專利名稱：生物傳感器的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種可以廉價(jià)制得、用于迅速、高精度且簡(jiǎn)便地定量測(cè)定試樣中特定化合物的生物傳感器。
作為蔗糖、葡萄糖等糖類的定量分析法已知有使用旋光測(cè)定法、比色法、還原滴定法、各種色譜法等的方法。然而，這些方法因其對(duì)糖類的特異性皆不太高，所以，其精度差。旋光測(cè)定法的操作雖然簡(jiǎn)便，但受操作時(shí)溫度的影響很大。因此，旋光測(cè)定法不適于作為一般人在家庭中進(jìn)行糖類簡(jiǎn)易定量分析的方法。
另外，近年來(lái)，有人開(kāi)發(fā)了利用酶的特異性催化作用的各種類型的生物傳感器。
以下，就葡萄糖的定量方法，作為試樣液中底物的定量方法之一例進(jìn)行說(shuō)明。作為電化學(xué)的葡萄糖定量方法，一般已知使用葡萄糖氧化酶(ECl.1.3.4以下簡(jiǎn)稱為GOD)和氧電極或過(guò)氧化氫電極的方法(請(qǐng)見(jiàn)鈴木周一著《生物傳感器》講談社)。
GOD將氧作為電子接受體，使作為底物的β-D-葡萄糖選擇性地氧化成D-葡糖酸-δ-內(nèi)酯。在氧存在時(shí)，在GOD的氧化反應(yīng)過(guò)程中，氧被還原成過(guò)氧化氫。由氧電極可測(cè)量該氧的減少量，或由過(guò)氧化氫電極測(cè)定過(guò)氧化氫的增加量。氧的減少量，或過(guò)氧化氫的增加量正比例于該試樣中的葡萄糖含量，因此，可從氧的減少量或過(guò)氧化氫的增加量定量測(cè)定葡萄糖。
上述方法如從其反應(yīng)過(guò)程也可推知，其缺點(diǎn)是，測(cè)試結(jié)果受含于試樣液中的氧濃度影響很大，再有，當(dāng)試樣液中不含有氧時(shí)不可能檢測(cè)。
因此，有人開(kāi)發(fā)了不使用氧作為電子接受體，而使用鐵氰化鉀、二茂合鐵、醌衍生物類等的有機(jī)化合物及金屬配合物作為電子接受體的新型葡萄糖傳感器。這一類傳感器是在電極上氧化由酶反應(yīng)的結(jié)果生成的電子接受體的還原體，由此，可以從其氧化電流量求得含于該試樣液中的葡萄糖濃度。將這一類有機(jī)化合物及金屬配合物取代氧用作電子接受體，即可使已知量的GOD及其電子接受體以穩(wěn)定的狀態(tài)準(zhǔn)確地載持于電極上，形成反應(yīng)層。此時(shí)，由于也可使反應(yīng)層以近乎干燥的狀態(tài)與電極系統(tǒng)成為一體，所以，近年來(lái)，基于該技術(shù)的可棄型的普通傳感器受到人們注目。
上述可棄型的葡萄糖傳感器中，僅將試樣液導(dǎo)入可與測(cè)定器作可脫離的連接的傳感器中，如此即可方便地用測(cè)定器測(cè)得葡萄糖濃度。同樣的方法不僅可用于葡萄糖的定量分析，也可應(yīng)用于含于試樣液中的其它底物的定量分析。
使用如上所述的電子接受體，再借使電極系統(tǒng)和反應(yīng)層一體化的技術(shù)，即可對(duì)底物作簡(jiǎn)便的電化學(xué)定量分析。然而，在引線部分使用銀或鈀等的金屬時(shí)，則其制造成本增高。又，用碳制作引線部時(shí)，為抑制電阻的增加，有必要增大引線部分的寬度。然而，增大引線部分的寬度，則從工作電極導(dǎo)出的一部分引線會(huì)接觸試樣溶液，有時(shí)，造成測(cè)定結(jié)果的正誤差。
本發(fā)明提供了一種生物傳感器，所述的生物傳感器由以下的部分構(gòu)成其一端為電極部分、另一端為與測(cè)試儀器的連接部分、形成有一對(duì)由碳組成的引線的基板；設(shè)置于上述基板之上、在與基板之間的空間形成從基板端部至上述電極部分的試樣液供給通道的溝槽的覆蓋部件；在上述基板上圍繞所述電極部分的四周的絕緣層；及具有至少含有氧化還原酶和電子接受體，形成于由前述絕緣層所包圍的電極部上的反應(yīng)層，上述電極部的一側(cè)為大致呈C字狀的對(duì)置電極，其另一側(cè)電極為位于所述大致呈C字狀對(duì)置電極的凹部的工作電極，上述溝槽位于從所述基板的端部跨越所述電極部的部分，且，所述絕緣層延伸到所述覆蓋部件的溝槽的終端部的設(shè)有氣孔的位置。
這里，前述電極部分與前述電連接部分之間的電阻，最好在10kΩ以下。而在所述覆蓋部件的上述溝槽內(nèi)，特別是在該溝槽的全長(zhǎng)最好設(shè)置卯磷脂層。
所述的反應(yīng)層最好含有親水性高分子。


圖1為本發(fā)明一個(gè)實(shí)施例中的具有用于葡萄糖傳感器的電極系統(tǒng)的基板的平面圖。
圖2為除去了上述傳感器中的反應(yīng)層的分解斜視圖。
發(fā)明的詳細(xì)說(shuō)明以下，參照附圖，詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明的生物傳感器。
圖1為本發(fā)明中的生物傳感器的基板平面圖。圖2為除去了該傳感器中的反應(yīng)層的分解斜視圖。
在這些圖中，1表示由聚對(duì)苯二甲酸乙二醇酯組成的絕緣性基板。在該基板1上，形成由碳組成的工作電極2、對(duì)置電極3及連接各個(gè)電極的引線4、5。這些電極及引線系一次篩網(wǎng)印刷含粘合劑的碳糊同時(shí)形成。對(duì)置電極3大致形成C字狀，工作電極2配設(shè)于大致成C字狀的對(duì)置電極3的凹部?jī)?nèi)。連接于這些電極的引線4及5延伸至基板1的一側(cè)端部，其端部成為測(cè)定儀器的電連接部。
在如上所述形成檢測(cè)電極2、對(duì)置電極3及引線4、5的基板上再由絕緣性糊的印刷形成用于將檢測(cè)電極2及對(duì)置電極3與其引線4、5區(qū)別開(kāi)來(lái)的電氣絕緣層6。借該電絕緣層6限定了工作電極及對(duì)置電極的露出面積。電絕緣部6的內(nèi)緣部可以如圖所示，較好的是，除了工作電極的部分之外，大致呈圓形。
在如此形成了電極系統(tǒng)的基板上形成反應(yīng)層。如下所述，該反應(yīng)層的簡(jiǎn)便形成方法是，將各種試劑溶液滴下至電極系統(tǒng)上之后，進(jìn)行干燥。此時(shí)，碳組成的1電極部分為電絕緣部6所包圍，因此，有利于將反應(yīng)層限定于特定的部分。即，抑制了形成反應(yīng)層的溶液向引線部的擴(kuò)散。由此，可以重現(xiàn)性良好地制得均質(zhì)的反應(yīng)層。
另一方面，組合于該基板1、用于在其與基板之間形成試樣液的喂入通道的覆蓋部件由其上開(kāi)有通向一端的縫隙8的間距塊7、及在對(duì)應(yīng)于間隙8的終端位置設(shè)有氣孔10的蓋子9構(gòu)成。間距塊7及蓋子9由于基板同樣的絕緣材料制成，將所示材料沿圖2所示的點(diǎn)劃線部分對(duì)齊進(jìn)行疊合，制成生物傳感器。
上述生物傳感器在基板1上，在如圖1所示的點(diǎn)線所包圍的部分11上形成試樣液喂入通道。該試樣液通道11系對(duì)應(yīng)于間距塊7的間隙8的通道，延伸至越過(guò)電極系統(tǒng)的部分。使試樣液接觸試樣液喂入通道11的開(kāi)口部，則由于毛細(xì)現(xiàn)象，試樣液經(jīng)試樣液喂入通被吸收至氣孔10的一側(cè)，達(dá)到電極系統(tǒng)上，在那里，與反應(yīng)層的試劑反應(yīng)。
如從圖1所顯見(jiàn)地，在面于試樣液喂入通道的基板上，露出構(gòu)成電極系統(tǒng)的、被限定的工作電極2及對(duì)置電極3，和包圍電極系統(tǒng)的前后的電絕緣層6的一部分。而且，由電絕緣層6與工作電極2區(qū)分的引線4借電絕緣層6與試樣液供給通道11隔離，所以，由試樣液與工作極2的引線4的接觸引起的測(cè)量誤差可以被避免。另外，對(duì)置電極3的引線5的一部分露出于試樣液喂入通道11，這里，即使試樣液發(fā)生接觸，也不會(huì)影響測(cè)定值。
由碳組成的工作電極、對(duì)置電極及其引線部分，在其上如涂布形成電絕緣層用的糊狀物，則可能糊狀物滲入碳層中，會(huì)增大其電阻。因此，理想的是，在碳的印刷層上形成將工作電極及對(duì)置電極與其引線部分區(qū)分開(kāi)的電絕緣層，最好是如圖1所示，形成極為有限的區(qū)域。
在以下的實(shí)施例中，使用羧甲基纖維素作為親水性高分子，但是，形成親水性高分子層的親水性高分子，也可使用各種材料。例如，可以使用羥乙基纖維素、羥丙基纖維素、甲基纖維素、乙基纖維素、乙基羥乙基纖維素、羧甲基乙基纖維素、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇、聚賴氨酸等的聚氨基酸、聚苯乙烯磺酸、明膠及其衍生物、丙烯酸極其鹽、甲基丙烯酸及其鹽、淀粉及其衍生物、馬來(lái)酸酐及其鹽。其中，優(yōu)選的是羧甲基纖維素、羥乙基纖維素、羥丙基纖維素、甲基纖維素、乙基纖維素、乙基羥乙基纖維素、羧甲基乙基纖維素。也可使用如聚賴氨酸等的聚氨基酸、聚乙烯醇、聚苯乙烯磺酸等。
作為含于反應(yīng)層中的氧化還原酶，須根據(jù)測(cè)定對(duì)象的底物而變化。作為氧化還原酶，可以舉出如果糖脫氫酶、葡萄糖氧化酶、醇氧化酶、乳酸氧化酶、膽固醇氧化酶、黃嘌呤氧化酶、氨基酸氧化酶等。
作為上述的電子接受體，可以舉出鐵氰化鉀、對(duì)苯醌、吩嗪甲基硫酸鹽(フェナジンメトサルフェ-ト)、亞甲基藍(lán)、二茂合鐵衍生物等。又，將氧作為電子接受體時(shí)，也可得到傳感器響應(yīng)。電子接受體可以使用上述的一種或二種以上。
上述酶及電子接受體既可以溶解于試樣液中，也可以將反應(yīng)層固定于基板等之上，不使其溶解于試樣液中。在將酶及電子接受體固定于基板等之上時(shí)，反應(yīng)層最好含有上述的親水性高分子。
再有，反應(yīng)層中可以含有pH緩沖劑。作為pH緩沖劑，可以舉出磷酸二氫鉀-磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀-磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉-磷酸氫二鉀、磷酸二氫鈉-磷酸氫二鈉、檸檬酸-磷酸氫二鈉、檸檬酸-磷酸氫二鉀、檸檬酸-檸檬酸三鈉、檸檬酸-檸檬酸三鉀、檸檬酸二氫鉀-氫氧化鈉、檸檬酸二氫鈉-氫氧化鈉、馬來(lái)酸氫鈉-氫氧化鈉、鄰苯二酸氫鉀-氫氧化鈉、琥珀酸-四硼酸鈉、馬來(lái)酸-三(羥甲基)氨基甲烷、三(羥甲基)氨基甲烷-三(羥甲基)氨基甲烷鹽酸鹽、[N-(2-羥乙基)哌嗪-N’-2-乙磺酸]-氫氧化鈉、[N-三(羥甲基)甲基-2-氨基乙磺酸]-氫氧化鈉、[哌嗪-N，N’-雙(2-乙磺酸)]-氫氧化鈉。
實(shí)施例中就碳及絕緣糊的印刷圖案圖示了特定的例子，但圖案并不限于這些。
以下說(shuō)明具體的實(shí)施例。
實(shí)施例1就葡萄糖傳感器作為生物傳感器之一例進(jìn)行說(shuō)明。
葡萄糖傳感器如下所述地制得。
如圖1，在基板1上形成工作電極2、對(duì)置電極3及連接于其上的引線4、5、絕緣層6。
其次，在由工作電極2及對(duì)置電極3組成的電極系統(tǒng)上滴下含有作為酶的GOD、作為電子接受體的鐵氰化鉀的水溶液，使其干燥，形成反應(yīng)層。如圖1所示，由于在電極系統(tǒng)的周圍也配置了電絕緣層6，可以大幅度地抑制滴下的形成反應(yīng)層用的溶液向引線部的擴(kuò)散。
其次，為使向反應(yīng)層供應(yīng)試料液更加順利，使卵磷脂在有機(jī)溶劑中的溶液，例如，卵磷脂的甲苯溶液在反應(yīng)層上擴(kuò)散、干燥，在前述反應(yīng)層上形成以卵磷脂層。接著，在基板1上粘結(jié)蓋子9及間距塊7，制得葡萄糖傳感器。
將葡萄糖水溶液3μl作為試樣液從試樣液喂入通道11的開(kāi)口部送入此傳感器。
在與試樣液的供給的同時(shí)，電極系統(tǒng)上的反應(yīng)層溶解。55秒后，以對(duì)置電極3為基準(zhǔn)，將所定的電壓外加于工作電極2上。測(cè)定其5秒后的電流值。液中的鐵氰化物離子、葡萄糖、GOD發(fā)生反應(yīng)，其結(jié)果，葡萄糖氧化為葡糖酸內(nèi)酯，鐵氰化物離子被還原為亞鐵氰化物離子。作為響應(yīng)得到該氧化該亞鐵氰化物離子的電流。其結(jié)果，得到依存于試樣液中的葡萄糖濃度的電流值。
實(shí)施例2在如實(shí)施例1同樣制得的基板的電極系統(tǒng)上滴下羧甲基纖維素鈉鹽(以下簡(jiǎn)稱CMC)的水溶液，使其干燥，形成CMC層。其次，在所述CMC層上滴下含有作為酶的GOD、作為電子接受體的鐵氰化鉀的水溶液，使其干燥，形成反應(yīng)層。
其次，粘結(jié)間距塊7及蓋子9，使其成為一體，使卵磷脂在有機(jī)溶劑中的溶液，例如卯磷脂的甲苯溶液滴至與由間距塊7的縫隙8所形成的覆蓋部件的溝槽的電極系統(tǒng)相對(duì)應(yīng)的區(qū)域、干燥。這樣形成于覆蓋部件一側(cè)的卵磷脂層有助于使試樣液更加順暢地供給至反應(yīng)層。在將卵磷脂的有機(jī)溶劑溶液直接滴下至反應(yīng)層上時(shí)，其溶液擴(kuò)散至碳的引線部，有時(shí)會(huì)增加電極部-電連接部之間的電阻。但是，如上所述，由在覆蓋部件一側(cè)形成卵磷脂層可以解決這個(gè)課題。
其次，在基板1上粘結(jié)形成了所述卵磷脂層的蓋子及間距塊，使之成一體的覆蓋部件，制得葡萄糖傳感器。
將葡萄糖水溶液3μl作為試樣液從試樣液喂入通道的開(kāi)口部送入此傳感器。在與試樣液供給的同時(shí)，電極系統(tǒng)上的反應(yīng)層溶解。55秒后，以對(duì)置電極3為基準(zhǔn)，將所定的電壓外加于工作電極2上。測(cè)定其5秒后的電流值。其結(jié)果，得到依存于試樣液中的葡萄糖濃度的電流值。
在本實(shí)施例中，由于反應(yīng)層中含有CMC，抑制了電極表面對(duì)酶的吸附，可以得到更好的響應(yīng)特性。
實(shí)施例3除了改變碳層的厚度之外，其它如同實(shí)施例2，制得葡萄糖傳感器。由改變碳層的厚度，分別制得工作極-電連接部之間及對(duì)置電極-電連接部之間的電阻達(dá)5-15kΩ的幾種電極。
如同實(shí)施例2，以傳感器響應(yīng)特性進(jìn)行評(píng)價(jià)。其結(jié)果，在使用所述的電阻值在10kΩ以下的電極時(shí)可以得到良好的傳感器響應(yīng)特性。
如上所述，根據(jù)本發(fā)明提供了一種生物傳感器，所述生物傳感器可以廉價(jià)制得、且可迅速、高精度且簡(jiǎn)便地定量測(cè)試試樣中的特定化合物。
權(quán)利要求
1.一種生物傳感器，所述的生物傳感器由以下各部分構(gòu)成其一端為電極部、另一端為與測(cè)試儀器作電連接的電連接部、形成一對(duì)由碳組成的引線的基板；設(shè)置于上述基板之上、在與基板之間形成從基板端部至上述電極部的試樣液供給通道的溝槽的覆蓋部件；在上述基板上包圍所述電極部分的絕緣層；及具有至少含有氧化還原酶和電子接受體，形成于由前述絕緣層所包圍的電極部上的反應(yīng)層；其特征在于上述電極部的一側(cè)為大致呈C字狀的對(duì)置電極，其另一端電極為位于所述大致呈C字狀的凹部的工作電極，上述溝槽位于從所述基板的端部跨越所述電極部的部分，且，所述絕緣層延伸到設(shè)于所述覆蓋部件溝槽的終端部的空氣孔的位置處。
2.如權(quán)利要求1所述的生物傳感器，其特征在于，所述電極部與所述電連接部之間的電阻在10kΩ以下。
3.如權(quán)利要求1或2所述的生物傳感器，其特征在于，在所述覆蓋部件的溝槽內(nèi)設(shè)置有卯磷脂層。
4.如權(quán)利要求1-3之任一項(xiàng)所述的生物傳感器，其特征在于，所述的反應(yīng)層還含有親水性高分子。
全文摘要
一種廉價(jià)、迅速、高精度地定量分析特定化合物的生物傳感器。該傳感器系在包括測(cè)定電極及對(duì)置電極的電極系統(tǒng)上設(shè)置含有氧化還原酶及電子接受體的反應(yīng)層,用碳形成電極部和引線部,工作電極的一部分引線接觸試樣液,可以防止測(cè)得結(jié)果產(chǎn)生誤差。所述對(duì)置電極大致呈C字狀,其凹部配置于工作電極,周圍設(shè)置絕緣層。基板上配置其上形成有試樣液供給通道的溝槽的覆蓋部件所述絕緣層延伸到覆蓋部件的溝槽終端部的空氣孔位置。
文檔編號(hào)G01N27/327GK1189613SQ9712631
公開(kāi)日1998年8月5日 申請(qǐng)日期1997年12月24日 優(yōu)先權(quán)日1996年12月24日
發(fā)明者池田信, 吉岡俊彥, 南海史朗 申請(qǐng)人:松下電器產(chǎn)業(yè)株式會(huì)社