專利名稱：用于細(xì)胞或組織工程生物培養(yǎng)的裝置和方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種生物反應(yīng)器和方法，尤其涉及一種細(xì)胞生物學(xué)、組織工程學(xué)和醫(yī) 學(xué)中進(jìn)行種子細(xì)胞培養(yǎng)或者細(xì)胞與生物材料復(fù)合培養(yǎng)的反應(yīng)器和方法。
背景技術(shù)：
組織工程學(xué)是應(yīng)用工程學(xué)和生命科學(xué)的原理和方法，構(gòu)建生物性替代物，以恢復(fù)、 維持或增進(jìn)受損器官或組織功能的一門科學(xué)。這種生物性替代物的構(gòu)建需要由生物材料、 種子細(xì)胞及合適培養(yǎng)環(huán)境，而能夠?qū)⑷呗?lián)系在一起的就是生物反應(yīng)器。在組織工程領(lǐng)域中，用于構(gòu)建組織工程組織或器官的種子細(xì)胞多為貼壁依賴性細(xì) 胞，而種子細(xì)胞的來源往往是通過原代培養(yǎng)的細(xì)胞，基于安全的角度考慮，這些細(xì)胞不宜通 過基因改造等方法以增強(qiáng)其體外的繁殖和擴(kuò)增能力，其體外大規(guī)模培養(yǎng)及快速較為困難； 因此，對于種子細(xì)胞的培養(yǎng)對生物反應(yīng)器的要求比用于其它用途的動(dòng)物細(xì)胞更強(qiáng)調(diào)培養(yǎng)環(huán) 境的合適性，使得種子細(xì)胞不僅僅能夠在反應(yīng)器內(nèi)得到大量的擴(kuò)增，還對細(xì)胞的遺傳穩(wěn)定 性有更嚴(yán)格的要求，以保證在用于細(xì)胞治療時(shí)的安全性。同時(shí)，生物反應(yīng)器還用于構(gòu)建組織 工程組織、器官替代物，其構(gòu)建方法要求將細(xì)胞復(fù)合與支架上，然后置入生物反應(yīng)器內(nèi)進(jìn)行 培養(yǎng)。對不同的組織工程產(chǎn)品構(gòu)建物，其培養(yǎng)要求的條件是各不相同，在組織工程皮膚的體 外構(gòu)建過程中，要求有一定時(shí)間的氣液界面培養(yǎng)，以使得組織工程皮膚表面的角質(zhì)細(xì)胞能 夠與空氣接觸而產(chǎn)生復(fù)層化，使組織工程皮膚的功能得到加強(qiáng)；因此，在不同組織工程中應(yīng) 用的生物反應(yīng)器往往具有自身的一些特點(diǎn)。目前常用的生物反應(yīng)器的類型主要有滾瓶Roller bottle 是生物制藥的主要的反應(yīng)器，包括免疫、分子生物學(xué)、病毒疫 苗的生產(chǎn)，高密度的植物細(xì)胞培養(yǎng)，以及人類的腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)等。這種原始的生物反應(yīng)器構(gòu) 造簡單，操作方便，也可以作為組織工程種子細(xì)胞擴(kuò)增。這種以旋轉(zhuǎn)提供動(dòng)力的反應(yīng)器可以 改善橫向的傳質(zhì)，但縱向的傳質(zhì)仍然不佳。而且對于組織工程產(chǎn)品的構(gòu)建，尤其是組織工程 皮膚的構(gòu)建，因?yàn)闊o法放置支架，這種生物反應(yīng)器是無能無力的。機(jī)械攪拌式生物反應(yīng)器也就是通過機(jī)械槳的攪拌作用，增進(jìn)反應(yīng)器內(nèi)部的傳質(zhì)， 但是由于機(jī)械槳的剪切作用不可避免地導(dǎo)致細(xì)胞的損傷。這種生物反應(yīng)器主要用于非組織 工程種子細(xì)胞的擴(kuò)增，由于其機(jī)械槳對細(xì)胞造成了損傷，因此，這種生物反應(yīng)器產(chǎn)出的細(xì)胞 用作細(xì)胞治療時(shí)，其安全性仍然值得考慮；在組織工程構(gòu)建物的培養(yǎng)中，需要將構(gòu)建物懸置 于培養(yǎng)液中，操作復(fù)雜。旋轉(zhuǎn)壁式生物反應(yīng)器1990年，Kleis等人首先研制了該種生物反應(yīng)器，隨后美國 國家航空與宇宙航行局對此進(jìn)行改進(jìn)并應(yīng)用發(fā)到組織培養(yǎng)領(lǐng)域。旋轉(zhuǎn)壁式生物反應(yīng)器可以 分為水平旋轉(zhuǎn)與垂直旋轉(zhuǎn)兩種。這種生物反應(yīng)器將培養(yǎng)液及培養(yǎng)物共處于兩個(gè)同軸的內(nèi) 外圓筒之間，在步進(jìn)電機(jī)帶動(dòng)下一起繞水平軸作旋轉(zhuǎn)運(yùn)動(dòng)，內(nèi)、外圓筒可以同時(shí)或反方向旋 轉(zhuǎn)。圓筒剛開始轉(zhuǎn)速較慢，隨著培養(yǎng)物體積的增大動(dòng)態(tài)地增加轉(zhuǎn)速以用來抵抗細(xì)胞的沉降。 內(nèi)壁是透氣、不透液的多孔疏水性半透膜以提供氧氣及排出二氧化碳。這是一種無氣泡模 式擴(kuò)散進(jìn)行氣體交換的水平式旋轉(zhuǎn)細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)。由于反應(yīng)器內(nèi)的培養(yǎng)液隨著壁而產(chǎn)生旋轉(zhuǎn)，培養(yǎng)液之間沒有明顯的速度梯度，因此產(chǎn)生的剪切力非常小，適合不同類型的細(xì)胞生 長。但是，由于氣體是通過膜的彌散而傳質(zhì)，因此存在有氣體的傳質(zhì)不足。此外，這種反應(yīng) 器的培養(yǎng)裝置是特制的，不易拆洗，由于內(nèi)外筒之間的間隙較小，不能放置大塊的組織工程 構(gòu)建物，也難以用于組織工程種子細(xì)胞的擴(kuò)增。在組織工程中應(yīng)用其他方面的生物反應(yīng)器還包括中空纖維生物反應(yīng)器、氣升式生 物反應(yīng)器以及灌注式生物反應(yīng)器等，其中中空纖維生物反應(yīng)器利用了中空纖維的半透膜的 作用，為細(xì)胞的三維生長提供了較為合適的環(huán)境，但是這種方式培養(yǎng)的細(xì)胞取出較為困難， 因此主要用于人工肝生物反應(yīng)器。氣升式生物反應(yīng)器由于氣泡對細(xì)胞的損傷作用等因素， 在其它組織工程中的應(yīng)用并不多。在生物反應(yīng)器的傳質(zhì)動(dòng)力方面，目前主要方式有攪拌式、旋轉(zhuǎn)壁式、灌注式和氣升 式等。其中攪拌式生物反應(yīng)器在傳統(tǒng)的細(xì)胞培養(yǎng)中扮演了很重要的角色，但是在強(qiáng)化傳質(zhì) 的攪拌過程中，不可避免地導(dǎo)致細(xì)胞的損傷。旋轉(zhuǎn)壁式的生物反應(yīng)器能夠提供較小的剪切 力，但存在著縱向傳質(zhì)較差等問題。而灌注式培養(yǎng)由于其剪切力較大，不能提供較為均一的 培養(yǎng)環(huán)境，因此其在組織工程中的應(yīng)用也受到了限制。由于動(dòng)物細(xì)胞對培養(yǎng)基內(nèi)的溶氧的 要求比其它的需氧培養(yǎng)的微生物要低，因此，目前人們對通過外部攪拌而增強(qiáng)傳質(zhì)的方法 逐漸產(chǎn)生了興趣，其中有代表性的生物反應(yīng)器有美國Wave Biotech公司生產(chǎn)的波浪式生物 反應(yīng)器和杭州安普生物工程有限公司生產(chǎn)的激流式生物反應(yīng)器，這兩種生物反應(yīng)器都是應(yīng) 用搖床提供外部的上下往復(fù)運(yùn)動(dòng)或水平旋轉(zhuǎn)提供動(dòng)力，由于培養(yǎng)容器內(nèi)部沒有攪拌槳，因 此，這兩種生物反應(yīng)器對細(xì)胞的損傷較小，都實(shí)現(xiàn)了細(xì)胞培養(yǎng)規(guī)模的放大。但是波浪式生物 反應(yīng)器在利用搖床提供的上下往復(fù)運(yùn)動(dòng)來增強(qiáng)傳質(zhì)，這種方式存在橫向傳質(zhì)不足及在較大 的波浪運(yùn)動(dòng)時(shí)，兩端的細(xì)胞可與培養(yǎng)袋的壁產(chǎn)生碰撞，導(dǎo)致細(xì)胞的損傷；而激流式生物反應(yīng) 器利用搖床提供的水平旋轉(zhuǎn)運(yùn)動(dòng)，加強(qiáng)了橫向的傳質(zhì)，但在其底部的培養(yǎng)液仍然是水平的 旋轉(zhuǎn)，仍然存在縱向傳質(zhì)不良的缺陷；尤為重要的是，這兩種生物反應(yīng)器只能用于普通的動(dòng) 物細(xì)胞的擴(kuò)增，尚無用于組織工程種子細(xì)胞的案例，也不能用于組織工程細(xì)胞支架復(fù)合物 的構(gòu)建，尤其是需要?dú)庖航缑媾囵B(yǎng)的組織工程皮膚的構(gòu)建。二者均不能提供理想的氣液雙 相的培養(yǎng)環(huán)境或氣液界面的培養(yǎng)條件。目前的組織工程構(gòu)建物的培養(yǎng)，多是在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)進(jìn)行的手工培養(yǎng)，將細(xì)胞支架復(fù) 合物置于培養(yǎng)皿內(nèi)培養(yǎng)，這種靜態(tài)的培養(yǎng)方式存在明顯的組織工程構(gòu)建物內(nèi)部的傳質(zhì)不 良，構(gòu)建物內(nèi)部的氧含量低，與攪拌式生物反應(yīng)器結(jié)合或使用灌流式生物反應(yīng)器可以解決 部分的傳質(zhì)問題，但對培養(yǎng)物內(nèi)部氧含量的改善作用不大。

發(fā)明內(nèi)容
為了解決上述的存在細(xì)胞或組織工程生物培養(yǎng)存在的技術(shù)缺陷，本發(fā)明的一個(gè)目 的是提供一種用于細(xì)胞或組織工程生物培養(yǎng)的裝置。本發(fā)明的另外一個(gè)目的是提供一種用 于細(xì)胞或組織工程生物培養(yǎng)的方法。該裝置和方法提高了培養(yǎng)液內(nèi)氧含量，減少了細(xì)胞的 損傷，提供了較為均一的培養(yǎng)環(huán)境。為了實(shí)現(xiàn)上述的第一個(gè)目的，本發(fā)明采用了以下的技術(shù)方案用于細(xì)胞或組織工程生物培養(yǎng)的裝置，該裝置包括培養(yǎng)容器和驅(qū)動(dòng)裝置，所述的 培養(yǎng)容器采用U形底面、W形底面或V形底面的培養(yǎng)容器，所述的驅(qū)動(dòng)裝置采用環(huán)形擺動(dòng)動(dòng)力系統(tǒng)，環(huán)形擺動(dòng)動(dòng)力系統(tǒng)包括托盤、底座、轉(zhuǎn)盤和動(dòng)力裝置；所述的培養(yǎng)容器設(shè)置在托盤 上，托盤的中央固定設(shè)置有球形關(guān)節(jié)，球形關(guān)節(jié)的球形頭設(shè)置在底座的球形孔內(nèi)；所述的轉(zhuǎn) 盤設(shè)置在托盤的下方由動(dòng)力裝置帶動(dòng)旋轉(zhuǎn)，轉(zhuǎn)盤的同一個(gè)圓周上設(shè)置有多個(gè)高度依次升降 的支撐桿，支撐桿的上端與托盤相抵。作為優(yōu)選，所述的支撐桿的高度可調(diào)，托盤與水平面所成的角度為5 45°。作為優(yōu)選，所述的球形頭的上方設(shè)置有壓蓋，壓蓋固定在底座上，壓蓋上方設(shè)有與 托盤相連接的壓力彈簧。這種結(jié)構(gòu)用以保持其上方的托盤在擺動(dòng)的時(shí)候不會(huì)產(chǎn)生轉(zhuǎn)動(dòng)。作為優(yōu)選，該裝置還包括溫控裝置，所述的溫控裝置為恒溫墊，恒溫墊設(shè)置在托盤 與培養(yǎng)容器之間。作為優(yōu)選，該裝置還包括加液儲(chǔ)液瓶和收液儲(chǔ)液瓶；加液儲(chǔ)液瓶連接設(shè)有加液管， 加液管連接培養(yǎng)容器，加液管上設(shè)有加液蠕動(dòng)泵；收液儲(chǔ)液瓶連接設(shè)有出液管，出液管連接 培養(yǎng)容器，出液管伸入培養(yǎng)容器的高低可調(diào)節(jié)，出液管上設(shè)有出液蠕動(dòng)泵；加液儲(chǔ)液瓶的進(jìn) 氣口和收液儲(chǔ)液瓶的氣體出口分別設(shè)有空氣過濾器。作為優(yōu)選，該裝置還包括(X)2入口、氮?dú)馊肟凇2入口、氣泵、空氣過濾器、進(jìn)氣管和 出氣管，CO2入口、氮?dú)馊肟诤蚈2入口分別連接氣泵，氣泵連接空氣過濾器，空氣過濾器通過 進(jìn)氣管連接培養(yǎng)容器；出氣管設(shè)置在培養(yǎng)容器上，出氣管設(shè)有空氣過濾器。作為優(yōu)選，該裝置還包括溶氧電極、pH電極和CO2電極，溶氧電極、pH電極和CO2電 極插設(shè)在培養(yǎng)容器內(nèi)。本發(fā)明由于采用了上述的技術(shù)方案，優(yōu)點(diǎn)是在培養(yǎng)容器內(nèi)沒有攪拌槳等存在，培 養(yǎng)容器內(nèi)剪力分布均勻，容器內(nèi)細(xì)胞受到損傷的可能性極小，可適用于各種類型的細(xì)胞培 養(yǎng)，尤其適用于組織工程種子細(xì)胞和/或組織工程構(gòu)建物的三維培養(yǎng)；同時(shí)，本生物反應(yīng)器 的培養(yǎng)容器在托盤上不產(chǎn)生旋轉(zhuǎn)，使得在線的供液及供氣變得十分容易，并且方便了培養(yǎng) 時(shí)在線的監(jiān)測。為了實(shí)現(xiàn)和上述的第二個(gè)目的，本發(fā)明采用了以下的技術(shù)方案用于細(xì)胞或組織工程生物培養(yǎng)的方法，該方法將細(xì)胞或組織工程生物培養(yǎng)原料置 于U形底面、W形底面或V形底面的培養(yǎng)容器中，采用環(huán)形擺動(dòng)動(dòng)力系統(tǒng)驅(qū)動(dòng)培養(yǎng)容器環(huán)形 擺動(dòng)，所述的環(huán)形擺動(dòng)為培養(yǎng)容器以中心為支點(diǎn)，同一圓周上的每個(gè)點(diǎn)依次上、下擺動(dòng)。用于細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的方法，該方法將細(xì)胞培養(yǎng)原料置于U形或W形底的細(xì)胞培養(yǎng) 容器中，采用環(huán)形擺動(dòng)動(dòng)力系統(tǒng)驅(qū)動(dòng)培養(yǎng)容器環(huán)形擺動(dòng)，所述的環(huán)形擺動(dòng)為培養(yǎng)容器以中 心為支點(diǎn)，同一圓周上的每個(gè)點(diǎn)依次上、下擺動(dòng)，上、下擺動(dòng)的角度為5 30°。用于組織工程生物培養(yǎng)的方法，該方法將組織工程生物培養(yǎng)原料置于V形底面的 培養(yǎng)容器，中，采用環(huán)形擺動(dòng)動(dòng)力系統(tǒng)驅(qū)動(dòng)培養(yǎng)容器環(huán)形擺動(dòng)，所述的環(huán)形擺動(dòng)為培養(yǎng)容器 以中心為支點(diǎn)，同一圓周上的每個(gè)點(diǎn)依次上、下擺動(dòng)，上、下擺動(dòng)的角度為15 45°。本發(fā)明的環(huán)擺動(dòng)力比現(xiàn)有的搖床更加穩(wěn)定，而且可以提供不同的環(huán)擺角度及速 度，有利于組織工程種子細(xì)胞的培養(yǎng)。在其上方，可以使用不同的形狀的培養(yǎng)容器，與環(huán)形 擺動(dòng)的動(dòng)力作用下，不僅有良好的橫向傳質(zhì)，還有良好的縱向傳質(zhì)，通過培養(yǎng)液表面的波動(dòng) 可以增加培養(yǎng)液與空氣的接觸面積，還可以通過培養(yǎng)液對培養(yǎng)容器壁面的沖刷作用以提高 培養(yǎng)液內(nèi)氧含量。通過外部環(huán)擺提供的動(dòng)力，可在較理想的傳質(zhì)條件下，減少細(xì)胞的損傷， 提供較為均一的培養(yǎng)環(huán)境；其中使用U形底面及W形底面的培養(yǎng)容器適合與懸浮細(xì)胞的培養(yǎng)，在種子細(xì)胞擴(kuò)增時(shí)，常常需要結(jié)合微載體使用，這時(shí)，選擇W形底面的培養(yǎng)容器可以避 免微載體的沉降。而在復(fù)合有細(xì)胞的組織工程產(chǎn)品構(gòu)建時(shí)，則可選用V形底面的培養(yǎng)容器， 并可選擇氣液雙相或氣液界面等方式的動(dòng)力培養(yǎng)。


圖1為本發(fā)明的結(jié)構(gòu)示意圖。圖2為U型底面的培養(yǎng)容器的結(jié)構(gòu)示意圖。圖3為W形底面的培養(yǎng)容器的結(jié)構(gòu)示意圖。圖4為V型底面的培養(yǎng)容器的結(jié)構(gòu)示意圖。圖5為球形頭、壓蓋、底座和壓力彈簧的結(jié)構(gòu)示意圖。圖6為利用本發(fā)明反應(yīng)器與微載體培養(yǎng)技術(shù)結(jié)合培養(yǎng)人原代成纖維細(xì)胞圖，圖中 為Cytodex I型微載體，表面負(fù)載人成纖維細(xì)胞(培養(yǎng)7天；40X)，環(huán)擺角度30° ；環(huán)擺速 度40轉(zhuǎn)/分。圖7為本發(fā)明反應(yīng)器中未使用載體的二維培養(yǎng)，HaCat細(xì)胞可分泌大量細(xì)胞外機(jī) 制并形成三維結(jié)構(gòu)(IOX)。圖8為利用本發(fā)明反應(yīng)器的液氣雙相培養(yǎng)方法培養(yǎng)的人工皮膚，背景為組織工程 支架材料，表面為人角質(zhì)細(xì)胞(40X)，可見角質(zhì)細(xì)胞分布密集，比正常略小，并有復(fù)層化現(xiàn) 象(V底培養(yǎng))。圖9為人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞與支架材料結(jié)合后培養(yǎng)一周后的電鏡圖，左為平皿靜 態(tài)培養(yǎng)，右為在環(huán)擺式生物反應(yīng)器中培養(yǎng)(V底培養(yǎng))。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖對本發(fā)明的具體實(shí)施方式
做一個(gè)詳細(xì)的說明。實(shí)施例1如圖1所示的本發(fā)明用于細(xì)胞或組織工程生物培養(yǎng)的裝置，該裝置包括培養(yǎng)容 器、驅(qū)動(dòng)裝置和在線供液、供氣及監(jiān)測系統(tǒng)。其中一、培養(yǎng)容器在環(huán)擺的托盤上設(shè)計(jì)有具有U形、W形底面或V形底面的細(xì)胞培養(yǎng)容器10，可以使 用玻璃、塑料、不銹鋼等制成，優(yōu)選聚丙烯塑料。在使用玻璃培養(yǎng)容器10結(jié)合微載體技術(shù)進(jìn) 行細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)，需要將容器的內(nèi)壁預(yù)先進(jìn)行硅化。兩種培養(yǎng)容器10的上方有一頂蓋25，與 其下方的容器密封，但可以拆卸，在頂蓋的中央部分有開口，分別容納加液管8、出液管9、 出氣管28、溶氧電極14、pH電極15、(X)2電極四等的進(jìn)出。如圖2、圖3所示，U形及W形底面的細(xì)胞培養(yǎng)容器10為具有圓弧形底面的一種容 器。這種容器的底面沒有死角，因此在培養(yǎng)液旋轉(zhuǎn)時(shí)不會(huì)產(chǎn)生劇烈的應(yīng)力改變，對細(xì)胞破壞 作用最小；W形底面的培養(yǎng)容器的中央高凸，主要用于微載體培養(yǎng)時(shí)防止微載體沉降聚集。如圖3所示，V形培養(yǎng)容器10的底面呈V形。V形底面的設(shè)計(jì)主要是用來培養(yǎng)貼 壁細(xì)胞及具有組織工程構(gòu)建物的培養(yǎng)，尤其是需要有液氣雙相交替的培養(yǎng)。本發(fā)明生物反應(yīng)器的培養(yǎng)容器10是獨(dú)立的一種結(jié)構(gòu)，可以方便地進(jìn)行拆卸、清洗 及消毒，在進(jìn)行組織工程細(xì)胞培養(yǎng)和/或組織工程構(gòu)建物的培養(yǎng)時(shí)，優(yōu)選使用一次性的培養(yǎng)容器，以避免交叉感染。本反應(yīng)器的優(yōu)點(diǎn)是在培養(yǎng)容器內(nèi)沒有攪拌槳等存在，培養(yǎng)容器 內(nèi)剪力分布均勻，容器內(nèi)細(xì)胞受到損傷的可能性極小，可適用于各種類型的細(xì)胞培養(yǎng)，尤其 適用于組織工程種子細(xì)胞和/或組織工程構(gòu)建物的三維培養(yǎng)；同時(shí)，本生物反應(yīng)器的培養(yǎng) 容器在托盤上不產(chǎn)生旋轉(zhuǎn)，使得在線的供液及供氣變得十分容易，并且方便了培養(yǎng)時(shí)在線 的監(jiān)測。二、驅(qū)動(dòng)裝置如圖1所示，驅(qū)動(dòng)裝置為具有環(huán)擺動(dòng)力的系統(tǒng)提供動(dòng)力，驅(qū)動(dòng)裝置包括托盤17、底 座18、轉(zhuǎn)盤21和步進(jìn)電機(jī)22，環(huán)形擺動(dòng)是由一個(gè)托盤17所提供，此處所稱托盤17可以是 平的，也可以配合其上方的培養(yǎng)容器而制成其它的形狀，培養(yǎng)容器10設(shè)置在托盤17上。托 盤17的中央設(shè)有一個(gè)球形關(guān)節(jié)M與底座連接18，使得這個(gè)托盤17可以自由的擺動(dòng)，在托 盤17的下方設(shè)有四個(gè)不在同一水平面的、高度可以調(diào)節(jié)的支撐桿20，支撐桿20固定于底 座18上其每個(gè)支撐桿20的上方都有一個(gè)滑輪19，支撐桿固定于其下方的轉(zhuǎn)盤21上，轉(zhuǎn)盤 21與同定底座之間有滾動(dòng)軸承沈連接；由步進(jìn)電動(dòng)機(jī)22驅(qū)動(dòng)轉(zhuǎn)盤21，使轉(zhuǎn)盤21產(chǎn)生轉(zhuǎn) 動(dòng)，通過可調(diào)節(jié)支撐桿20上方的滑輪19在托盤17下方的滾動(dòng)，將動(dòng)力傳遞到其上方的托 盤17，并使之產(chǎn)生環(huán)形的擺動(dòng)。如圖5所示，球形關(guān)節(jié)M的球形頭的上方有壓蓋30，壓蓋 30通過螺絲釘將球形頭穩(wěn)定于底座18上。壓蓋30的上方有與托盤17之間連接的壓力彈 簧31，這種結(jié)構(gòu)用以保持其上方的托盤17在擺動(dòng)的時(shí)候不會(huì)產(chǎn)生轉(zhuǎn)動(dòng)。這種環(huán)形的擺動(dòng)使得在其上方的培養(yǎng)容器10內(nèi)的培養(yǎng)液13分別產(chǎn)生旋轉(zhuǎn)流動(dòng)、 波浪式及旋轉(zhuǎn)運(yùn)動(dòng)。這種動(dòng)力作用在較低的速度及較大的擺動(dòng)角度時(shí)，可以使得培養(yǎng)容器 10內(nèi)的液體呈現(xiàn)偏心的圓周式波浪式運(yùn)動(dòng)，同時(shí)又有上下方向的運(yùn)動(dòng)及轉(zhuǎn)動(dòng)，這種培養(yǎng)液 13的運(yùn)動(dòng)方式有利于防止培養(yǎng)的細(xì)胞或結(jié)合有細(xì)胞的微載體聚集成團(tuán)；而在較高的擺動(dòng) 速度及較小的擺動(dòng)角度時(shí)，可以使培養(yǎng)容器10內(nèi)的培養(yǎng)液13呈現(xiàn)旋轉(zhuǎn)，并有上下的運(yùn)動(dòng)； 這種運(yùn)動(dòng)方式實(shí)現(xiàn)了良好的培養(yǎng)容器10外部的攪拌作用，使容器內(nèi)的培養(yǎng)液13既有旋轉(zhuǎn) 運(yùn)動(dòng)，又有上下的運(yùn)動(dòng)，既能通過液面表面積增加、液面的不斷更新及對容器壁面的沖刷等 作用增加培養(yǎng)液內(nèi)的氧含量，還可通過旋轉(zhuǎn)增加培養(yǎng)液內(nèi)的傳質(zhì)，即能夠增強(qiáng)橫向的傳質(zhì)， 又可以增強(qiáng)軸向縱向傳質(zhì)，在進(jìn)行不同細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)，可以通過環(huán)形擺動(dòng)的角度和通過調(diào)整 步進(jìn)電動(dòng)機(jī)22的速率對反應(yīng)器的參數(shù)進(jìn)行調(diào)整。三、在線供液、供氣及監(jiān)測系統(tǒng)如圖1所示，在線供液系統(tǒng)主要指用于實(shí)現(xiàn)培養(yǎng)基及氣體的在線更換，同時(shí)也用 于培養(yǎng)時(shí)的細(xì)胞加入及取出。在線供液系統(tǒng)包括加液儲(chǔ)液瓶12和收液儲(chǔ)液瓶11，加液儲(chǔ)液 瓶12連接設(shè)有加液管8，加液管8連接培養(yǎng)容器13，加液管8上設(shè)有加液蠕動(dòng)泵7 ；收液儲(chǔ) 液瓶11連接設(shè)有出液管9，出液管9連接培養(yǎng)容器13，出液管9伸入培養(yǎng)容器13的高低可 調(diào)節(jié)，出液管9上設(shè)有出液蠕動(dòng)泵27 ；加液儲(chǔ)液瓶12的進(jìn)氣管和收液儲(chǔ)液瓶11的出氣管 23分別設(shè)有空氣過濾器5。加液儲(chǔ)液瓶12的進(jìn)氣口有空氣過濾器5將進(jìn)入瓶內(nèi)的空氣過 濾除菌，通過加液管8及加液蠕動(dòng)泵7將培養(yǎng)基泵入培養(yǎng)容器10 ；而出液管9是將培養(yǎng)基 通過出液蠕動(dòng)泵27泵入收液儲(chǔ)液瓶11 ；在培養(yǎng)容器10的頂蓋上，置入到培養(yǎng)容器內(nèi)出液 管9的高低是可以調(diào)節(jié)的，用以控制氣液雙相培養(yǎng)及氣液界面培養(yǎng)時(shí)的液面的高度；在收 液儲(chǔ)液瓶的頂蓋上有收液灌氣體出口 23，并有空氣過濾器5相連。該生物反應(yīng)器的氣體控制系統(tǒng)包括一個(gè)(X)2入口 1，一個(gè)氮?dú)馊肟?2和一個(gè)&入口 3。這三種氣體通過氣體控制閥25控制，使得進(jìn)入反應(yīng)器容器10內(nèi)的氣體保持一定的比 例?；旌虾蟮臍怏w通過氣泵4、空氣過濾器5及進(jìn)氣管6進(jìn)入培養(yǎng)容器10 ；通過帶有空氣過 濾器5的出氣管觀移出培養(yǎng)容器10。該生物反應(yīng)器的在線檢測包括深入到培養(yǎng)基內(nèi)的溶 氧電極14及pH電極15和(X)2電極四。實(shí)施例2細(xì)胞的懸浮培養(yǎng)細(xì)胞的懸浮培養(yǎng)可以是非貼壁依賴性細(xì)胞，也可以是貼壁依賴 性細(xì)胞與微載體培養(yǎng)技術(shù)的結(jié)合。經(jīng)過處理并滅菌的U形及W形底的細(xì)胞培養(yǎng)容器或其他 培養(yǎng)容器及軟墊安放于環(huán)擺托盤上，調(diào)節(jié)好支撐滑輪的高度使托盤的與水平面形成一定的 角度，推薦5 30°，將需要培養(yǎng)的細(xì)胞調(diào)整好濃度后通過培養(yǎng)容器上蓋的加液管將細(xì)胞 加入到培養(yǎng)容器內(nèi)，再加入一定量的培養(yǎng)基，然后連接好進(jìn)液、出液、監(jiān)控電極及氣體進(jìn)出 的管道；開動(dòng)步進(jìn)電動(dòng)機(jī)使托盤產(chǎn)生環(huán)轉(zhuǎn)；如果采用的是微載體培養(yǎng)，開始環(huán)擺的速度較 慢，推薦15 60轉(zhuǎn)/分鐘，隨著細(xì)胞的生長可以逐漸增加環(huán)擺的速度，以保持微載體不至 于沉降，同時(shí)增強(qiáng)了傳質(zhì)。對于培養(yǎng)基的更換推薦使用流加式；細(xì)胞的收集是通過出液管將 培養(yǎng)的細(xì)胞或微載體細(xì)胞復(fù)合物收集在收液儲(chǔ)液瓶內(nèi)。在這種培養(yǎng)方式對細(xì)胞的損傷小， 細(xì)胞培養(yǎng)過程簡單而且容易控制，培養(yǎng)方式即可進(jìn)行大規(guī)模的培養(yǎng)，又可以進(jìn)行小規(guī)模的 細(xì)胞培養(yǎng)，應(yīng)用前景廣闊。實(shí)施例3組織工程支架細(xì)胞復(fù)合物的培養(yǎng)推薦選擇V形底面的培養(yǎng)容器，在進(jìn)行氣液雙 相及氣液界面培養(yǎng)時(shí)，可將旋轉(zhuǎn)面的角度進(jìn)一步增大到15 45°，并使V形培養(yǎng)容器的一 側(cè)的底邊壁近似水平，培養(yǎng)液加入到能高于組織工程構(gòu)建物1 5cm，并通過調(diào)節(jié)出液管的 高低以控制液面的高度，慢速環(huán)形擺動(dòng)托盤，優(yōu)選0. 2 12轉(zhuǎn)/min，使培養(yǎng)液沿培養(yǎng)容器的 底壁緩慢流動(dòng)，這樣在底壁上組織工程構(gòu)建物就可以得到完全浸沒式或氣液雙相的培養(yǎng)， 調(diào)整容器的大小、培養(yǎng)液加入量及托盤的環(huán)擺速度就可以調(diào)整貼壁細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)的氣/液相 時(shí)間的比例，或者調(diào)節(jié)成氣液界面的形式。在完全的浸沒式培養(yǎng)時(shí)，培養(yǎng)液的流動(dòng)可增加構(gòu) 建物內(nèi)部的傳質(zhì)，而在氣液雙相培養(yǎng)時(shí)，又可增加構(gòu)建物內(nèi)的含氧量，解決了組織工程構(gòu)建 物培養(yǎng)過程中內(nèi)部傳質(zhì)不良及氧含量的問題，其組織工程構(gòu)建物內(nèi)部的氧含量優(yōu)于旋轉(zhuǎn)攪 拌式及灌注式生物反應(yīng)器。
權(quán)利要求
1.用于細(xì)胞或組織工程生物培養(yǎng)的裝置，其特征在于該裝置包括培養(yǎng)容器(1 和驅(qū) 動(dòng)裝置，所述的培養(yǎng)容器(π)采用U形底面、W形底面或V形底面的培養(yǎng)容器(13)，所述的 驅(qū)動(dòng)裝置采用環(huán)形擺動(dòng)動(dòng)力系統(tǒng)，環(huán)形擺動(dòng)動(dòng)力系統(tǒng)包括托盤(17)、底座(18)、轉(zhuǎn)盤 和動(dòng)力裝置0 ；所述的培養(yǎng)容器(1 設(shè)置在托盤(17)上，托盤(17)的中央固定設(shè)置有 球形關(guān)節(jié)(M)，球形關(guān)節(jié)04)的球形頭設(shè)置在底座(18)的球形孔內(nèi)；所述的轉(zhuǎn)盤設(shè) 置在托盤(17)的下方由動(dòng)力裝置0 帶動(dòng)旋轉(zhuǎn)，轉(zhuǎn)盤上設(shè)置有多個(gè)高度依次升降的 支撐桿(20)，支撐桿00)的上端與托盤(17)的下表面相抵。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于細(xì)胞或組織工程生物培養(yǎng)的裝置，其特征在于支撐桿 (20)的高度可調(diào)，托盤(17)與水平面所成的角度為5 45°。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的用于細(xì)胞或組織工程生物培養(yǎng)的裝置，其特征在于球 形關(guān)節(jié)04)的球形頭的上方設(shè)置有壓蓋(30)，壓蓋(30)固定在底座(18)上，壓蓋(30)上 方設(shè)有與托盤(17)相連接的壓力彈簧(31)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的用于細(xì)胞或組織工程生物培養(yǎng)的裝置，其特征在于該 裝置還包括溫控裝置，所述的溫控裝置為恒溫墊(16)，恒溫墊(16)設(shè)置在托盤(17)與培養(yǎng) 容器(13)之間。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的用于細(xì)胞或組織工程生物培養(yǎng)的裝置，其特征在于該 裝置還包括加液儲(chǔ)液瓶(1 和收液儲(chǔ)液瓶(11)；加液儲(chǔ)液瓶(1 連接設(shè)有加液管(8)，加 液管(8)連接培養(yǎng)容器(13)，加液管(8)上設(shè)有加液蠕動(dòng)泵(7)；收液儲(chǔ)液瓶(11)連接設(shè) 有出液管(9)，出液管(9)連接培養(yǎng)容器(13)，出液管(9)伸入培養(yǎng)容器(1 的高低可調(diào) 節(jié)，出液管(9)上設(shè)有出液蠕動(dòng)泵(XT)；加液儲(chǔ)液瓶(1 的進(jìn)氣管和收液儲(chǔ)液瓶(11)的 氣體出口 03)分別設(shè)有空氣過濾器(5)。
6.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的用于細(xì)胞或組織工程生物培養(yǎng)的裝置，其特征在于該 裝置還包括CO2入口(1)、氮?dú)馊肟?0)、02入口(3)、氣泵0)、空氣過濾器(5)、進(jìn)氣管(6) 和出氣管⑶)，0)2入口 (1)、氮?dú)馊肟?(2)和O2入口 (3)分別連接氣泵(4)，氣泵(4)連接 空氣過濾器(5)，空氣過濾器( 通過進(jìn)氣管(6)連接培養(yǎng)容器(1 ；出氣管08)設(shè)置在 培養(yǎng)容器(1 上，出氣管08)設(shè)有空氣過濾器(5)。
7.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的用于細(xì)胞或組織工程生物培養(yǎng)的裝置，其特征在于該 裝置還包括溶氧電極(14)、pH電極(15)和CO2電極( )，溶氧電極(14)、pH電極(15)和 CO2電極(29)插設(shè)在培養(yǎng)容器(13)內(nèi)。
8.用于細(xì)胞或組織工程生物培養(yǎng)的方法，其特征在于該方法將細(xì)胞或組織工程生物 培養(yǎng)原料置于U形底面、W形底面或V形底面的培養(yǎng)容器(1 中，采用環(huán)形擺動(dòng)動(dòng)力系統(tǒng) 驅(qū)動(dòng)培養(yǎng)容器(1 環(huán)形擺動(dòng)，所述的環(huán)形擺動(dòng)為培養(yǎng)容器(1 以中心為支點(diǎn)，同一圓周上 的每個(gè)點(diǎn)依次上、下擺動(dòng)。
9.用于細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的方法，其特征在于該方法將細(xì)胞培養(yǎng)原料置于U形或W形底 的細(xì)胞培養(yǎng)容器(1 中，采用環(huán)形擺動(dòng)動(dòng)力系統(tǒng)驅(qū)動(dòng)培養(yǎng)容器(1 環(huán)形擺動(dòng)，所述的環(huán)形 擺動(dòng)為培養(yǎng)容器(1 以中心為支點(diǎn)，同一圓周上的每個(gè)點(diǎn)依次上、下擺動(dòng)，上、下擺動(dòng)的角 度為5 30°。
10.用于組織工程生物培養(yǎng)的方法，其特征在于該方法將組織工程生物培養(yǎng)原料置 于V形底面的培養(yǎng)容器(13)，中，采用環(huán)形擺動(dòng)動(dòng)力系統(tǒng)驅(qū)動(dòng)培養(yǎng)容器(1 環(huán)形擺動(dòng)，所述的環(huán)形擺動(dòng)為培養(yǎng)容器(1 以中心為支點(diǎn)，同一圓周上的每個(gè)點(diǎn)依次上、下擺動(dòng)，上、下擺 動(dòng)的角度為15 45°。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種生物反應(yīng)器和方法，尤其涉及一種細(xì)胞生物學(xué)、組織工程學(xué)和醫(yī)學(xué)中進(jìn)行種子細(xì)胞培養(yǎng)或者細(xì)胞與生物材料復(fù)合培養(yǎng)的反應(yīng)器和方法。用于細(xì)胞或組織工程生物培養(yǎng)的方法，該方法將細(xì)胞或組織工程生物培養(yǎng)原料置于U形底面、W形底面或V形底面的培養(yǎng)容器中，采用環(huán)形擺動(dòng)動(dòng)力系統(tǒng)驅(qū)動(dòng)培養(yǎng)容器環(huán)形擺動(dòng)，所述的環(huán)形擺動(dòng)為培養(yǎng)容器以中心為支點(diǎn)，同一圓周上的每個(gè)點(diǎn)依次上、下擺動(dòng)。本發(fā)明還公開了上述方法的一種裝置。本發(fā)明通過外部環(huán)擺提供的動(dòng)力，可在較理想的傳質(zhì)條件下，減少細(xì)胞的損傷，提供較為均一的培養(yǎng)環(huán)境。
文檔編號(hào)C12N5/00GK102086438SQ200910155158
公開日2011年6月8日 申請日期2009年12月7日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月7日
發(fā)明者于瑋潔, 孫華鳳, 有傳剛, 王新剛, 胡信雷, 胡行, 韓春茂 申請人:韓春茂