蜜胺、苯胺-2-磺酸、喹哪啶酸、2-氨基-1，3，4-噻二唑、三嗪及其衍生物、尿唑、DL-2-哌啶酸、異煙酰胺、鄰氨基苯甲腈、6-氮雜-2-硫代胸腺嘧啶、3-(2-噻吩基)丙烯酸、苯甲酸以及苯甲酸的堿金屬鹽和銨鹽、吡嗪及其衍生物。
本發(fā)明還提供使用該稀釋并溶解血細(xì)胞樣品的新無(wú)氰化物溶解劑組合物測(cè)定血紅蛋白濃度并對(duì)白細(xì)胞計(jì)數(shù)的方法。該方法包括下列步驟(1)將血樣與該新的無(wú)氰化物的溶解劑組合物混合以溶解紅細(xì)胞并形成穩(wěn)定的血紅細(xì)胞色原；(2)測(cè)定該形成的血紅蛋白色原在預(yù)定波長(zhǎng)處的吸光度；(3)由測(cè)定的吸光度計(jì)算血紅蛋白總濃度；(4)用DC阻抗測(cè)定方法在自動(dòng)血液分析儀上計(jì)數(shù)白細(xì)胞的數(shù)量；和(5)報(bào)告所述血樣的白細(xì)胞數(shù)量。
由隨后對(duì)優(yōu)選實(shí)施方案的詳細(xì)描述中將更清楚地認(rèn)識(shí)到，本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比特別有利，它提供了即可稀釋又可溶解血細(xì)胞樣品用于血紅蛋白測(cè)定和白細(xì)胞計(jì)數(shù)(無(wú)需預(yù)先稀釋血樣)的新的無(wú)氰化物溶解劑組合物。
從隨后的參考附圖的優(yōu)選實(shí)施方案的描述中可以更好地了解本發(fā)明。
附圖的簡(jiǎn)要描述

圖1a和1b是按照在實(shí)施例1中描述的方法使用本發(fā)明實(shí)施例1的溶解劑組合物處理的全血樣品的吸收光譜(配方1b和1c)。
圖2顯示了按照實(shí)施例1的方法使用配方1a的溶解劑組合物處理的血樣的一系列吸收光譜。在十二小時(shí)內(nèi)以一小時(shí)間隔總共獲得了十二張圖譜。
圖3a和3b顯示了按照在實(shí)施例2中所描述的方法使用實(shí)施例2的溶解劑組合物以及標(biāo)準(zhǔn)的磷酸緩沖鹽水和商業(yè)血液稀釋劑COULTERISOTON_Ⅲ作為稀釋劑處理的全血樣圖譜。
圖4a至4d顯示了通過(guò)在商業(yè)血液分析儀COULTER COUNTER_S-Plus Ⅳ型上使用本發(fā)明實(shí)施例4的溶解劑組合物獲得的四個(gè)全血樣品的白細(xì)胞亞群分布直方圖。
圖5a和5b顯示了在自動(dòng)化商業(yè)血液分析儀COULTER_STKS上使用常規(guī)溶解劑COULTER LYSE S_Ⅲ diff獲得的血紅蛋白濃度和白細(xì)胞數(shù)量與在相同儀器上使用本發(fā)明實(shí)施例3的溶解劑組合物(配方3a)獲得的結(jié)果之間的相關(guān)性。
圖6a和6b顯示了在自動(dòng)化商業(yè)血液分析儀COULTER_STKS上使用COULTER_LYSE S_Ⅲ diff溶解劑獲得的血紅蛋白濃度和白細(xì)胞數(shù)量與在相同儀器上使用本發(fā)明實(shí)施例3的溶解劑組合物(配方3b)獲得的結(jié)果之間的相關(guān)性。
圖7a至7e顯示了在COULTER COUNTER_S-Plus Ⅳ上所獲得的白細(xì)胞數(shù)量、白細(xì)胞差別計(jì)數(shù)和血紅蛋白濃度與在相同儀器上使用本發(fā)明實(shí)施例4的溶解劑組合物(配方4a)和稀釋劑獲得的結(jié)果的相關(guān)性。
圖8a和8b是按照在實(shí)施例5中描述的方法使用本發(fā)明實(shí)施例5的溶解劑和稀釋劑組合物(配方5a和5b)處理的兩個(gè)全血樣品的吸收光譜。
圖9a和9b顯示按照在實(shí)施例6中所描述的方法使用實(shí)施例6的溶解劑和稀釋劑組合物處理的全血樣的圖譜和白細(xì)胞亞群的分布直方圖。
圖10a和10b顯示使用實(shí)施例7所述的溶解劑(配方7a)和方法測(cè)定的全血樣的圖譜和白細(xì)胞亞群的分布直方圖。
圖11a和11b顯示使用實(shí)施例7所述的溶解劑(配方7b)和方法測(cè)定的全血樣的圖譜和白細(xì)胞亞群的分布直方圖。
優(yōu)選實(shí)施方案的詳細(xì)描述一般來(lái)說(shuō)，要用光度測(cè)定法測(cè)定血樣中的總血紅蛋白濃度，必須使用溶血試劑溶解紅細(xì)胞并釋放血紅蛋白，然后把血紅蛋白轉(zhuǎn)化成穩(wěn)定的色原，這種色原可以在預(yù)定的波長(zhǎng)由紫外光譜發(fā)現(xiàn)和測(cè)定。對(duì)于定量和精確的測(cè)定，所形成的色原需要是穩(wěn)定的，至少在測(cè)定的時(shí)間范圍內(nèi)穩(wěn)定。紅細(xì)胞的溶解可以通過(guò)酸溶解、滲透溶解和使用各種天然以及合成的表面活性劑完成。釋放的血紅蛋白包括各種形式，如氧合血紅蛋白、脫氧血紅蛋白、高鐵血紅蛋白、碳氧血紅蛋白等。
大多數(shù)把血紅蛋白轉(zhuǎn)化成穩(wěn)定色原的有效方法是提供配體，該配體對(duì)血紅素鐵具有高親和性以形成穩(wěn)定的血紅蛋白復(fù)合物。這已用氰化正鐵血紅蛋白方法成功地證明，其中氰陰離子對(duì)血紅素鐵具有極高的親和性。術(shù)語(yǔ)血紅蛋白復(fù)合物和血紅蛋白色原在本發(fā)明上下文中可以互換使用。通常，在缺少高親和性配體的情況下，所形成的血紅蛋白色原不十分穩(wěn)定。其吸光度有變化，并且在大多數(shù)情況下隨時(shí)間衰減。在這種情況下，分析方法不可靠(即使很好地監(jiān)控并校正降解反應(yīng)的動(dòng)力學(xué))，因?yàn)樯赡軐?duì)環(huán)境(如溫度和樣品制備條件等)十分敏感。當(dāng)提供了適合的血紅蛋白配體時(shí)，血紅蛋白轉(zhuǎn)變可以是定量的，形成的血紅蛋白復(fù)合物的穩(wěn)定性確保分析方法的可靠性。
配體的選擇取決于要完成的分析，例如，僅用于血紅蛋白測(cè)定，或用于多個(gè)診斷分析，如血紅蛋白測(cè)定同時(shí)結(jié)合白細(xì)胞計(jì)數(shù)或白細(xì)胞亞群分類計(jì)數(shù)。如果配體不與其它分析相容，對(duì)于血紅蛋白測(cè)定來(lái)說(shuō)極好的配體可能不適合于后者的應(yīng)用。Sakata公開(kāi)的例子(在U．S．5，242，832中)中用于溶解紅細(xì)胞并形成Hgb-SLS色原的SLS不能用于白細(xì)胞測(cè)定。
本發(fā)明的第一個(gè)實(shí)施方案涉及一種無(wú)氰化物的溶解劑組合物，該組合物用于測(cè)定血樣中總血紅蛋白濃度，或同時(shí)進(jìn)行白細(xì)胞計(jì)數(shù)或白細(xì)胞亞群的分類計(jì)數(shù)。無(wú)氰化物溶解劑組合物包含以下物質(zhì)的水溶液(Ⅰ)至少一種足以溶解紅細(xì)胞并釋放量血紅蛋白量的表面活性劑，該表面活性劑選自季銨鹽，由下述分子結(jié)構(gòu)表示 其中R1是有10-18個(gè)碳原子的烷基、鏈烯基或炔基；R2、R3和R4是有1-4個(gè)碳原子的烷基，X-是氯或溴陰離子；吡啶鎓鹽，由下述分子結(jié)構(gòu)表示 其中n是7-12的整數(shù)，X-是陰離子基團(tuán)；烷基磺酸、或烷基磺酸的堿金屬鹽；有機(jī)磷酸酯，或有機(jī)磷酸酯的堿金屬鹽；
(Ⅱ)足以與血紅蛋白形成穩(wěn)定的色原量的有機(jī)配體，該有機(jī)配體選自(a)三唑如1，2，3-三唑和1，2，4-三唑，及三唑衍生物如1，2，4-三唑-3-硫醇、1，2，4-三唑鈉鹽衍生物、三唑二羧酸和三唑的雜環(huán)衍生物；(b)四唑及其衍生物如5-氨基四唑；(c)下式的4，6-二羥基-1，3，5-三嗪-2-羧酸的堿金屬鹽 其中M是堿金屬陽(yáng)離子；(d)蜜胺 (e)苯胺-2-磺酸 (f)喹哪啶酸 (g)2-氨基-1，3，4-噻二唑 (h)下式的三嗪及其衍生物 其中R1、R2和R3是-H、-OH、-SH、-COOH以及三嗪的雜環(huán)衍生物；(i)尿唑 (j)DL-2-哌啶酸 (k)異煙酰胺 (l)鄰氨基苯甲腈 (m)6-氮雜-2-硫代胸腺嘧啶 (n)腺嘌呤 (o)3-(2-噻吩基)丙烯酸 (p)下式的苯甲酸或苯甲酸的堿金屬或銨鹽 其中R是-H、NH4+或堿金屬陽(yáng)離子；(q)下式的吡嗪及其衍生物 其中R1、R2R3和R4是-H、-CN、-OH、-SH、-COOH或-CONH2。
如本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所知，上述有機(jī)配體的衍生物是指帶有母體化合物的功能部分如三唑環(huán)、四唑環(huán)和三嗪環(huán)的衍生物分子。
溶解劑組合物的pH是1-13。
在表面活性劑中，季銨鹽是更優(yōu)選的。在溶解劑組合物中的表面活性劑的濃度需要足以溶解紅細(xì)胞并釋放血紅蛋白、而同時(shí)保存白細(xì)胞核。為了對(duì)白細(xì)胞計(jì)數(shù)，不需要使白細(xì)胞膜保持完整。一般來(lái)說(shuō)，使用上述的本發(fā)明溶解劑組合物中的表面活性劑時(shí)，當(dāng)紅細(xì)胞完全溶解和破壞時(shí)，白細(xì)胞膜部分溶解。白細(xì)胞留下的核使得可以使用DC阻抗方法計(jì)數(shù)白細(xì)胞并將白細(xì)胞亞群區(qū)別成淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞和粒細(xì)胞。在溶解劑組合物中的表面活性劑濃度是大約2g／L至大約250g／L，優(yōu)選地是大約4g／L至大約80g／L。
在溶解劑組合物中的有機(jī)配體的濃度需要足以形成穩(wěn)定的血紅蛋白色原。該濃度隨配體類型變化而變化，取決于配體對(duì)血紅蛋白的親和性。一般來(lái)說(shuō)，如果在溶解劑組合物中的配體的量不足，所形成的血紅蛋白色原不穩(wěn)定。發(fā)現(xiàn)在本發(fā)明的溶解劑組合物中的有機(jī)配體的濃度在大約1g／L至大約30g／L、優(yōu)選地大約2g／L至大約15g／L的寬范圍中有效。
在溶解劑組合物中的化學(xué)成分的濃度就是在采用常用的血液分析儀使用適合的血液稀釋劑進(jìn)行血紅蛋白及白細(xì)胞測(cè)定的條件下的濃度。然而，化學(xué)成分的濃度可以依賴于溶解劑組合物和稀釋劑的體積比而改變。
任選性的添加劑也可以包含在溶解劑組合物中，濃度使其存在與溶解劑組合物的主要功能組分相容即可。這些添加劑有保存劑，它具有抗氧化性質(zhì)(以增加組合物的貨架壽命)以及抗微生物性質(zhì)。
本發(fā)明的第一實(shí)施方案還涉及使用上述無(wú)氰化物溶解劑組合物測(cè)定血樣中的總血紅蛋白濃度、或同時(shí)對(duì)白細(xì)胞計(jì)數(shù)或?qū)Π准?xì)胞亞群的分類計(jì)數(shù)的方法。
將抗凝結(jié)的血樣通過(guò)適合的血液稀釋劑稀釋，然后將足量的上述溶解劑組合物與所稀釋的樣品手工混合或機(jī)械混合。血液的稀釋比是大約125∶1至大約500∶1(總試劑量相對(duì)于血液)。然后在添加溶解劑組合物后8-60秒在紫外分光計(jì)上或在裝備有紫外檢測(cè)器的自動(dòng)血液分析儀上、在預(yù)定的用于總血紅蛋白測(cè)定的吸光波長(zhǎng)下用光度法測(cè)定樣品混合物。也可以將樣品混合物引入裝備有紫外檢測(cè)器和DC阻抗測(cè)定裝置的血液分析儀中，以測(cè)定血樣的血紅蛋白濃度和對(duì)白細(xì)胞計(jì)數(shù)，或基于所獲得的群體分布直方圖進(jìn)一步區(qū)別白細(xì)胞亞群。在后一種情況下，白細(xì)胞分成三個(gè)亞群，包括淋巴細(xì)胞，單核細(xì)胞和粒細(xì)胞。
利用裝備有DC阻抗測(cè)定裝置的血液分析儀對(duì)白細(xì)胞計(jì)數(shù)的檢測(cè)方法在Wallace H．Coulter的美國(guó)專利2，656，508中有綜合描述，其內(nèi)容整個(gè)引入本文作為參考。使用DC阻抗測(cè)定法區(qū)別白細(xì)胞亞群的方法在美國(guó)專利4，485，175和4，528，274中有描述。
以上所述的有機(jī)配體(如三唑和蜜胺)不僅可以與血紅蛋白形成穩(wěn)定的色原，而且使白細(xì)胞在處理的樣品混合物中穩(wěn)定。該白細(xì)胞穩(wěn)定效果阻止了白細(xì)胞溶解和核收縮，有利于基于其核體積分離白細(xì)胞亞群，并使得可能在大范圍pH值內(nèi)將白細(xì)胞分成三個(gè)亞群。實(shí)施例4說(shuō)明了在本發(fā)明的溶解劑組合物中使用白細(xì)胞穩(wěn)定化配體的成功例子。
另一方面，上述的一些有機(jī)配體(如苯胺-2-磺酸和喹哪啶酸)表現(xiàn)出對(duì)白細(xì)胞亞群的核大小的中等到強(qiáng)的沖擊。當(dāng)這些配體用于血紅蛋白測(cè)定時(shí)，白細(xì)胞亞群破裂成一或兩個(gè)組，使白細(xì)胞的區(qū)別變得困難。然而，即使有這些配體，白細(xì)胞核大小遠(yuǎn)保持在溶解劑組合物處理樣品后的細(xì)胞碎片之上，并在常用的DC阻抗測(cè)定裝置的檢測(cè)限之上，這樣，如在實(shí)施例3中的應(yīng)用所說(shuō)明的，白細(xì)胞的精確計(jì)數(shù)可以方便地在商業(yè)血液分析儀上完成。
一般來(lái)說(shuō)，包含上述有機(jī)配體和表面活性劑的第一實(shí)施方案的溶解劑組合物可以在非常大范圍的pH值內(nèi)測(cè)定血樣的總血紅蛋白濃度。優(yōu)選地，一種或幾種季銨鹽與任何有機(jī)配體的結(jié)合用于提供通過(guò)DC阻抗測(cè)定方法測(cè)定血樣中的總血紅蛋白濃度和白細(xì)胞計(jì)數(shù)。更優(yōu)選地，一種或幾種季銨鹽與和白細(xì)胞分類分析相容的有機(jī)配體的結(jié)合用于提供血樣的總血紅蛋白濃度的測(cè)定、白細(xì)胞計(jì)數(shù)和白細(xì)胞亞群的分類計(jì)數(shù)。在最優(yōu)選的方式中，白細(xì)胞被分成三個(gè)亞群，包括淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞和粒細(xì)胞。
無(wú)氰化物溶解劑組合物和使用該組合物的方法與現(xiàn)有技術(shù)的血紅蛋白測(cè)定方法相比具有幾個(gè)優(yōu)點(diǎn)。本發(fā)明使得可以在無(wú)氰化物的條件下精確測(cè)定血樣中的血紅蛋白濃度并確定白細(xì)胞數(shù)量或?qū)准?xì)胞亞群區(qū)別成淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞和粒細(xì)胞。溶解劑組合物將存在于血樣中的血紅蛋白在大約8秒-60秒(取決于所使用的有機(jī)配體與稀釋劑)迅速轉(zhuǎn)化成穩(wěn)定的色原，使得可以進(jìn)行快速自動(dòng)分析。血紅蛋白色原一旦形成，在測(cè)定時(shí)期是穩(wěn)定的。
圖2顯示了按照實(shí)施例1的方法使用配方1a的溶解劑組合物(包含四唑作為血紅蛋白配體、COULTER_ISOTON_Ⅱ(商業(yè)血液稀釋劑)作為稀釋劑)處理的血樣的一系列吸收光譜。圖2說(shuō)明了在添加溶解劑組合物后從12秒至12小時(shí)(以一個(gè)小時(shí)的間隔)獲得的十二個(gè)圖譜。Hgb-四唑色原的圖譜十分穩(wěn)定，在十二小時(shí)的數(shù)據(jù)收集期間沒(méi)有表現(xiàn)出任何變化或衰減。
具體血紅蛋白色原的性質(zhì)取決于用于溶解劑組合物的有機(jī)配體。通過(guò)使用以上所述的有機(jī)配體用本發(fā)明的溶解劑組合物處理血樣形成的大多數(shù)色原在大約510nm至大約560nm具有最大吸光度。因此，色原可以通過(guò)大部分商業(yè)的血液分析儀結(jié)合具體色原的吸光系數(shù)測(cè)定。
第一實(shí)施方案的溶解劑組合物可以與許多適合的血液稀釋劑一起使用。圖3顯示了使用包含四唑的溶解劑組合物(實(shí)施例2)、并使用標(biāo)準(zhǔn)的磷酸緩沖鹽水和商業(yè)血液稀釋劑COULTER_1SOTON_Ⅲ作為稀釋劑由上述方法處理的全血樣的圖譜。用這兩種稀釋劑，基本上形成了相同的血紅蛋白色原，可以在540nm下測(cè)定。
不同于以前的試劑，上述的溶解劑組合物具有寬范圍的pH值(1-13)。這加寬了可以用作血紅蛋白配體的化學(xué)藥品的范圍。例如，4，6-二羥基-1，3，5-三嗪-2-羧酸的鉀鹽與血紅蛋白形成穩(wěn)定的色原，在538nm具有強(qiáng)吸光度。然而，4，6-二羥基-1，3，5-三嗪-2-羧酸的鉀鹽僅在低pH值(小于pH3)下易溶于水中。以前的中性和堿性試劑不可能使用這種化學(xué)物質(zhì)用于血紅蛋白的測(cè)定。Sakata在美國(guó)專利5，242，832中說(shuō)明如果pH值是3．0或更低，對(duì)白細(xì)胞的破壞增加，這樣使白細(xì)胞的測(cè)定變得困難。圖4顯示了按照本發(fā)明的方法使用實(shí)施例4的溶解劑組合物(含有0．5％的4，6-二羥基-1，3，5-三嗪-2-羧酸鉀鹽，并具有2．3的pH值)和COULTER_lSOTON_Ⅲ(作為稀釋劑)所獲得的白細(xì)胞亞群分布直方圖。如圖4c和4d所說(shuō)明的，白細(xì)胞被清楚地分成淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞和粒細(xì)胞。圖6b顯示了在商業(yè)自動(dòng)血液分析儀COULTER_STKS上獲得的白細(xì)胞數(shù)量與在相同的儀器上使用實(shí)施例3的溶解劑組合物之一(配方3b)獲得的結(jié)果之間具有極好的線性相關(guān)性，其中溶解劑組合物的pH值僅為1．67。
第一實(shí)施方案的溶解劑組合物和使用該組合物的方法提供了精確的血紅蛋白測(cè)定、精確的白細(xì)胞計(jì)數(shù)以及白細(xì)胞亞群的分類計(jì)數(shù)。圖5a和6a顯示了在COULTER_STKS上使用常用的溶解劑獲得的血紅蛋白濃度和使用實(shí)施例3的溶解劑組合物(配方3a和3b)獲得的血紅蛋白濃度之間具有極好的線性相關(guān)性。圖5b和6b說(shuō)明了在COULTER_STKS上獲得的白細(xì)胞數(shù)量和在相同的儀器上使用配方3a和3b所獲得的結(jié)果之間具有極好的相關(guān)性。
該實(shí)施方案的溶解劑組合物提供了在常見(jiàn)的干擾材料存在下精確的血紅蛋白測(cè)定?？偣?2個(gè)全血樣品在COULTER_STKS上使用實(shí)施例3的配方3a分析。樣品的70％是各種疾病(如鐮狀細(xì)胞危象和丙型肝炎)的臨床樣品。已知這些異常的血液含有異常血紅蛋白和血紅蛋白測(cè)定的干擾材料。然而，使用本發(fā)明的溶解劑組合物和方法的測(cè)定結(jié)果與常用的氰化物-Hgb方法相關(guān)性極好(如由圖5和6所示)，這表明了各種臨床樣品的總血紅蛋白濃度都可以通過(guò)使用本發(fā)明的溶解劑組合物測(cè)定。
本發(fā)明的第二個(gè)實(shí)施方案涉及另一種利用有機(jī)配體穩(wěn)定血紅蛋白的功能的方式，它是將有機(jī)配體添加到血液稀釋劑而非溶解劑組合物中。按照以上所述的方法，血樣在與溶解劑混合之前使用血液稀釋劑預(yù)先稀釋。當(dāng)稀釋劑含有以上所述的有機(jī)配體時(shí)，在通過(guò)溶解劑從紅細(xì)胞釋放之后的樣品混合物中的血紅蛋白分子立即與有機(jī)配體接觸以形成穩(wěn)定的血紅蛋白色原。因此，該替代方式用于血樣中血紅蛋白測(cè)定的相同目的。然而，它使試劑設(shè)計(jì)者基于其特定需要(例如，有機(jī)配體對(duì)溶解劑或稀釋劑需要進(jìn)行的血紅蛋白測(cè)定以外的其它檢測(cè)的相容性，或有機(jī)配體對(duì)溶解劑或稀釋劑中的其它化學(xué)成分的相容性)可以選擇最適合的方式。實(shí)施例5說(shuō)明了有機(jī)配體在血液稀釋劑中這種應(yīng)用以形成穩(wěn)定的血紅蛋白色原，其中的溶解劑僅含有表面活性劑。圖9a顯示了按照實(shí)施例6的方法使用包含三唑作為血紅蛋白配體的稀釋劑處理的血樣的圖譜。色原的特征與使用在圖1a中顯示的包含相同配體的溶解劑組合物所獲得的色原的特征相同。圖9b顯示了通過(guò)使用實(shí)施例6的稀釋劑在COULTER COUNTER_S-Plus Ⅳ上獲得的血樣的白細(xì)胞分布直方圖，其中溶解劑僅含有表面活性劑。該例子顯示了當(dāng)以這種替代方式使用時(shí)，有機(jī)配體與白細(xì)胞分類分析的相容性。
本發(fā)明的第三個(gè)實(shí)施方案使用單一溶解劑組合物稀釋并溶解血細(xì)胞樣品用于血紅蛋白測(cè)定以及白細(xì)胞分析，而無(wú)需用血液稀釋劑進(jìn)行預(yù)稀釋。在該方法中，調(diào)節(jié)第一個(gè)實(shí)施方案的溶解劑組合物中的化學(xué)成分的濃度至足以溶解紅細(xì)胞并形成穩(wěn)定的血紅蛋白色原。為進(jìn)行白細(xì)胞計(jì)數(shù)或分類計(jì)數(shù)白細(xì)胞亞群，調(diào)節(jié)該同一溶解劑組合物的電導(dǎo)率使其可用于阻抗測(cè)定。通過(guò)加入足夠量的一種或多種鹽調(diào)節(jié)電導(dǎo)率。用于本發(fā)明的該單一的溶解劑組合物的適宜鹽包括各種陰離子的堿金屬鹽。適宜的實(shí)例包括硫酸、鹽酸、甲酸、乙酸和檸檬酸的堿金屬鹽及堿金屬碳酸氫鹽。需加入足以調(diào)節(jié)所述溶解劑的電導(dǎo)率至使用自動(dòng)血液分析儀可進(jìn)行測(cè)定的水平的鹽。使用該單一溶解劑，可將血細(xì)胞樣品中的白細(xì)胞區(qū)分為至少兩個(gè)亞群，優(yōu)選區(qū)分為三個(gè)亞群，同時(shí)可測(cè)定血紅蛋白濃度并計(jì)數(shù)白細(xì)胞總數(shù)。如附圖10b和11b所示，使用實(shí)施例7的單一溶解劑可獲得兩個(gè)白細(xì)胞亞群，它們是淋巴樣細(xì)胞和髓樣細(xì)胞群。
用于該單一溶解劑的表面活性劑包括季銨鹽和吡啶鎓鹽，在第一個(gè)實(shí)施方案中對(duì)它們進(jìn)行了詳細(xì)描述。優(yōu)選將季銨鹽用于該單一溶解劑。該單一溶解劑中的表面活性劑和有機(jī)配體的濃度通常低于與稀釋劑使用的溶解劑組合物中的濃度。表面活性劑的濃度為約0．3g／L-約200g／L。有機(jī)配體的濃度為約0．1g／L-約30g／L。該單一溶解劑的pH范圍和與稀釋劑使用的溶解劑的pH略有不同。該單一溶解劑的pH為約3-約13，優(yōu)選為約3．5-約11。實(shí)施例7顯示了兩個(gè)單一試劑方法的實(shí)例。
單一試劑方法提供了一步樣品制備法，降低了設(shè)備的成本。
下列實(shí)施例是對(duì)本發(fā)明的說(shuō)明，決不能解釋為限制如在權(quán)利要求書(shū)中所定義的本發(fā)明的范圍?？梢岳斫獍凑找陨瞎_(kāi)的內(nèi)容，可以使用不同的其它成分和比例。
實(shí)施例1制備下列組成的試劑。配方1a四唑5．0g十四烷基三甲基溴化銨15．0g蒸餾水，調(diào)整至1升pH2．77配方1b三唑 10．0g十二烷基三甲基氯化銨(50％溶液)35．0ml十四烷基三甲基溴化銨 3．5g蒸餾水，調(diào)整至1升pH6．19配方1c喹哪啶酸 5．0g十二烷基三甲基氯化銨(50％溶液)50．0ml蒸餾水，調(diào)整至1升pH2．55配方1d蜜胺 5．0g十四烷基三甲基溴化銨 3．6g十二烷基三甲基氯化銨(50％溶液)36．0ml蒸餾水，調(diào)整至1升pH4．55配方le四唑 5．0gChemfac NB-104(由Chemax公司制造的復(fù)合磷酸鹽)30．0g蒸餾水，調(diào)整至1升pH7．11
用2500μl的ISOTON_Ⅱ稀釋11．6μl的全血樣品，然后將403μl的上述溶解劑組合物之一與預(yù)先稀釋的樣品手工混合。立即在BeekmanDU 7500分光光度計(jì)上測(cè)定樣品的吸收光譜。圖1a和1b顯示了按照上述方法使用配方1b和1c處理的血樣的圖譜。圖2顯示了從按照上述方法使用配方1a處理的血樣獲得的總共十二個(gè)圖譜。在添加溶解劑組合物之后從12秒-12小時(shí)以一小時(shí)的間隔獲得的圖譜。
實(shí)施例2制備下列組成的試劑。四唑 5．0g十二烷基三甲基氯化銨(50％溶液) 36．0ml十四烷基溴化銨 3．6g蒸餾水 1升pH 2．73用2500μl的血液稀釋劑稀釋11．6μl的全血樣品，然后將403μl的上述溶解劑組合物與預(yù)先稀釋的樣品手工混合。立即在Beekman DU7500分光光度計(jì)上測(cè)定樣品的吸收光譜。使用了五種商業(yè)血液稀釋劑用于血紅蛋白測(cè)定，即COULTER_ISOTON_Ⅲ、COULTER_ISOTON_Ⅱ、Technicon H·TMSystems RBC DIL(Technicon儀器公司的商品)、標(biāo)準(zhǔn)磷酸緩沖鹽水和標(biāo)準(zhǔn)氯化鈉鹽水。所形成的色原在大約540nm具有最大吸收峰，在大約565nm具有肩峰。當(dāng)不同的稀釋劑用于血紅蛋白測(cè)定時(shí)，色原的最大吸收僅有輕微不同，即用ISOTON_Ⅲ在540nm，ISOTON_Ⅱ、Technicon H·TMSystems RBC DIL以及標(biāo)準(zhǔn)的磷酸緩沖鹽水在539nm，標(biāo)準(zhǔn)的氯化鈉鹽水在538nm。在添加上述溶解劑組合物之后，色原在8秒-約35秒(取決于使用的血液稀釋劑)后立即形成。圖3顯示了按照上述方法使用標(biāo)準(zhǔn)的磷酸緩沖鹽水和ISOTON_Ⅲ(作為稀釋劑)獲得的圖譜。
實(shí)施例3制備下列組成的試劑。配方3a四唑 5．0g十四烷基三甲基溴化銨 15．0g蒸餾水，調(diào)整至1升pH12．06配方3b苯胺-2-磺酸 5．0g十四烷基三甲基溴化銨 10．0g十六烷基三甲基溴化銨 4．0g蒸餾水1升pH1．67配方3c喹哪啶酸 5．0g十二烷基三甲基氯化銨(50％溶液)40．0ml蒸餾水1升pH2．58將大約70個(gè)血樣(其血紅蛋白濃度為6-17g／dL，白細(xì)胞數(shù)目為1，000／μL-40，000／μL)在校準(zhǔn)的COULTER_STKS儀器上在標(biāo)準(zhǔn)儀器設(shè)置下(除溶解劑外，LYSE S_Ⅲ diff由上述制劑代替)分析。對(duì)于每一種配方，大約一半樣品是各種疾病的臨床樣品。在配方3a的情況下，70％樣品是臨床樣品。圖5顯示了通過(guò)使用參考試劑(LYSE S_Ⅲdiff)獲得的血紅蛋白濃度和白細(xì)胞數(shù)量(表示為以103／μL為單位的WBC)與在相同的儀器上使用配方3a獲得的結(jié)果之間的相關(guān)性。圖6顯示了通過(guò)使用LYSE S_Ⅲ diff獲得的血紅蛋白濃度和白細(xì)胞數(shù)量與在相同的儀器上使用配方3b獲得的結(jié)果之間的相關(guān)性。
圖5和6說(shuō)明了在血紅蛋白濃度和WBC測(cè)定上本發(fā)明的溶解劑組合物和常用的含氰化物溶解劑之間極好的線性相關(guān)性。
實(shí)施例4制備下列組成的試劑。
溶解劑配方4a三唑10．0g十二烷基三甲基氯化銨(50％溶液) 35．0ml十四烷基三甲基溴化銨3．5g蒸餾水，調(diào)整至1升pH 6．39配方4b4，6-二羥基-1，3，5-三嗪-2-羧酸鉀鹽 5．0g十二烷基三甲基氯化銨(50％溶液) 35．0ml十四烷基三甲基溴化銨3．5g蒸餾水，調(diào)整至1升用HCl將pH調(diào)整至2．3稀釋劑硫酸鈉 9．7g氯化鈉 4．0g蒸餾水，調(diào)整至1升用1％NaOH將pH調(diào)整至7．14將85個(gè)血樣(其血紅蛋白濃度為6-17g／dL，白細(xì)胞數(shù)目為1，500／μL-45，000／μL)在校準(zhǔn)的COULTER COULTER_S-Plus Ⅳ上在標(biāo)準(zhǔn)儀器設(shè)置下使用參考試劑LYSE S_Ⅲ diff和ISOTON_Ⅲ分析。然后在相同的儀器上再次分析相同的樣品，只是溶解劑LYSE S_Ⅲ diff由上述溶解劑組合物代替，ISOTON_Ⅲ由上述稀釋劑代替。圖4顯示了在COULTER COULTER_S-Plus上獲得的四個(gè)血樣的白細(xì)胞亞群分布直方圖。圖4a和4b使用配方4a和上述稀釋劑獲得，其中圖4a顯示了正常血液的直方圖，圖4b顯示了具有高單核細(xì)胞的血樣的直方圖。圖4c和4d使用配方4b和ISOTON_Ⅲ獲得，其中圖4c顯示了正常血液的直方圖，圖4d顯示了具有大于90％粒細(xì)胞的臨床樣品的直方圖。圖7a-7e顯示了使用參考試劑獲得的白細(xì)胞數(shù)量(以103／μL為單位的WBC，圖7a)、淋巴細(xì)胞％(圖7b)、單核細(xì)胞％(圖7c)、粒細(xì)胞％(圖7d)和血紅蛋白濃度(圖7e)與使用配方4a和上述稀釋劑獲得的結(jié)果之間的相關(guān)性?；貧w曲線的相關(guān)系數(shù)、斜率和截距說(shuō)明了血紅蛋白濃度、WBC、淋巴細(xì)胞％和粒細(xì)胞％極好的線性相關(guān)性，以及對(duì)單核細(xì)胞％的良好相關(guān)性。
實(shí)施例5溶解劑十二烷基三甲基氯化銨(50％溶液) 36．0ml十四烷基三甲基溴化銨3．6g蒸餾水，調(diào)整至1升pH 6．88稀釋劑配方5a四唑5g標(biāo)準(zhǔn)磷酸緩沖鹽水1升pH 3．86配方5b2-氨基-1，3，4-噻唑5．0g硫酸鈉 9．7g氯化鈉 4．0g蒸餾水，調(diào)整至1升pH 6．04用2500μl的上述稀釋劑之一稀釋11．6μl的全血樣品，然后將403μl的上述溶解劑組合物與預(yù)先稀釋的樣品手工混合。立即在BeekmanDU 7500分光光度計(jì)上測(cè)定樣品的吸收光譜。圖8a至8b顯示了按照上述方法分別使用配方5a和5b處理的血樣的圖譜。
實(shí)施例6溶解劑十二烷基三甲基氯化銨(50％溶液) 36．0ml十四烷基三甲基溴化銨 3．6g蒸餾水，調(diào)整至1升pH 6．88稀釋劑三唑 5．0g硫酸鈉 9．7g氯化鈉 4．0g蒸餾水，調(diào)整1升pH 6．06將10個(gè)血樣在校準(zhǔn)的COULTER COULTER_S-Plus Ⅵ上使用上述的溶解劑和稀釋劑分析。圖9a顯示了在COULTER COULTER_S-Plus上獲得的血樣的白細(xì)胞亞群分布直方圖。這些樣品也在分光計(jì)上按照實(shí)驗(yàn)5中描述的方法使用上述溶解劑和稀釋劑處理和測(cè)定。圖9a顯示了用于圖9b的相同血樣的光譜。光譜和白細(xì)胞亞群分布直方圖與三唑用于溶解劑組合物時(shí)獲得的特征相同。
實(shí)施例7配方7a十二烷基三甲基氯化銨(50％溶液) 5．0ml三唑3．0g硫酸鈉 15．9g蒸餾水，調(diào)整至1升pH 6．30配方7b十二烷基三甲基氯化銨(50％溶液) 5．0ml四唑1．0g硫酸鈉 15．9g蒸餾水，調(diào)整至1升pH 3．69將10微升全血樣品與2．5毫升上面的配制品之一手工混合。立即在Beckman DU 7500分光光度計(jì)上測(cè)定吸收譜。附圖10a和11a顯示了分別加入配制品7a和7b后15秒測(cè)得的光譜。在血液學(xué)實(shí)驗(yàn)分析儀上，將另外的12微升全血樣品與3．0毫升上面的配制品之一自動(dòng)化混合。在加入溶解劑10秒后，通過(guò)DC阻抗測(cè)定分析樣品混合物。附圖10b和11b顯示了獲得的白細(xì)胞亞群分布直方圖。如本領(lǐng)域普通專業(yè)技術(shù)人員所知，根據(jù)與溶解劑接觸的白細(xì)胞的大小，調(diào)整DC阻抗測(cè)定的增益以覆蓋所有的細(xì)胞范圍。
權(quán)利要求
1．一種稀釋并溶解血細(xì)胞樣品用于測(cè)定血紅蛋白濃度和白細(xì)胞計(jì)數(shù)的無(wú)氰化物溶解劑組合物，該組合物包含下列物質(zhì)的水溶液(Ⅰ)一種由下列分子結(jié)構(gòu)式表示的季銨鹽 其中R1是有10-18個(gè)碳原子的烷基、鏈烯基或炔基；R2、R3和R4是有1-4個(gè)碳原子的烷基，X-是氯或溴陰離子；或一種由下列分子結(jié)構(gòu)表示的吡啶鎓鹽 其中n是7-12的整數(shù)，X-是陰離子基團(tuán)；其中季銨鹽或吡啶鎓鹽的含量足以溶解紅細(xì)胞并釋放血紅蛋白；(Ⅱ)足以與血紅蛋白形成穩(wěn)定色原量的有機(jī)配體，該有機(jī)配體選自(a)三唑及其衍生物；(b)四唑及其衍生物；(c)下式的4，6-二羥基-1，3，5-三嗪-2-羧酸的堿金屬鹽 其中M是堿金屬陽(yáng)離子；(d)蜜胺 (e)苯胺-2-磺酸 (f)喹哪啶酸 (g)2-氨基-1，3，4-噻二唑 (h)下式的三嗪及其衍生物 其中R1、R2和R3是-H、-OH、-SH、-COOH以及三嗪的雜環(huán)衍生物；(i)尿唑 (j)DL-2-哌啶酸 (k)異煙酰胺 (l)鄰氨基苯甲腈 (m)6-氮雜-2-硫代胸腺嘧啶 (n)3-(2-噻吩基)丙烯酸 (o)下式的苯甲酸或苯甲酸的堿金屬或銨鹽 其中R是-H、NH4+或堿金屬陽(yáng)離子；和(p)下式的吡嗪及其衍生物 其中R1、R2R3和R4是-H、-CN、-OH、-SH、-COOH或-CONH2；以及(Ⅲ)足以調(diào)節(jié)溶解劑的電導(dǎo)率以進(jìn)行阻抗測(cè)定量的鹽。
2．權(quán)利要求1的溶解劑組合物，其中用于調(diào)節(jié)溶解劑的電導(dǎo)率的鹽包括堿金屬硫酸鹽、氯化物、甲酸鹽、乙酸鹽、檸檬酸鹽和碳酸氫鹽。
3．權(quán)利要求1的溶解劑組合物，其中所述的表面活性劑包含大約0．3g／L至大約200g／L濃度的季銨鹽。
4．權(quán)利要求1的溶解劑組合物，其中所述的表面活性劑包含大約0．5g／L至大約130g／L濃度的吡啶鎓鹽。
5．權(quán)利要求1的溶解劑組合物，其中所說(shuō)的有機(jī)配體的濃度為大約0．1g／L至大約30g／L。
6．一種稀釋并溶解血細(xì)胞樣品用于測(cè)定血紅蛋白濃度和白細(xì)胞計(jì)數(shù)的無(wú)氰化物溶解劑組合物，該組合物包含下列物質(zhì)的水溶液(Ⅰ)一種由下列分子結(jié)構(gòu)式表示的季銨鹽 其中R1是有10-18個(gè)碳原子的烷基、鏈烯基或炔基；R2、R3和R4是有1-4個(gè)碳原子的烷基，X-是氯或溴陰離子；其中季銨鹽的含量足以能溶解紅細(xì)胞并釋放血紅蛋白；(Ⅱ)足以形成穩(wěn)定的血紅蛋白色原量的三唑及其衍生物；和(Ⅲ)足以調(diào)節(jié)溶解劑的電導(dǎo)率以進(jìn)行阻抗測(cè)定量的鹽。
7．一種稀釋并溶解血細(xì)胞樣品用于測(cè)定血紅蛋白濃度和白細(xì)胞計(jì)數(shù)的無(wú)氰化物溶解劑組合物，該組合物包含下列物質(zhì)的水溶液(Ⅰ)一種由下列分子結(jié)構(gòu)式表示的季銨鹽 其中R1是有10-18個(gè)碳原子的烷基、鏈烯基或炔基；R2、R3和R4是有1-4個(gè)碳原子的烷基，X-是氯或溴陰離子；其中季銨鹽的含量足以能溶解紅細(xì)胞并釋放血紅蛋白；(Ⅱ)足以形成穩(wěn)定的血紅蛋白色原量的四唑及其衍生物；和(Ⅲ)足以調(diào)節(jié)溶解劑的電導(dǎo)率以進(jìn)行阻抗測(cè)定量的鹽。
8．一種使用稀釋并溶解血細(xì)胞樣品的無(wú)氰化物溶解劑組合物測(cè)定血樣的總血紅蛋白濃度和白細(xì)胞計(jì)數(shù)的方法，該方法包括(1)將血樣與溶解紅細(xì)胞并形成穩(wěn)定的血紅蛋白色原的無(wú)氰化物溶解劑組合物混合，其中所述溶解劑組合物包含下列物質(zhì)的水溶液(Ⅰ)一種由下列分子結(jié)構(gòu)式表示的季銨鹽 其中R1是有10-18個(gè)碳原子的烷基、鏈烯基或炔基；R2、R3和R4是有1-4個(gè)碳原子的烷基，X-是氯或溴陰離子；或一種由下列分子結(jié)構(gòu)表示的吡啶鎓鹽 其中n是7-12的整數(shù)，X-是陰離子基團(tuán)；其中季銨鹽或吡啶鎓鹽的含量足以能溶解紅細(xì)胞并釋放血紅蛋白；(Ⅱ)足以與血紅蛋白形成穩(wěn)定色原量的有機(jī)配體，該有機(jī)配體選自(a)三唑及其衍生物；(b)四唑及其衍生物；(c)下式的4，6-二羥基-1，3，5-三嗪-2-羧酸的堿金屬鹽 其中M是堿金屬陽(yáng)離子；(d)蜜胺 (e)苯胺-2-磺酸 (f)喹哪啶酸 (g)2-氨基-1，3，4-噻二唑 (h)下式的三嗪及其衍生物 其中R1、R2和R3是-H、-OH、-SH、-COOH以及三嗪的雜環(huán)衍生物；(i)尿唑 (j)DL-2-哌啶酸 (k)異煙酰胺 (l)鄰氨基苯甲腈 (m)6-氮雜-2-硫代胸腺嘧啶 (n)3-(2-噻吩基)丙烯酸 (o)下式的苯甲酸或苯甲酸的堿金屬或銨鹽 其中R是-H、NH4+或堿金屬陽(yáng)離子；和(p)下式的吡嗪及其衍生物 其中R1、R2R3和R4是-H、-CN、-OH、-SH、-COOH或-CONH2；以及(Ⅲ)足以調(diào)節(jié)溶解劑的電導(dǎo)率以進(jìn)行阻抗測(cè)定量的鹽。(2)在預(yù)定的波長(zhǎng)下測(cè)定形成的血紅蛋白色原的吸光度；(3)由所測(cè)定的吸光度計(jì)算所述血樣的總血紅蛋白濃度；(4)在自動(dòng)血液分析儀中用DC阻抗測(cè)定法計(jì)數(shù)白細(xì)胞的數(shù)量；和(5)報(bào)告所述血樣的白細(xì)胞數(shù)量。
9．權(quán)利要求8的方法，其中所形成的血紅蛋白色原在大約510nm至大約560nm具有最大吸光度。
10．權(quán)利要求8的方法，其中所述溶解劑組合物包含下列物質(zhì)的水溶液(Ⅰ)一種由下列分子結(jié)構(gòu)式表示的季銨鹽 其中R1是有10-18個(gè)碳原子的烷基、鏈烯基或炔基；R2、R3和R4是有1-4個(gè)碳原子的烷基，X-是氯或溴陰離子；其中季銨鹽的量在用于測(cè)定血紅蛋白濃度中足以溶解紅細(xì)胞并釋放血紅蛋白，在白細(xì)胞分類分析中還保持白細(xì)胞亞群的核；和(Ⅱ)足以與血紅蛋白形成穩(wěn)定色原量的有機(jī)配體，該有機(jī)配體選自(a)三唑及其衍生物；(b)四唑及其衍生物；(c)蜜胺 (d)下式的4，6-二羥基-1，3，5-三嗪-2-羧酸的堿金屬鹽 其中M是堿金屬陽(yáng)離子；(e)2-氨基-1，3，4-噻二唑 (f)尿唑 (g)DL-2-哌啶酸 (h)異煙酰胺 (i)下式的吡嗪及其衍生物 其中R1、R2R3和R4是-H、-CN、-OH、-SH、-COOH或-CONH2；和(Ⅲ)足以調(diào)節(jié)溶解劑的電導(dǎo)率以進(jìn)行阻抗測(cè)定量的鹽。
11．權(quán)利要求10的方法，其中所述季銨鹽的濃度為約0．3g／L-約20g／L。
12.權(quán)利要求10的方法，還包括下列步驟按照群體分布直方圖區(qū)分白細(xì)胞亞群；和報(bào)告白細(xì)胞亞群的數(shù)量。
13.權(quán)利要求10的方法，其中的有機(jī)配體是三唑。
14.權(quán)利要求10的方法，其中的有機(jī)配體是四唑。
15.權(quán)利要求12的方法，其中的白細(xì)胞被區(qū)分為至少兩個(gè)亞群。
全文摘要
本發(fā)明描述了一種用于測(cè)定血樣中總血紅蛋白濃度、計(jì)數(shù)白細(xì)胞和分類計(jì)數(shù)三種白細(xì)胞亞群的無(wú)氰化物的溶解劑組合物以及方法。所說(shuō)的無(wú)氰化物溶解劑組合物包含溶解紅細(xì)胞并釋放血紅蛋白的季銨鹽或吡啶鎓鹽、與血紅蛋白形成穩(wěn)定色原的有機(jī)配體和調(diào)節(jié)試劑以進(jìn)行阻抗測(cè)定的鹽,所述有機(jī)配體選自:三唑及其衍生物、四唑及其衍生物、4,6－二羥基－1,3,5－三嗪－2－羧酸、蜜胺、苯胺－2－磺酸、喹哪啶酸、2－氨基－1,3,4－噻二唑、三嗪及其衍生物、尿唑、DL－2－哌啶酸、異煙酰胺、鄰氨基苯甲腈、6－氮雜－2－硫代胸腺嘧啶、腺嘌呤、3－(2－噻吩基)丙烯酸、苯甲酸和苯甲酸的堿金屬和銨鹽、吡嗪及其衍生物。無(wú)需預(yù)稀釋血樣即可將溶解劑組合物與血樣混合并在預(yù)定吸收波長(zhǎng)測(cè)定樣品混合物的UV吸收。在自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀上,利用DC阻抗測(cè)定方法同時(shí)進(jìn)行白細(xì)胞計(jì)數(shù)和白細(xì)胞亞群分類計(jì)數(shù)。
文檔編號(hào)G01N33/72GK1294682SQ99804278
公開(kāi)日2001年5月9日 申請(qǐng)日期1999年3月16日 優(yōu)先權(quán)日1998年3月24日
發(fā)明者李毅, C·楊 申請(qǐng)人:庫(kù)特國(guó)際公司