專利名稱：白細(xì)胞計數(shù)法及白細(xì)胞計數(shù)裝置的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種樣品中白細(xì)胞的計數(shù)的方法以及用于該計數(shù)方法的計數(shù)裝置。
背景技術(shù)：
在血液檢查中，一般要進行白細(xì)胞計數(shù)，其臨床意義重大。例如，通過紅細(xì)胞數(shù)能夠檢查有無貧血或貧血的程度，也可以診斷由于組織缺氧而引起的各種各樣的癥狀。另一方面，白細(xì)胞是肌體防御功能即免疫功能的核心，能夠抵御侵入體內(nèi)的細(xì)菌和病毒。特別是粒細(xì)胞或白細(xì)胞在細(xì)菌和異體蛋白質(zhì)侵入體內(nèi)時，具有受其刺激釋放彈性蛋白酶等蛋白質(zhì)分解酶發(fā)揮作用的功能。在很多疾病狀況下，白細(xì)胞數(shù)出現(xiàn)增多或減少，因此，白細(xì)胞計數(shù)對疾病的篩選很重要，在疾病需要進行緊急診斷和治療時，成為很重要的一項檢查項目。另外，由于白細(xì)胞數(shù)隨年齡、晝夜、季節(jié)等因素而變化，希望在日常的診斷和治療中，能夠適時、準(zhǔn)確地進行計數(shù)。
目前，白細(xì)胞計數(shù)法可大致分為目測計數(shù)法和自動計數(shù)法兩種。上述目測計數(shù)法是在計數(shù)板上用鏡檢進行計數(shù)的方法。其中，有不經(jīng)處理直接進行計數(shù)和先用染色劑將血細(xì)胞細(xì)胞核染色再進行計數(shù)兩種情況。上述自動計數(shù)法是將血液稀釋到一定濃度后，使其通過極細(xì)的流路，用電阻或散射光檢出血細(xì)胞，計算血細(xì)胞數(shù)的方法。一般使用專用血細(xì)胞計數(shù)裝置進行。這些計數(shù)法雖然依人的視覺或是儀器的不同測定結(jié)果有差別，但它是一種實際計算血細(xì)胞數(shù)的方法。然而，在這些計數(shù)法中，存在以下問題。
發(fā)明公開上述目測法，由于紅細(xì)胞溶血不完全或血細(xì)胞凝集導(dǎo)致的細(xì)胞誤認(rèn)、細(xì)胞在計數(shù)板上分散不均勻以及檢測人員的熟練程度等會產(chǎn)生計數(shù)誤差。另外，目測法因為成紅細(xì)胞等白細(xì)胞以外的有核細(xì)胞也被作為白細(xì)胞計數(shù)，所以，當(dāng)白細(xì)胞以外的有核細(xì)胞進入到末梢血中時，有必要涂抹染色標(biāo)本、測定白細(xì)胞和其他細(xì)胞的比例，進行校正。并且，目測法的計數(shù)是用手進行，計數(shù)時花費時間長。
上述自動計數(shù)法由于成紅細(xì)胞的出現(xiàn)、血纖維蛋白的析出、血小板凝集、紅細(xì)胞溶血不全等原因，有時得不到正確的計數(shù)值。此外，依測定裝置種類的不同，有的通過粒度分布的測定功能和類型認(rèn)知，能夠分類計數(shù)結(jié)果，如果使用這種裝置，易于發(fā)現(xiàn)疾病，但是，這種裝置不但價格高，而且體積也大。不僅是這種特殊裝置，用于上述自動計數(shù)法的血細(xì)胞計數(shù)裝置也存在體積大、昂貴，清洗復(fù)雜的液體流路等機器維護工作煩雜等問題，用于大醫(yī)院檢驗室和檢驗中心等處理大量檢品的地方能發(fā)揮效率，但對于檢品少的中小醫(yī)院和私人開業(yè)診所等就成為很重的負(fù)擔(dān)。
因此，本發(fā)明的目的在于提供一種能夠?qū)⑺醚b置小型化，正確、簡單并且成本低地白細(xì)胞計數(shù)方法以及用于該計數(shù)方法的計數(shù)裝置。
為達(dá)到上述目的，本發(fā)明的白細(xì)胞計數(shù)法通過以下步驟計算出樣品中的白細(xì)胞數(shù)。其中包括使樣品內(nèi)白細(xì)胞中的嗜中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞及嗜堿性粒細(xì)胞(以下將這些血細(xì)胞稱作“粒細(xì)胞”)釋放出內(nèi)部的彈性蛋白酶，將抗粒細(xì)胞彈性蛋白酶抗體加到這種彈性蛋白酶上，通過測定結(jié)合到上述彈性蛋白酶上的抗粒細(xì)胞彈性蛋白酶抗體，測定彈性蛋白酶濃度，由該濃度及白細(xì)胞數(shù)、粒細(xì)胞數(shù)或嗜中性粒細(xì)胞數(shù)與彈性蛋白酶濃度的已知比例，計算出樣品中的白細(xì)胞數(shù)。
因此，本發(fā)明的計數(shù)法并非實際計算白細(xì)胞數(shù)，而是通過測定粒細(xì)胞內(nèi)的彈性蛋白酶濃度，間接地計算出白細(xì)胞數(shù)的一種方法。
在白細(xì)胞中有嗜中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞5種，上述嗜中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞及嗜堿性細(xì)胞3種合稱粒細(xì)胞。而且，血液中白細(xì)胞數(shù)和各級分的比例在小孩和老年人中略有不同，但無性別差異，幾乎保持一定的值。例如，成人血液中的白細(xì)胞數(shù)約為6700個／μl，其級分的平均比例為嗜中性粒細(xì)胞55．3％、嗜酸性粒細(xì)胞3．5％、嗜堿性粒細(xì)胞0．5％、單核細(xì)胞5．0％、淋巴細(xì)胞36．6％。另外，粒細(xì)胞在白細(xì)胞中數(shù)量最多，其內(nèi)部有大量的彈性蛋白酶。粒細(xì)胞彈性蛋白酶是在粒細(xì)胞受到吞噬細(xì)胞和炎癥的刺激或受到損傷時釋放出的物質(zhì)，因此與病變相對應(yīng)。在血液中，上述彈性蛋白酶與α1-抗胰蛋白酶等蛋白酶抑制劑結(jié)合處于失活狀態(tài)，其平均對流時間約10小時左右，一經(jīng)排出到組織或尿液中，就不再返回到循環(huán)血中。一般情況下，血漿中彈性蛋白酶的濃度是粒細(xì)胞中的幾百分之一，基本上可以忽略不記。進而，粒細(xì)胞彈性蛋白酶與胰腺彈性蛋白酶不同，其抗體也與胰腺彈性蛋白酶無任何交叉反應(yīng)。本發(fā)明利用這些性質(zhì)。即，使粒細(xì)胞溶血，釋放其內(nèi)部彈性蛋白酶，若使用免疫學(xué)方法進行測定，樣品即便是血液，也能夠正確地測定其濃度，然后，由該濃度及白細(xì)胞數(shù)等與彈性蛋白酶濃度兩者的已知比例，計算出樣品中的白細(xì)胞數(shù)。這樣，由于是根據(jù)粒細(xì)胞內(nèi)彈性蛋白酶的濃度計算白細(xì)胞數(shù)，所以不受成紅細(xì)胞等白細(xì)胞以外的有核細(xì)胞、血纖維蛋白析出、血小板凝集以及紅細(xì)胞溶血等的干擾，而且所用裝置也能夠小型化，降低了計數(shù)費用，并且由于使用免疫學(xué)方法進行測定，其結(jié)果也不受檢測人員熟練程度的影響。
另外，在本發(fā)明中，所述的白細(xì)胞含有兩種意義，即嗜中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞中的各種白細(xì)胞與總白細(xì)胞。因此，在本發(fā)明中被計數(shù)的白細(xì)胞數(shù)既可以是包含嗜中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞3種的粒細(xì)胞等構(gòu)成白細(xì)胞的各種白細(xì)胞數(shù)，也可以是總白細(xì)胞數(shù)。
在本發(fā)明中，優(yōu)選使用一種與樣品內(nèi)蛋白酶抑制劑相同的蛋白酶抑制劑，使之結(jié)合于被釋放的彈性蛋白酶上，然后在上述樣品中加入抗粒細(xì)胞彈性蛋白酶抗體。這是因為血液等樣品中含有蛋白酶抑制劑時，可以排除其影響。因此，當(dāng)樣品為全血時，蛋白酶抑制劑理想為α1-抗胰蛋白酶。因為α1-抗胰蛋白酶在血液內(nèi)的蛋白酶抑制劑中含量最多(90％)。
在本發(fā)明計數(shù)法中，作為免疫學(xué)方法優(yōu)選采用乳膠凝集免疫測定法。即，優(yōu)選將抗體粒子與粒細(xì)胞釋放的彈性蛋白酶進行抗原抗體反應(yīng)，通過測定上述乳膠粒子的凝集度，測定結(jié)合到上述彈性蛋白酶上的上述抗粒細(xì)胞彈性蛋白酶抗體。其中，上述抗體粒子是將抗粒細(xì)胞彈性蛋白酶抗體結(jié)合到乳膠粒子上形成的。乳膠凝集免疫測定法，由于抗原抗體反應(yīng)快，而且是一種不需要進行B／F分離(結(jié)合型／游離型)的勻相免疫測定法，因此，該方法能夠以較少的工序、簡單的操作及低成本加以實施。此外，也可以先將抗粒細(xì)胞彈性蛋白酶抗體預(yù)先結(jié)合到固相上，再將被釋放的彈性蛋白酶結(jié)合于該抗粒細(xì)胞彈性蛋白酶抗體，在此狀態(tài)下，再加入標(biāo)記的抗粒細(xì)胞彈性蛋白酶抗體，測定結(jié)合于彈性蛋白酶上的上述標(biāo)記抗粒細(xì)胞彈性蛋白酶抗體。免疫學(xué)測定法根據(jù)標(biāo)記方式的不同，有酶免疫法、放射免疫法、熒光免疫法等。
在本發(fā)明的計數(shù)法中，已知比例優(yōu)選使用下面的第一種比例或者第二種比例。
上述第一種比例是白細(xì)胞數(shù)或粒細(xì)胞數(shù)與彈性蛋白酶濃度的統(tǒng)計學(xué)比例。該統(tǒng)計學(xué)比例例如有回歸方程式，該方程式系通過分別測定血液等樣品中彈性蛋白酶濃度和白細(xì)胞數(shù)，再由這兩個數(shù)值求得。上述回歸方程式，例如有彈性蛋白酶濃度與粒細(xì)胞數(shù)的線形回歸方程式、彈性蛋白酶濃度與總白細(xì)胞數(shù)的線形回歸方程式等。
上述第二種比例是每個粒細(xì)胞中所含的彈性蛋白酶濃度。使用該比例能計算出樣品中粒細(xì)胞數(shù)。上述每個粒細(xì)胞中所含的彈性蛋白酶濃度，一般為1-5ng／ml，優(yōu)選為2-2．5ng／ml。因此，求樣品中總白細(xì)胞數(shù)時，由該粒細(xì)胞數(shù)并使用粒細(xì)胞總數(shù)和嗜中性粒細(xì)胞對總白細(xì)胞的已知比例即可求出。
另外，涉及本發(fā)明的白細(xì)胞數(shù)和彈性蛋白酶的已知比例，既可以使用歷來公認(rèn)的比例，也可以使用按照樣品種類予先求出的比例。上述白細(xì)胞數(shù)的計算，也可以按照上述目測法或者自動化測量法中的任意一種進行。另外，對于上述彈性蛋白酶濃度的測定也不作特別限制，但是優(yōu)選使用本發(fā)明中所用的免疫學(xué)的方法。
其次，本發(fā)明的白細(xì)胞計數(shù)裝置是用于實施本發(fā)明白細(xì)胞計數(shù)法的一種裝置，具有計算上述樣品中白細(xì)胞數(shù)的功能，其中，白細(xì)胞數(shù)的計算由檢品中粒細(xì)胞內(nèi)釋放的彈性蛋白酶濃度，并使用白細(xì)胞數(shù)、粒細(xì)胞數(shù)或者嗜中性粒細(xì)胞數(shù)與彈性蛋白酶的已知比例進行的。
上述白細(xì)胞計數(shù)器優(yōu)選具有以下手段使樣品中粒細(xì)胞釋放彈性蛋白酶的手段、在該彈性蛋白酶上添加抗粒細(xì)胞彈性蛋白酶抗體的手段、通過測定結(jié)合于上述彈性蛋白酶上的抗粒細(xì)胞彈性蛋白酶抗體測定上述彈性蛋白酶濃度的手段、由該濃度及白細(xì)胞數(shù)與彈性蛋白酶濃度的已知比例，計算出樣品中白細(xì)胞數(shù)的手段。
其次，本發(fā)明的試劑盒是用于實施本發(fā)明白細(xì)胞計數(shù)法的試劑盒，含有抗粒細(xì)胞彈性蛋白酶抗體。
用于上述適用乳膠凝集免疫測定法的本發(fā)明計數(shù)法的本發(fā)明試劑盒含有將抗粒細(xì)胞彈性蛋白酶抗體結(jié)合于乳膠粒子上的抗體粒子。
用于上述利用標(biāo)記抗體的本發(fā)明計數(shù)法的本發(fā)明試劑盒含有標(biāo)記的抗粒細(xì)胞彈性蛋白酶抗體以及結(jié)合于固相上的抗粒細(xì)胞彈性蛋白酶抗體。上述標(biāo)記的抗粒細(xì)胞彈性蛋白酶抗體優(yōu)選酶標(biāo)記的抗粒細(xì)胞彈性蛋白酶抗體。
本發(fā)明的試劑盒優(yōu)選含有蛋白酶抑制劑，且該蛋白酶抑制劑與待測樣品中的蛋白酶抑制劑相同。另外，待測樣品是全血的情況下，上述蛋白酶抑制劑理想為α1-抗胰蛋白酶。此外，本發(fā)明的試劑盒優(yōu)選含有溶血劑。
圖面簡單說明

圖1表示在本發(fā)明計數(shù)法的一個實施例中，按照本發(fā)明計數(shù)法算出的白細(xì)胞數(shù)與按照自動血細(xì)胞計數(shù)裝置算出的白細(xì)胞之間的相關(guān)圖。
實施本發(fā)明的最佳方式在本發(fā)明計數(shù)法中，首先要使粒細(xì)胞溶血。溶血方法無特定的限制，能使用現(xiàn)有的公知方法，例如有使用超聲波的物理方法、使用滲透壓差的方法以及使用表面活性劑的化學(xué)方法等。其中，由于操作上的原因，優(yōu)選的方法是將樣品浸漬到表面活性劑水溶液中。上述表面活性劑，例如有十二烷基三甲銨溴化物、十二烷基三甲銨氯化物、皂甙、卵磷脂、膽汁酸、十二烷基硫酸鈉、3-[(膽胺丙基)二甲銨]-2-羥基-1-丙磺酸、聚氧乙烯辛基苯基醚、聚氧乙烯山梨醇酯等。表面活性劑水溶液的濃度無特別的限制，一般為0．001-5重量％，優(yōu)選0．05-1重量％。
其次，使用免疫學(xué)方法測定粒細(xì)胞中釋放的彈性蛋白酶。
如前所述，樣品是全血時，優(yōu)選在進行該測定之前，先在上述樣品中添加蛋白酶抑制劑。這是因為，在血漿中，粒細(xì)胞內(nèi)的彈性蛋白酶是以與蛋白酶抑制劑結(jié)合的復(fù)合體形式存在。而粒細(xì)胞中釋放的彈性蛋白酶是游離型的，作為測定對象優(yōu)選復(fù)合體型的，因此將游離型彈性蛋白酶與蛋白酶抑制劑結(jié)合成復(fù)合體。作為上述蛋白酶抑制劑，除α1-抗胰蛋白酶之外，還有α2-巨球蛋白等。另外，蛋白酶抑制劑的添加比例可根據(jù)樣品濃度等適當(dāng)確定，一般為粒細(xì)胞彈性蛋白酶重量的5-10倍，優(yōu)選8-12倍。
上述免疫學(xué)方法，如前所述例如有乳膠凝集免疫法、酶免疫法、放射免疫法及熒光免疫法。
在本發(fā)明中使用的抗粒細(xì)胞彈性蛋白酶抗體，能夠按常規(guī)方法，通過從用粒細(xì)胞彈性蛋白酶進行特異性免疫的動物血清中分離而進行制備。該抗體也可以按照普通的雜交細(xì)胞瘤法進行制備。用于制備上述抗體的動物例如有羊、兔等，但在本發(fā)明中不限于此。
上述乳膠酶凝集法是一種使用結(jié)合了乳膠粒子抗粒細(xì)胞彈性蛋白酶抗體的方法，是當(dāng)上述抗體結(jié)合于粒細(xì)胞彈性蛋白酶時，引起乳膠凝集，不需B／F分離，通過測定上述凝集度測定彈性蛋白酶濃度。上述凝集度的測定，一般使用分光光度計進行，作為濁度，測定其透光。隨凝集度的增大、散射光增加，透光減少，上述濁度上升。另外，測定波長一般為400-1500nm，優(yōu)選500-800nm。另外，結(jié)合了上述乳膠粒子的抗粒細(xì)胞彈性蛋白酶抗體的添加比例根據(jù)樣品種類和濃度等適當(dāng)確定，但是，當(dāng)樣品為全血時，這一添加比例一般為0．1-5mg／ml，優(yōu)選1-3mg／ml。上述凝集度的測定，也可以用測量散射光的比濁法進行。并且，上述凝集度也可以用目測法進行測定。這種情況下，使用目測法用的市售試劑，能夠高精度地進行測定。
結(jié)合了上述乳膠粒子的抗粒細(xì)胞彈性蛋白酶抗體能夠按常法制備。例如，將聚乙烯接枝共聚于聚苯乙烯上形成0．1-0．2μm的乳膠粒子，既可以按約200ng／cm2的比例，將抗體物理性地吸附于該乳膠粒子上，也可以通過共價鍵結(jié)合。另外，上述結(jié)合了乳膠粒子的抗粒細(xì)胞彈性蛋白酶抗體也可以使用市售品。
上述酶免疫法，是一種通過酶和底物反應(yīng)，而測定酶標(biāo)記抗粒細(xì)胞彈性蛋白酶抗體的方法。該測定法為先將粒細(xì)胞內(nèi)釋放的彈性蛋白酶結(jié)合到預(yù)先固定在固相上的粒細(xì)胞彈性蛋白酶抗體上，在這種狀態(tài)下再添加酶標(biāo)記的抗粒細(xì)胞彈性蛋白酶抗體，并采用清洗等手段分離未結(jié)合的上述抗體，測定結(jié)合在彈性蛋白酶上的酶標(biāo)記抗粒細(xì)胞彈性蛋白酶抗體。
作為上述酶和底物的組合，優(yōu)選通過上述酶和底物的反應(yīng)生成能夠檢出的產(chǎn)物，例如，有過氧化酶、過氧化氫與鄰苯二胺的組合、堿性磷酸酯酶與4-硝基苯酚的組合等。使用上述過氧化酶、過氧化氫與鄰苯二胺的組合時，經(jīng)酶反應(yīng)鄰苯二胺顯色，在492nm處對其進行測定即可。
另外，固定于上述固相上的抗體可以按一般方法進行制備。例如，經(jīng)過酸處理或熱處理等，將抗體固定于固相上。另外，上述酶標(biāo)記抗體能夠按一般方法進行制備。這些也可以使用市售品。
另外，上述固定于固相上的抗體及上述酶標(biāo)記抗體的添加比例，依樣品的種類和濃度可以適當(dāng)確定。作為固定相，例如有玻璃多孔表面和管狀表面等。
上述放射免疫法是使用用放射性物質(zhì)代替上述酶標(biāo)記的抗粒細(xì)胞彈性蛋白酶抗體的一種測定方法。除測定上述放射性物質(zhì)之外，其他都按上述酶免疫法同樣的方法實施。上述放射性物質(zhì)，例如126I-Na。
前記的熒光免疫法是使用以熒光物質(zhì)代替上述酶標(biāo)記的抗粒細(xì)胞彈性蛋白酶抗體的一種測定方法。其中，除測定熒光物之外，其他都按上述酶免疫法同樣的方法實施。作為熒光物質(zhì)，例如羅丹明、熒光素、香豆素等。
其次，由采用上述免疫學(xué)方法測得的彈性蛋白酶濃度，并使用白細(xì)胞數(shù)和粒細(xì)胞彈性蛋白酶濃度的已知比例，計算上述樣品中的白細(xì)胞數(shù)。上述已知比例，可以使用前述的統(tǒng)計學(xué)比例或每個粒細(xì)胞中的彈性蛋白酶濃度。另外，上述比例優(yōu)選按照樣品的種類適當(dāng)決定。例如，樣品是成人全血、小孩全血或老年人全血時，可以使用各自的比例。
再次，本發(fā)明的白細(xì)胞計數(shù)裝置優(yōu)選具有下述手段使樣品中粒細(xì)胞內(nèi)部的彈性蛋白酶釋放的手段、在該彈性蛋白酶上添加抗粒細(xì)胞彈性蛋白酶抗體的手段、通過測定結(jié)合到上述彈性蛋白酶上的抗粒細(xì)胞彈性蛋白酶抗體測定上述彈性蛋白酶濃度的手段、自該濃度并且使用白細(xì)胞數(shù)、粒細(xì)胞數(shù)及嗜中性粒細(xì)胞數(shù)與粒細(xì)胞彈性蛋白酶濃度的已知比例計算上述樣品中白細(xì)胞數(shù)的手段。該裝置可以全自動地計算白細(xì)胞數(shù)。
上述釋放彈性蛋白酶的手段以及添加抗體的手段由各要素構(gòu)成。例如有用于分注樣品等的泵、閥門、噴嘴、攪拌器、容器、溫度調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)等。另外，測定彈性蛋白酶濃度的手段，在上述各要素基礎(chǔ)上，由光學(xué)測定系統(tǒng)等構(gòu)成。另外，上述記算功能由被程序化的計算器以及表示該結(jié)果的手段(顯示器或打印機等)共同構(gòu)成。其中，該程序能夠從彈性蛋白酶濃度及上述已知比例，計算出樣品中粒細(xì)胞數(shù)或白細(xì)胞數(shù)等。
這樣，實施本發(fā)明計數(shù)法的裝置，其占用的面積與A4紙張大小相同，與以前的自動測定裝置相比，是一種非常小型、廉價的裝置。
上述本發(fā)明的白細(xì)胞計數(shù)裝置只要至少具有從樣品中粒細(xì)胞內(nèi)部釋放的彈性蛋白酶濃度及白細(xì)胞數(shù)、粒細(xì)胞數(shù)或嗜中性粒細(xì)胞數(shù)與彈性蛋白酶濃度的已知比例計算出樣品中白細(xì)胞數(shù)的手段即可。此外，也可以手工添加試劑和抗體。另外，彈性蛋白酶濃度的測定既可以通過光學(xué)測定系統(tǒng)，也可以通過目測進行。
其次，在本發(fā)明的試劑盒中，能夠使用在上述計數(shù)法中列舉的試劑。
其次，就實施例結(jié)合比較例加以說明。
(實施例1)用磷酸緩沖生理鹽水(pH7．4)將成人全血稀釋成各種濃度(5種)，作為樣品。將這些樣品加入到0．1重量％十二烷基三甲銨氯化物水溶液內(nèi)，使白細(xì)胞溶血。用含有α1抗胰蛋白酶的0．01重量％的聚氧乙烯山梨醇酯稀釋上述樣品，制備數(shù)種待檢液。取各待檢液100μl，使用固定化的抗體(抗人粒細(xì)胞彈性蛋白酶小鼠單克隆抗體)和酶標(biāo)記抗體(過氧化酶標(biāo)記抗人粒細(xì)胞彈性蛋白酶羊多克隆抗體)，按上述方法(酶免疫法)測定彈性蛋白酶濃度。
即，先將各待檢液100μl結(jié)合到反應(yīng)液中固定化的抗體上，清洗干凈。其次，在添加上述酶標(biāo)記抗體后，清洗干凈。最后，在反應(yīng)液中添加過氧化氫及鄰苯二胺溶液。在波長492nm處，測定該酶反應(yīng)導(dǎo)致的顯色，按予先制成的標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算彈性蛋白酶濃度。
另一方面，對于其他的成人全血樣品，作出總白細(xì)胞數(shù)和彈性蛋白酶濃度的線性回歸方程式。上述總白細(xì)胞數(shù)用自動血細(xì)胞計數(shù)儀(K-4500，東亞醫(yī)用電子社制)進行計數(shù)、另外，粒細(xì)胞彈性蛋白酶濃度按上述酶免疫法同樣的方法進行測定。該線性回歸方程式(1)如下所示。使用該線性回歸方程式(1)，從上述彈性蛋白酶濃度計算各樣品中的總白細(xì)胞數(shù)。結(jié)果列于下述表1。
Y=2132．9897X-245．6519 (1)X粒細(xì)胞彈性蛋白酶濃度(μg／ml)Y總白細(xì)胞數(shù)(個／μl)另外，作為對照，使用自動血細(xì)胞計數(shù)儀(K-4500，東亞醫(yī)用電子社制)，對上述各樣品的白細(xì)胞數(shù)進行計算。其結(jié)果也列于下述表1。
(實施例2)在實施例1中，不使用線性回歸方程式，而使用每個嗜中性粒細(xì)胞的彈性蛋白酶濃度0．9084ng／ml以及嗜中性粒細(xì)胞數(shù)與總白細(xì)胞數(shù)的比例55．3％，計算出總白細(xì)胞數(shù)。另外，上述每個嗜中性粒細(xì)胞中彈性蛋白酶濃度是取成人全血，按常規(guī)方法(目視法)只計算出嗜中性粒細(xì)胞數(shù)，并且按實施例1同樣的方法(酶免疫法)，測定彈性蛋白酶濃度并計算出的數(shù)值。其結(jié)果列于下述表2。
(比較例)按實施例1同樣的方法，配成5種待檢液。將各待檢液10μl加入到250μlグッド緩沖液(HEPES，pH7．5)中，在37℃培養(yǎng)3分鐘。再加入4mg／ml的AAPV(甲氧琥珀酰-Ala-Ala-Pro-Val-硝基苯胺)水溶液、攪拌、在37℃培養(yǎng)6分鐘。然后，測定反應(yīng)液在波長405nm處的吸光度，測定彈性蛋白酶的活性。另外，作為對照，與實施例1同樣的方法，使用自動血細(xì)胞計數(shù)裝置(K-4500，東亞醫(yī)用電子社制)計算總白細(xì)胞數(shù)。其結(jié)果見下述表3。
(表1)實施例1對照白細(xì)胞數(shù)彈性蛋白酶濃度算出的白細(xì)胞數(shù)(個／μl) (μg／ml) (個／μl)10000．36 52221001．51 297542002．02 406363002．99 613284004．01 8308(表2)實施例2對照白細(xì)胞數(shù)彈性蛋白酶濃度算出的白細(xì)胞數(shù)(個／μl) (μg／ml) (個／μl)10000．3671721001．51300642002．02402163002．99595284004．017983(表3)比較例對照白細(xì)胞數(shù)彈性蛋白酶活性(個／μl) (μg／ml)730 4．3109024．815407．8197052．8如前表1、2所示，在實施例1、2中，由彈性蛋白酶濃度計算出的總白細(xì)胞數(shù)與使用自動血細(xì)胞計數(shù)裝置計算出的總白細(xì)胞數(shù)之間有很大的相關(guān)性(相關(guān)系數(shù)r=0．986)。與此相反，在比較例中，彈性蛋白酶濃度與使用自動血細(xì)胞計數(shù)裝置計算出的總白細(xì)胞數(shù)之間的相關(guān)性很差(相關(guān)系數(shù)r=0．6268)。其原因認(rèn)為是在比較例中使用了酶測定法測定彈性蛋白酶濃度，結(jié)果樣品中的蛋白酶抑制劑(α1-抗胰蛋白酶等)抑制了彈性蛋白酶的活性。
(實施例3)按實施例1同樣的方法，配成5種待檢液。對于各待檢液，按以下所示的乳膠凝集免疫測定法測定彈性蛋白酶濃度。即，先將上述樣品加入到0．1重量％皂甙水溶液中，使白細(xì)胞溶血。按實施例1同樣的方法，將此液稀釋成待檢液。將該待檢液10μl加入到250μl磷酸緩沖生理鹽水(pH7．9)中，在該液體中，再加入50μl致敏抗人粒細(xì)胞彈性蛋白酶抗體的乳膠混懸液(濃度2．0mg／ml)，在37℃培養(yǎng)15分鐘。上述乳膠混懸液是以200ng／cm2的比例，將上述抗體物理性吸附在平均粒徑為0．1-0．2μm的乳膠粒子上制成。其中，該乳膠粒子是將聚乙烯與聚苯乙烯接枝共聚而成。并且，在660nm波長處，用分光光度計測定該緩沖液的吸收度(濁度)，用以測定彈性蛋白酶濃度。按實施例1相同的方法，由該值計算出樣品中白細(xì)胞數(shù)。另外，作為對照，與實施例1一樣，使用自動血細(xì)胞計數(shù)儀(K-4500，東亞醫(yī)用電子社制)計算上述樣品中的白細(xì)胞數(shù)。結(jié)果見下述表4。
(表4)實施例3
樣品稀釋倍數(shù) 對照白細(xì)胞數(shù) 彈性蛋白酶濃度 算出的白細(xì)胞數(shù)(個／μl) (μg／ml) (個／μl)1／1611000．4 12841／8 16001．70 19961／4 33003．04 27661／2 66009．53 6498113200 21．3213277如表4所示，在實施例3中，由彈性蛋白酶濃度記算出的白細(xì)胞數(shù)與使用自動血細(xì)胞計數(shù)儀計算出的總白細(xì)胞數(shù)之間有很高的相關(guān)性(相關(guān)系數(shù)r=0．998)。
(實施例4)用成人全血50例(n=50)作為樣品，按上述實施例3同樣的方法，算出樣品中的總白細(xì)胞數(shù)。另外，作為對照，使用自動血細(xì)胞計數(shù)儀(K-4500，東亞醫(yī)用電子社制)分別計算出上述各樣品(n=50)中的總白細(xì)胞數(shù)。結(jié)果如圖1所示。該圖顯示的是對于各樣品(n=50)，使用本發(fā)明計數(shù)法測得的白細(xì)胞數(shù)和使用自動血細(xì)胞計數(shù)儀測得的總白細(xì)胞數(shù)兩者之間的關(guān)系。
如圖所示，對于各樣品(n=50)，由彈性蛋白酶濃度算出的白細(xì)胞數(shù)與使用自動血細(xì)胞計數(shù)裝置算出的總白細(xì)胞數(shù)兩者之間呈現(xiàn)很高的相關(guān)性(相關(guān)系數(shù)r=0．973)。
產(chǎn)業(yè)上利用的可能性如上所述本發(fā)明的白細(xì)胞計數(shù)法，使用免疫學(xué)方法測定粒細(xì)胞內(nèi)彈性蛋白酶濃度，由此彈性蛋白酶濃度算出樣品中白細(xì)胞數(shù)。按照此法，不受成紅細(xì)胞等白細(xì)胞以外的有核細(xì)胞、血纖維蛋白析出、血小板凝集以及紅細(xì)胞溶血不良的影響，而且，所用裝置既可以小型化、又可以降低計數(shù)費用。并且，由于使用免疫學(xué)方法進行測定，所以測定結(jié)果不受檢測人員熟練程度的影響。
權(quán)利要求
1．一種白細(xì)胞計數(shù)法，其中，該計數(shù)法包括使樣品內(nèi)白細(xì)胞中的嗜中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞及嗜堿性粒細(xì)胞(以下，將這3種血細(xì)胞稱做“粒細(xì)胞”)內(nèi)的彈性蛋白酶釋放，在該彈性蛋白酶上添加抗粒細(xì)胞彈性蛋白酶抗體，通過測定結(jié)合到上述彈性蛋白酶上的抗粒細(xì)胞彈性蛋白酶抗體測定彈性蛋白酶濃度，由該濃度并且使用白細(xì)胞數(shù)、粒細(xì)胞數(shù)或嗜中性粒細(xì)胞與彈性蛋白酶的已知比例，計算出上述樣品內(nèi)的白細(xì)胞數(shù)。
2．權(quán)利要求1記載的計數(shù)法，其中，用與樣品中蛋白酶抑制劑相同的蛋白酶抑制劑，使之與被釋放的彈性蛋白酶結(jié)合后，在彈性蛋白酶上添加抗粒細(xì)胞彈性蛋白酶抗體。
3．權(quán)利要求2記載的計數(shù)法，其中，樣品是全血，蛋白酶抑制劑是α1-抗胰蛋白酶。
4．權(quán)利要求2或3記載的計數(shù)法，其中，蛋白酶抑制劑的添加量是粒細(xì)胞彈性蛋白酶重量的5-10倍。
5．權(quán)利要求1-3中任意一項記載的計數(shù)法，其中，使抗體粒子與粒細(xì)胞內(nèi)釋放的彈性蛋白酶進行抗原抗體反應(yīng)，并且該抗體粒子是將抗粒細(xì)胞彈性蛋白酶抗體結(jié)合于乳膠粒子上形成的，通過測定上述乳膠粒子的凝集程度，測定結(jié)合到上述彈性蛋白酶上的上述抗粒細(xì)胞彈性蛋白酶抗體。
6．權(quán)利要求5記載的計數(shù)法，其中，將抗粒細(xì)胞彈性蛋白酶抗體結(jié)合到乳膠粒子上形成的抗體粒子的添加比例為1ml樣品加0．1-5mg。
7．權(quán)利要求1-3中任意一項記載的計數(shù)法，其中，包括將粒細(xì)胞內(nèi)釋放的彈性蛋白酶結(jié)合到固定于固相上的抗粒細(xì)胞彈性蛋白酶抗體上，在此狀態(tài)下，加入經(jīng)標(biāo)記的抗粒細(xì)胞彈性蛋白酶抗體，測定結(jié)合于上述彈性蛋白酶上的上述標(biāo)記抗粒細(xì)胞彈性蛋白酶抗體。
8．權(quán)利要求7記載的計數(shù)法，其中，該標(biāo)記抗粒細(xì)胞彈性蛋白酶抗體的標(biāo)記是選自酶標(biāo)記、放射標(biāo)記以及熒光標(biāo)記中的至少一種。
9．權(quán)利要求7記載的計數(shù)法，其中，標(biāo)記抗粒細(xì)胞彈性蛋白酶抗體的標(biāo)記是用酶進行的，通過上述酶和底物的反應(yīng)，使之生成可以檢出的生成物。
10．權(quán)利要求9記載的計數(shù)法，其中，酶是過氧化物酶，其底物是鄰苯二胺及過氧化氫。
11．權(quán)利要求1-3中任意一項記載的計數(shù)法，其中，已知比例是白細(xì)胞數(shù)或粒細(xì)胞數(shù)與彈性蛋白酶濃度的統(tǒng)計學(xué)比例。
12．權(quán)利要求1-3中任意一項中記載的計數(shù)法，其中，已知比例是每個粒細(xì)胞中彈性蛋白酶濃度。
13．權(quán)利要求12記載的計數(shù)法，其中，每個粒細(xì)胞中彈性蛋白酶濃度在1-5ng／ml范圍。
14．權(quán)利要求12記載的計數(shù)法，其中，用粒細(xì)胞數(shù)與總白細(xì)胞數(shù)的已知比例，由粒細(xì)胞數(shù)計算出樣品中的總白細(xì)胞數(shù)。
15．一種用于實施權(quán)利要求1所述的白細(xì)胞計數(shù)法的白細(xì)胞計數(shù)裝置，這種白細(xì)胞計數(shù)裝置具有計算樣品中白細(xì)胞數(shù)的手段，由樣品中粒細(xì)胞內(nèi)釋放出的彈性蛋白酶濃度，并利用白細(xì)胞數(shù)、粒細(xì)胞數(shù)或嗜中性粒細(xì)胞數(shù)與彈性蛋白酶濃度的已知比例計算出樣品中的白細(xì)胞數(shù)。
16．權(quán)利要求15記載的白細(xì)胞計數(shù)裝置，其中，該裝置具有以下手段使樣品中粒細(xì)胞釋放彈性蛋白酶的手段、在該彈性蛋白酶上添加抗粒細(xì)胞彈性蛋白酶抗體的手段、通過測定結(jié)合于上述彈性蛋白酶上的抗粒細(xì)胞彈性蛋白酶抗體測定上述彈性蛋白酶濃度的功能、從該濃度并使用白細(xì)胞數(shù)、粒細(xì)胞數(shù)或嗜中性粒細(xì)胞數(shù)與彈性蛋白酶濃度的已知比例計算出上述樣品中白細(xì)胞數(shù)的功能。
17．一種用于實施權(quán)利要求1所述的白細(xì)胞計數(shù)法的試劑盒，這種試劑盒含有抗粒細(xì)胞彈性蛋白酶抗體。
18．一種用于實施權(quán)利要求5所述的白細(xì)胞計數(shù)法的試劑盒，這種試劑盒含有抗粒細(xì)胞彈性蛋白酶抗體結(jié)合于乳膠粒子上形成的抗體粒子。
19．一種用于實施權(quán)利要求7所述的白細(xì)胞計數(shù)法的試劑盒，這種試劑盒含有標(biāo)記的抗粒細(xì)胞彈性蛋白酶抗體和結(jié)合于固相上的抗粒細(xì)胞彈性蛋白酶抗體。
20．權(quán)利要求17-19中任意一項記載的試劑盒，其中，該試劑盒含有與待測樣品中蛋白酶抑制劑相同的蛋白酶抑制劑。
21．權(quán)利要求20記載的試劑盒，其中，待測樣品是全血，蛋白酶抑制劑是α1-抗胰蛋白酶。
22．權(quán)利要求17-19中任意一項中記載的試劑盒，其中，該試劑盒還含有溶血劑。
全文摘要
一種白細(xì)胞計數(shù)方法,包括使樣品中粒細(xì)胞釋放彈性蛋白酶、將抗粒細(xì)胞彈性蛋白酶抗體添加到該彈性蛋白酶上、通過測定結(jié)合于彈性蛋白酶上的抗體測定彈性蛋白酶濃度、由該濃度并使用白細(xì)胞數(shù)與彈性蛋白酶濃度的已知比例計算上述樣品中的白細(xì)胞數(shù)。按照該計數(shù)法,如圖1所示與以前的自動血細(xì)胞計數(shù)儀相比,能夠同樣準(zhǔn)確地測定白細(xì)胞數(shù),而且簡便、成本低。
文檔編號G01N33/49GK1293760SQ99803966
公開日2001年5月2日 申請日期1999年3月11日 優(yōu)先權(quán)日1998年3月13日
發(fā)明者大久保章男, 山田繁樹 申請人:阿克雷株式會社