專利名稱：基于四唑鎓化合物的診斷劑的制作方法
本申請是1998年9月28日申請的美國專利申請第09/161876號申請的繼續(xù)部分。
本發(fā)明涉及診斷用組合物，該組合物可以測量分析物在含血紅蛋白的生物體液中的濃度。該組合物是基于四唑鎓染料前體的，并可抑制血紅蛋白引起的還原反應。
脂肪組織是體內(nèi)能量儲存的最大量形式之一。它將所儲存的脂肪酸釋放至主要由肝臟代謝的循環(huán)系統(tǒng)。在此過程中，消耗脂肪并釋放出能量供身體使用。正常情況下，很少消耗脂肪，脂肪酸完全代謝成二氧化碳和水，并且該轉化不會擾亂體內(nèi)敏感的pH平衡。但是，如果由于例如節(jié)食而在體內(nèi)存在不足量的碳水化合物，那么脂肪的消耗和脂肪酸的產(chǎn)生可以增加至可能造成危害的水平。除了節(jié)食者以外，胰島素依賴性患者由于碳水化合物代謝被破壞而容易受到傷害。若使用過量的脂肪酸供應身體能量的需求，則將產(chǎn)生大量的乙酰乙酸鹽、丙酮及β-羥丁酸鹽。這些中間體稱為酮體，這種情形稱為酮酸中毒。
只要酮體不是太過量，它通?？山?jīng)身體再度循環(huán)成其他形式，因此這些分析物在健康個體中的蓄積量是可以忽視的。當大量的脂肪在相當短的期間內(nèi)代謝，或當大部分的能量是來源于脂肪時，將產(chǎn)生大量的酮體。這些脂肪代謝物的過量產(chǎn)生，如果沒有及時糾正的話，將會導致某些神經(jīng)上的疾病。
酮體存在于血液中，如果超過閾值，可經(jīng)尿液排出，用先進的臨床分析儀器是很容易檢測出來的。一股來說，β-羥丁酸鹽、乙酰乙酸鹽和丙酮的百分比分別為78％、20％和2％。由于丙酮具有相對較低的濃度和較高的揮發(fā)性，因此很少測量丙酮，而是通過硝普鹽反應定量測定乙酰乙酸鹽，并通過酶促法定量β-羥丁酸鹽。乙酰乙酸鹽測試條已經(jīng)應用了數(shù)十年，它是以硝普鹽離子與醛及酮的偶合反應為基礎制造的。使堿性尿液樣本或血清樣本與硝普鹽反應數(shù)分鐘，顯紫色，顏色的強度顯示乙酰乙酸鹽的濃度。但是丙酮會干擾該測試，并導致讀數(shù)偏高。而且當患者從酮酸中毒事件中恢復時，尿液和血液中的乙酰乙酸鹽含量升高，因此增加了診斷的難度。
β-羥丁酸鹽測試對酮體濃度的監(jiān)測更為有用，它以β-羥丁酸鹽與相應脫氫酶在煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)輔因子存在下的氧化反應為基礎(嚴格說來，只有D-β-羥丁酸鹽是天然存在并氧化的，但是我們?yōu)榱撕喕鹨?，在本說明書及附帶的權利要求書中省略了“D”)。氧化生成NADH，其濃度可用UV分光光度計直接測量，因此光譜中相應信號的變化與分析物的濃度成正比。不幸的是，NADH的激發(fā)是發(fā)生在UV區(qū)域內(nèi)的，所以該檢測方式只適合于實驗室儀器。另一種監(jiān)測β-羥丁酸鹽的方法是用四唑鎓化合物氧化NADH。
四唑鎓化合物通常對強堿和光非常敏感，因此必須特別小心，以確保這些化合物的完整。然而四唑鎓化合物在組織代謝的研究中扮演重要的角色，例如這類化合物曾用于探測細胞中的厭氧性氧化及還原反應，而且普遍用在臨床診斷中。這種化合物通常是淺色或無色的化合物，在還原劑的存在下發(fā)生還原反應，產(chǎn)生深色的甲。諸如抗壞血酸鹽、硫氫化物或各種NADH、NADPH和PQQH2(還原的PQQ-吡咯并喹啉醌)等還原劑能夠形成染料。
在臨床診斷中發(fā)現(xiàn)，這些染料對于監(jiān)測厭氧反應中從母體化合物NAD(P)+生成NAD(P)H是沒有用的(例如參見于1994年11月1日頒給D.Bell等的美國專利第5360595號)。該氧化還原反應迅速，且對氧不敏感，所得染料顏色非常強烈，且在水中的溶解度較低。
原則上，四唑鎓染料前體可用于測量全血中的酮體和葡萄糖。但是如果血紅蛋白不是包含在血液的紅細胞內(nèi)，四唑鎓化合物可被血紅蛋白(Fe(II))非酶促地還原生成有顏色的甲，因此，游離的血紅蛋白會對測量造成嚴重的干擾。事實上，由于血細胞溶解作用以及相對于分析物來說產(chǎn)生的游離血紅蛋白量很大，因此在典型的酮體測量中，來自血紅蛋白的干擾信號將超過所要測量的信號。葡萄糖的測量，特別是在正常或更高的濃度下，尚沒有什么不利影響。當在高血細胞比容樣本中或在高溫下進行反應時，血紅蛋白更加快速地氧化，對葡萄糖測量的干擾也很明顯。因為無法輕易地避免由于紅細胞的血細胞溶解作用而導致游離血紅蛋白的存在，如果用四唑鎓化合物進行分析時，在測試前必須先除去樣本中的紅細胞。
從樣本中除去紅細胞的方法是用膜及濾器過濾、用化學試劑捕集，或兩種方法的結合。從全血中分離紅細胞的過濾法是昂貴的，且需要相當大的樣本體積。使用過濾法從全血樣本中除去紅細胞的血酮(β-羥丁酸鹽)測試法實例是可由GDSDiagnostics，Elkhart，IN得到的KetoSite測試法(見《Tietz臨床化學教科書》第2版，C.Burtis等編，W.B.Saunders Co.，Philadelphia，PA出版，1994，P974)。在該測試中使用的“測試卡”有兩個過濾層，這使得該卡相當昂貴，且需要大量(25μL)的血液樣本，而且血液必須是血細胞未溶解化的。
可由Miles得到的AmesGlucometer EncoreTM血液葡萄糖測試條中使用了過濾與化學捕集的組合，該測試條利用一層過濾材料和一種凝集助劑(馬鈴薯卵磷脂)來消除紅細胞的干擾(見Chu等，1995年2月15日公開的歐洲專利申請0638805A2)。
在系統(tǒng)中加入一種氧化劑，將血紅蛋白氧化成高鐵血紅蛋白，是減少血紅蛋白干擾的另一種方法。雖然已知鐵氰化物可將血紅蛋白轉化為高鐵血紅蛋白，但是它們也會破壞所需的產(chǎn)物NADH。
本發(fā)明提供了一種用于測量分析物在含血紅蛋白的生物體液中的濃度的試劑。該試劑包含a)對分析物具有專一性的脫氫酶，b)煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)、NAD衍生物、吡咯并喹啉醌(PQQ)或PQQ衍生物，c)四唑鎓染料前體，d)心肌黃酶或其類似物，和e)亞硝酸鹽。
該試劑特別適合涂覆在一或多種基質上以形成用于測量分析物的干燥試劑條。特別優(yōu)選的試劑條包含a)支撐層，b)位于支撐層上含有涂層的測試襯墊，該涂層含i)對分析物具有專一性的脫氫酶，ii)煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)、NAD衍生物、吡咯并喹啉醌(PQQ)或PQQ衍生物，iii)四唑鎓染料前體，和iv)心肌黃酶或其類似物，和c)位于測試襯墊上，涂覆亞硝酸鹽的吸收性頂層。


圖1為本發(fā)明測試條的透視圖。
圖2為本發(fā)明另一種測試條的分解圖。
圖3為本發(fā)明又一種測試條的分解圖。
圖4為本發(fā)明的酮測試化學法的圖形說明。
圖5為本發(fā)明的葡萄糖測試化學法的圖形說明。
圖6為亞硝酸鹽作為血紅蛋白抑制劑對酮測試法所顯示的作用圖。
圖7為亞硝酸鹽作為血紅蛋白抑制劑對葡萄糖測試法所顯示的作用圖。
本發(fā)明提供了一種用于測量分析物在含血紅蛋白的生物體液(例如全血)中濃度的試劑，借助于所產(chǎn)生的輔因子例如NADH、NAD(P)H或PQQH2的還原形式的濃度，用來測量分析物的濃度。在試劑中含有亞硝酸鹽可以克服血紅蛋白對還原型輔因子濃度測量的干擾，尤其適用于(但不限于)酮體和葡萄糖的測量。
圖1說明本發(fā)明的典型測試條10，其中包括固定在支撐物14上的測試襯墊12。該支撐物可以是塑料一例如聚苯乙烯、尼龍或聚酯-或金屬片，或本領域已知的任意其他適當材料。測試襯墊上涂覆有與分析物反應而引起顏色變化的試劑。測試襯墊優(yōu)選包含吸收性材料，例如濾紙或聚合物膜。不過既然反應不需要氧，測試襯墊也可以是非吸收性材料，例如塑料膜。試劑含有對分析物具有專一性的酶、氫化物傳遞劑、四唑鎓染料前體、適當?shù)拿篙o因子和血紅蛋白抑制劑，可選地還含有緩沖劑或穩(wěn)定劑，以提供更大的穩(wěn)定性。
如圖2所示，測試條也可以是多層結構，以頂層16覆蓋測試襯墊12。在該結構中，試劑可分散在兩層之間，例如血紅蛋白抑制劑可涂覆在可選的頂層16上，并將其余的試劑涂覆在測試襯墊12上，優(yōu)選頂層16具有吸收性，既起到擴散層的作用，又起到吸收層的作用，以吸附過量的樣本。將樣本添加至頂層16，通過頂層到達測試襯墊12，通過測量透過支撐層14的顏色變化來測定分析物濃度，或者當連接反應區(qū)域的層14是不透明的情況下，通過測量透過可選的窗口或中空的孔18的顏色變化，來測定分析物的濃度。
在圖3所顯示的另一種實施方式中，間隔層20將頂層16和測試襯墊12分開。間隔層20優(yōu)選為非吸收性的塑料膜，在兩面都有黏附性涂層(沒有顯示)。間隔層20中的通道22提供毛細管通道，供樣本從開口24流至測試區(qū)域26。流動取決于測試襯墊12的表面與連接層之間的空氣流通，或者取決于可選的排氣口18。測試區(qū)域26的顏色變化通過可選的排氣口/窗口18進行監(jiān)測，試劑可以全部在測試襯墊12上，或者分散在測試襯墊以及兩個非吸收性層14和16或之一上。據(jù)此，第一部分試劑可在測試襯墊上，第二部分試劑可在兩個非吸收性層或之一上。當我們稱試劑為一個“涂層”或在某層的“上面”時，我們是指也包括試劑被吸附至該層內(nèi)的可能性，尤其是當該層具有吸收性時。
適用于本發(fā)明測試法的酶及相應的分析物為檢測醇的醇脫氫酶、檢測甲醛的甲醛脫氫酶、檢測葡萄糖的葡萄糖脫氫酶、檢測葡萄糖-6-磷酸鹽的葡萄糖-6-磷酸鹽脫氫酶、檢測谷氨酸的谷氨酸鹽脫氫酶、檢測甘油的甘油脫氫酶、檢測β-羥丁酸鹽的β-羥丁酸鹽脫氫酶、檢測類固醇的羥基類固醇脫氫酶、檢測L-乳酸鹽的L-乳酸鹽脫氫酶、檢測亮氨酸的亮氨酸脫氫酶、檢測蘋果酸的蘋果酸鹽脫氫酶和檢測丙酮酸的丙酮酸鹽脫氫酶。
需要適當?shù)拿篙o因子以活化酶，因酶而異，可以使用的輔因子有β-煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(β-NAD)、β-煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(β-NADP)、硫代煙酰胺腺嘌呤二核苷酸、硫代煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸、煙酰胺1，N6-乙烯腺嘌呤二核苷酸、煙酰胺1，N6-乙烯腺嘌呤二核苷酸磷酸和吡咯并喹啉醌(PQQ)。在酶的存在下，輔因子被分析物還原。
染料形成過程的下一步是從還原型輔因子提取氫化物，其可通過心肌黃酶或其類似物來完成，心肌黃酶例如硫辛酸脫氫酶、鐵氧化還原蛋白-NADP還原酶、硫辛酰胺脫氫酶，其類似物，例如吩嗪甲基硫酸鹽(PMS)或Meldola Blue。反應動力學和穩(wěn)定性是選擇氫化物傳遞劑或“提取劑”的主要因素，例如，PMS是通用的氫化物提取劑，因為它對于大部分下列四唑鎓化合物具有相當迅速的反應動力?；谶@個理由，若輔因子為PQQ，則以PMS為優(yōu)選。但是PMS對光的敏感性要高于以酶為基礎的氫化物提取劑。心肌黃酶較穩(wěn)定，因此，若輔因子為NAD，則以心肌黃酶為優(yōu)選。
被捕集的氫化物傳遞至四唑鎓化合物(染料前體)而生成有色的甲。最適合該裝置的四唑鎓化合物為2-(2’-苯并噻唑基)-5-苯乙烯基-3-(4’-鄰苯二甲酰肼基)四唑鎓(BSPT)、2-苯并噻唑基-(2)-3，5-二苯基四唑鎓(BTDP)、2，3-二(4-硝基苯基)四唑鎓(DNP)、2，5-二苯基-3-(4-苯乙烯苯基)四唑鎓(DPSP)、二苯乙烯基硝基藍四唑鎓(DS-NBT)、3，3’-[3，3’-二甲氧基-(1，1’-聯(lián)苯基)-4，4’-二基]-雙[2-(4-硝基苯基)-5-苯基]-2H-四唑鎓(NBT)、3-(4，5-二甲基-2-噻唑基)-2，5-二苯基-2H-四唑鎓(MTT)、2-苯基-3-(4-羧苯基)-5-甲基四唑鎓(PCPM)、四唑鎓藍(TB)、硫代氨基甲?；趸{四唑鎓(TCNBT)、四硝基藍四唑鎓(TNBT)、四唑鎓紫(TV)、2-苯并噻唑并噻唑基-3-(4-羧基-2-甲氧基苯基)5-[4-(2-磺乙基氨基甲?；?苯基]-2H-四唑鎓(WST-4)和2，2’-二苯并噻唑基-5，5’-雙[4-二(2-磺乙基)氨基甲?；交鵠-3，3’-(3，3’-二甲氧基-4，4’-亞聯(lián)苯基)二四唑鎓二鈉鹽(WST-5)。優(yōu)選為WST-5，因為它在水性介質中容易溶解，與生物樣本最相容，而且，所得的甲化合物在紫—藍區(qū)域顯示強烈的光譜吸收，從而減少了校正來自血紅蛋白的本底信號的需要。
最后，存在于試劑中的血紅蛋白抑制劑可減少血紅蛋白與四唑鎓化合物之間所不需要的染料形成反應。血紅蛋白抑制劑的作用是將血紅蛋白氧化成高鐵血紅蛋白，后者不會與四唑鎓或甲反應。令人驚奇的是，亞硝酸鹽，例如亞硝酸鈉、亞硝酸鉀及其衍生物，對于抑制血紅蛋白是非常有效的，同時還不會破壞還原型輔因子(例如NADH或PQQH2)，亞硝酸鹽在高溫和高血細胞比容的樣本中都是有效的。優(yōu)選為亞硝酸鈉，因為它具有較高的水溶解度，沒有毒性且相對便宜。
盡管本發(fā)明試劑可在濕化學模式、例如在比色杯中使用，不過在優(yōu)選的實施方式中，本發(fā)明提供了用于化驗全血中的β-羥丁酸鹽或葡萄糖的干燥測試條。由膜測試襯墊、優(yōu)選為尼龍組成的測試條置于支撐物與頂層之間，支撐物優(yōu)選為聚酯薄片，頂層可以是本領域中已知的任意吸收性材料。優(yōu)選的材料是經(jīng)油酰牛磺酸甲酯鈉處理過的多孔性聚乙烯，可由Porex Corp.Fairburn，GA得到，我們稱之為“Porex”。測試襯墊含有由β-羥丁酸鹽脫氫酶(或葡萄糖脫氫酶)、NAD(或PQQ)、心肌黃酶(或PMS)和WST-5組成的試劑(下文表1(或表3))，Porex頂層含有亞硝酸鹽試劑(表2)。
在操作中，使用者將一滴全血添加至Porex頂層的上表面，當全血或胞溶的血與Porex接觸后，亞硝酸鈉再生并與可利用的游離血紅蛋白反應，因此使血紅蛋白對化驗無害。所得事實上不含血紅蛋白的樣本通過毛細管或重力作用轉移至下面的測試襯墊，在測試襯墊上，樣本引發(fā)級聯(lián)反應而產(chǎn)生有顏色的染料，其濃度與樣本中的分析物濃度成正比，并可直接用光度計測量。圖4說明用酶、NAD和心肌黃酶進行的β-羥丁酸鹽的反應。圖5說明用酶、PQQ和PMS進行的葡萄糖的反應。
圖6說明了血樣的光密度隨時間的變化，全部樣本都具有55％的血細胞比容，并含有0至15毫克/分升的β-羥丁酸鹽，含有或不含亞硝酸鹽。使用NAD系統(tǒng)，且亞硝酸鹽的濃度為5克/分升。在沒有亞硝酸鹽存在的條件下，血紅蛋白會還原四唑鎓而使染料濃度連續(xù)增加，光密度也相應增加。通過除去血紅蛋白(通過氧化反應)，亞硝酸鹽限制了顏色的形成，使顏色的形成僅僅來自樣本中的酮體(也就是β-羥丁酸鹽)。下文實施例1描述了測試條的制備方法，該測試條用于得出圖中說明的數(shù)據(jù)。
圖7顯示亞硝酸鹽在葡萄糖/PQQ系統(tǒng)中對顏色形成反應的作用。血樣都具有60％的血細胞比容，含有0或100毫克/分升的葡萄糖和0或5克/分升的亞硝酸鹽。不含葡萄糖的樣本在35℃下操作。圖形顯示本系統(tǒng)在溫度高達35℃、且血細胞比容高達60％的條件下仍然是有效的。所用的測試條的制備方法描述在下文的實施例2中。
下列實施例用來說明本發(fā)明的優(yōu)選實施方式。在實施例1中，分析物為β-羥丁酸鹽，酶為β-羥丁酸鹽脫氫酶。在實施例2中，分析物為葡萄糖，酶為葡萄糖脫氫酶。可以很容易地對組合物進行改良，以用于前文所列的其他分析物—酶的組合(例如，見《Tietz臨床化學教科書》第2版，C.Burtis等編，W.B.SaundersCo.，Philadelphia，PA出版，1994，P976-978及1174-1175)。這些實施例不以任何方式限制本發(fā)明。
實施例1將由Cuno(Meriden，CT，USA)得到的0.8微米尼龍膜浸在表1試劑中直至飽和，用玻璃棒輕輕地將過量的試劑刮除。將所得的膜懸吊在56℃的烘箱中10分鐘，使其干燥。將Porex(0.6毫米厚)浸在表2的亞硝酸鹽溶液中，然后懸吊在100℃的烘箱中10小時，使其干燥。最后將該膜壓在聚酯材料(由ICI America，Wilmington，DE得到的0.4毫米Melenex聚酯)與浸漬了亞硝酸鹽的Porex之間。
實施例2除了用表3試劑作為第一個浸漬液以外，其余重復實施例1的步驟。
表1用于酮體測試襯墊的試劑
表2亞硝酸鹽試劑
權利要求
1.一種用于測量分析物在含血紅蛋白的生物體液中的濃度的試劑，該試劑包含a)對分析物具有專一性的脫氫酶，b)煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)、NAD衍生物、吡咯并喹啉醌(PQQ)或PQQ衍生物，c)四唑鎓染料前體，d)心肌黃酶或其類似物，和e)亞硝酸鹽。
2.權利要求1的試劑，其中分析物是β-羥丁酸鹽，酶是β-羥丁酸鹽脫氫酶。
3.權利要求1的試劑，其中分析物是葡萄糖，酶是葡萄糖脫氫酶。
4.一種用于測定分析物在含血紅蛋白的生物體液中的存在和含量的干燥試劑條，該試劑條包括一個支撐層，在該支撐層上是具有權利要求1的試劑涂層的測試襯墊。
5.一種用于測定分析物在含血紅蛋白的生物體液中的存在和含量的干燥試劑條，該試劑條包括一個支撐層，在該支撐層上是測試襯墊和覆蓋該測試襯墊的頂層，其中第一部分的權利要求1試劑在該測試襯墊上，第二部分試劑在該支撐層和/或頂層上。
6.權利要求5的試劑條，進一步在該頂層和測試襯墊之間包括間隔層和通道，以在該頂層和襯墊之間提供毛細管路徑。
7.權利要求5的試劑條，其中分析物是β-羥丁酸鹽，酶是β-羥丁酸鹽脫氫酶。
8.權利要求5的試劑條，其中分析物是葡萄糖，酶是葡萄糖脫氫酶。
9.權利要求5的試劑條，其中四唑鎓染料前體是2，2’-二苯并噻唑基-5，5’-雙[4-二(2-磺乙基)氨基甲?；交鵠-3，3’-(3，3’-二甲氧基-4，4’-亞聯(lián)苯基)二四唑鎓二鈉鹽(WST-5)。
10.一種用于測定分析物在含血紅蛋白的生物體液中的存在和含量的干燥試劑條，該試劑條包括a)支撐層，b)位于支撐層上含有涂層的測試襯墊，該涂層含i)對分析物具有專一性的脫氫酶，ii)煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)、NAD衍生物、吡咯并喹啉醌(PQQ)或PQQ衍生物，iii)四唑鎓染料前體，和iv)心肌黃酶或其類似物，和c)位于測試襯墊上，涂覆亞硝酸鹽的吸收性頂層。
全文摘要
一種試劑,適用于測量分析物在含血紅蛋白的生物體液、例如全血中的濃度。該試劑包含對分析物具有專一性的脫氫酶、NAD、NAD衍生物、吡咯并喹啉醌(PQQ)或PQQ衍生物、四唑鎓染料前體、心肌黃酶或其類似物、和亞硝酸鹽。該試劑引起染料形成反應,后者是分析物濃度的量度。亞硝酸鹽抑制了血紅蛋白以非酶促方法對染料形成反應的干擾。優(yōu)選該試劑用在干燥試劑條中,用于測量酮體,如β－羥丁酸鹽。
文檔編號G01N33/68GK1249349SQ99108090
公開日2000年4月5日 申請日期1999年5月8日 優(yōu)先權日1998年9月28日
發(fā)明者歐陽天美, 余紹煬 申請人:生命掃描有限公司