專利名稱：早幼白細胞的分類計數(shù)法的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及以流式細胞測定法(flowcytometry)進行的白細胞分類計數(shù)法。
在臨床檢驗領(lǐng)域的白細胞分類計數(shù)對于疾病的診斷能夠提供非常有用的情報。在通常和正常情況下，末梢血液中的白細胞有淋巴細胞、單核細胞、嗜酸性粒細胞、嗜堿性粒細胞、中性粒細胞等5種。然而，在種種血液疾病的情況下，可見骨髓細胞、骨髓原始細胞等早幼白細胞。這種早幼白細胞出現(xiàn)的檢出在疾病的診斷上是很重要的。
以前，為了達到此目的，一般都是將血液制成血涂片，在進行適當?shù)娜旧笠贿呌蔑@微鏡觀察一邊進行分類計數(shù)。另一方面，近年來由于流式細胞測定原理的應用，發(fā)展了種種全自動白細胞分類計數(shù)裝置。然而，這些裝置只能對正常白細胞進行高精度的分類計數(shù)，對上述的早幼白細胞不能進行確實的檢出分類。
近年來，應用RF/DC測定原理從而提供了對早幼白細胞出現(xiàn)進行高精度檢出的試劑和方法。(特開平6-273413號)上述公報的方法是利用在特定條件下早幼白細胞比正常白細胞不容易被破壞的性質(zhì)而進行電學測定的。而且它也暗示可以通過散射光信息進行測定。但是，此方法由于是以檢出早幼白細胞為目的，對早幼白細胞的檢出有優(yōu)良的性能；在測定早幼白細胞的同時卻不能對正常白細胞進行分類計數(shù)。正常白細胞的分類計數(shù)必須采取其它方法。
特開平6-20792號中，揭示了使白細胞只產(chǎn)生可通過標記物質(zhì)的損傷的血液分析方法。但是這個方法是對正常白細胞和早幼白細胞造成同樣損傷的分析方法，早幼白細胞和正常白細胞的分離不一定良好。而且以這種方法處理的早幼白細胞對作為標記物質(zhì)的色素有通透性，它不是對早幼白細胞沒有損傷的方法。
本發(fā)明的目的在于提供一種在進行高精度早幼白細胞測定的同時也能進行正常白細胞分類和計數(shù)的方法。
本發(fā)明是按以下程序進行的早幼白細胞的分類計數(shù)法(1)加入溶血劑對血液樣品進行處理，使早幼白細胞保持生存狀態(tài)，而使其它白細胞發(fā)生損傷；(2)用可以將前述損傷白細胞和損傷細胞染色的熒光色素進行染色；然后(3)對上述程序處理的白細胞進行至少1次的散射光和至少1次的熒光測定，根據(jù)其強度差作白細胞的分類計數(shù)。
本發(fā)明所說的白細胞損傷是指使在通常白細胞生存狀態(tài)不能透過細胞膜的色素變得可能透過的操作。在本發(fā)明中，正常白細胞發(fā)生損傷，可以通透色素，另一方面早幼白細胞不發(fā)生損傷，處于不能通透色素的狀態(tài)。
正常的白細胞具有將細胞不需要的物質(zhì)(例如色素)排除在細胞外的物質(zhì)排除機能。
一方面，在特定組成溶血劑對細胞進行作用的情況下，雖然作用機制不明確，但可將特定細胞(例如正常白細胞)的細胞膜脂質(zhì)組成成分部分抽提出來，從而在細胞膜上形成只對特定物質(zhì)有通透性的細孔。其結(jié)果是可使色素分子進入特定細胞內(nèi)進行染色。另一方面，對早幼白細胞來說，不使它產(chǎn)生對色素可能通透的細孔(此狀態(tài)在本發(fā)明中稱為生存狀態(tài))，從而不被色素染色。本發(fā)明所說的早幼白細胞是通常情況下在骨髓存在的而在末梢血液中不存在的未成熟細胞，例如原始細胞、前骨髓細胞、骨髓細胞、后骨髓細胞等。前骨髓細胞、骨髓細胞可統(tǒng)一歸類為幼稚粒細胞。更進一步，原始細胞以前分化階段的骨髓干細胞(CFU-GENM)、中性?！ぞ奘杉毎湫纬杉毎?CFU-GM)、嗜酸性粒細胞集落形成細胞(CFU-EOS)等白細胞系造血前體細胞也包含在本發(fā)明的早幼白細胞范圍內(nèi)。以下述溶血劑和血液樣品進行混合，從而使早幼白細胞不被染色而其它白細胞染色。本發(fā)明所說的血液樣品主要是指末梢血液，但其它如骨髓液、從單采血液成分術(shù)等回收的含血液成分的樣品、腹腔液和尿液等含有白細胞成分的生物樣品等也是適當?shù)臉悠贰?br> 作為本發(fā)明可使用的溶血液，采用含表面活性劑的水溶液、或是用含有以下結(jié)構(gòu)式的聚氧乙烯類非離子表面活性劑的物質(zhì)都是適用的。特開平6-273413號記載的溶血劑也是合適的。上述公報記載的溶血劑含有(1)對早幼白細胞細胞質(zhì)細胞膜進行固定化的聚氧乙烯類非離子表面活性劑；(2)使血細胞細胞膜損傷和縮小化的可溶化劑；(3)對早幼白細胞的細胞質(zhì)及細胞膜進行固定化的氨基酸；以及(4)pH值為5.0～9.0、滲透壓為150～600mOsm/kg、電導為6.0～9.0mS/cm的緩沖液。對于本發(fā)明來說，所進行的是光學測定，不受電導的影響，所以電導不必限定在上述范圍內(nèi)。
上述聚氧乙烯類非離子表面活性劑可以用具以下結(jié)構(gòu)式的物質(zhì)。
R1-R2-(CH2CH2O)n-H(式中R1是碳原子數(shù)10～25的烷基、鏈烯基或炔基；R2是-O-、-φ-p-O-或-COO-；n等于10～40)特別是聚氧乙烯(20)十二烷基醚、聚氧乙烯(15)十六烷基醚、聚氧乙烯(16)十六烷基醚等很適合。
對于聚氧乙烯類非離子表面活性劑的濃度來說，由所用物質(zhì)不同而不同。上述的聚氧乙烯(20)十二烷基醚可以為0.1～2.0g/l(優(yōu)選0.5～1.5g/l)，聚氧乙烯(15)十六烷基醚可以為1～9g/l(優(yōu)選3～7g/l)、聚氧乙烯(16)十六烷基醚可以為5～50g/l(優(yōu)選15～35g/l)。對于聚氧乙烯類非離子表面活性劑來說，如果疏水基團的碳原子數(shù)相同，則n值越小細胞損傷能力越強，n值越大細胞損傷能力越弱。另外，在n值相同的情況下，隨著疏水基團碳原子數(shù)減少細胞損傷能力增加。從這一點上考慮，上述值只是大致標準，可以通過實驗簡單地求出必要的表面活性劑濃度。
另外，上述可溶化劑可以從以下物質(zhì)中選擇?！不?〕(1)如下式的肌氨酸衍生物及其鹽
(式中，R3是碳原子數(shù)10～22的烷基，m為1～5)
(2)如下式的膽酸衍生物
(式中，R為氫原子或羥基)(3)如下式的甲基葡聚糖酰胺
(式中，y為5～7)可溶化劑的優(yōu)選濃度，對于肌氨酸衍生物及其鹽來說為0.2～2.0g/l，對于膽酸衍生物來說為0.1～0.5g/l，對于甲基葡聚糖酰胺來說為1.0～8.0g/l。更具體地說，可使用N-月桂酰肌氨酸鈉、月桂酰甲基-β-丙氨酸鈉、月桂酰肌氨酸、CHAPS(3-〔(3-膽酰氨基丙基)-二甲基銨基〕-1-丙磺酸鹽)、CHAPSOy(3-〔(3-膽酰氨基丙基)二甲基銨基〕-2-羥基-1-丙磺酸鹽)、EMGA8(辛?；?N-甲基葡聚糖酰胺)、MEGA9(壬?；?N-甲基葡聚糖酰胺)、MEGA10(癸?；?N-甲基葡聚糖酰胺)等是很合適的。其它也可用n-辛基-β-葡萄糖甙、蔗糖單癸酸酯以及N-甲酰甲基亮氨酰丙氨酸等，其優(yōu)選濃度為0.01～50.0g/l。
另外，氨基酸可用構(gòu)成蛋白質(zhì)的氨基酸，如谷氨酸、纈氨酸，特別是甲硫氨酸、胱氨酸及半胱氨酸等含硫氨基酸，其中最優(yōu)選甲硫氨酸。氨基酸的使用量范圍可為1～50g/l。用谷氨酸時為8～12g/l合適；用甲硫氨酸時16～20g/l合適。
緩沖液是向HEPES等良好緩沖液或磷酸緩沖液中加入氫氧化鈉等pH調(diào)節(jié)劑調(diào)制而成，在必要的情況下還可加入氯化鈉等滲透壓調(diào)節(jié)劑；優(yōu)選pH為5.0～9.0，滲透壓150～600mOsm/Kg。
對于本發(fā)明的所用色素來說，只對損傷細胞或早幼白細胞任一方進行染色都可以，但最優(yōu)選只對損傷細胞進行染色的色素。作為只對損傷細胞進行染色的色素，生存細胞必須對其有很低的通透性。一般來說，生存細胞的細胞膜外和膜內(nèi)環(huán)境有較大差別。細胞膜對不必要的物質(zhì)不具通透性，具有物質(zhì)選擇的功能。例如，作為細胞膜通透性低的色素可舉錐蟲藍一例。這些色素一般是具有酸性官能團例如羧基、硫酸根等的酸性色素。此色素不對生存細胞染色，而能對細胞膜損傷的細胞進行染色。但是，酸性色素具有對血小板等白細胞以外成分進行染色的傾向，因而不適用于本發(fā)明。為達到本發(fā)明的目的，最好是對白細胞的特有成分進行染色。對作為染色的對象細胞核特別是對DNA有特異性的色素或?qū)NA有特異性的色素是特別適合的。為了達到此目的，有幾種陽離子色素是合適的。
一般情況下陽離子色素可通過生存細胞的細胞膜，使細胞內(nèi)成分染色。但是已知一些特殊的陽離子色素(例如溴化乙啡啶、碘化丙啡啶等)不通過生存細胞，而能通過損傷細胞使之染色。
為達到本發(fā)明的目的，所使用的色素沒有特殊的限定，具體的例子如先前所提過的溴化乙啡啶、碘化丙啡啶，還有Molecular Probes公司銷售的乙啡啶-吖啶雜二聚體、乙啡啶二嗪(ethidium diazide)、乙啡啶同型二聚體-1(ethidium homodimer-1)、乙啡啶同型二聚體-2(ethidium homodimer-2)、乙啡啶單嗪(ethidium monoazide)、TOTO-1、TO-PRO-1、TOTO-3、TO-PRO-3(Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals 5th Edition1992-1994；MOLECOLAR PROBES，INC.1992年記載)等之外，發(fā)現(xiàn)如以下結(jié)構(gòu)式(I)表示的色素可以作為光源為氦一氖、紅色半導體激光時合適的色素
(式中R1為氫原子或低級烷基；R2及R3為氫原子、低級烷基或低級烷氧基；R4為氫原子、?；虻图壨榛?；R5為氫原子、可被取代的低級烷基；Z為硫原子、氧原子或有低級烷基取代的碳原子；n為1或2；X-為陰離子)。
式(I)中R1所示的低級烷基是指碳原子數(shù)為1～6的直鏈或支鏈烷基，例如甲基、乙基、丙基、丁基、異丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、己基等，其中優(yōu)選甲基和乙基。
R2和R3所示的低級烷基意義同上，作為所示的低級烷氧基，指的是碳原子數(shù)為1～6的烷氧基，例如，甲氧基、乙氧基、丙氧基等，其中優(yōu)選甲氧基和乙氧基。另外，更優(yōu)選R2和R3為氫原子。
R4所示?；鶅?yōu)選為脂肪族羧酸衍生的酰基，例如乙?；?、丙?；龋渲袃?yōu)選乙?；?。另外，低級烷基含義同上。
R5所示低級烷基同上所述，所示被取代低級烷基指的是可被1～3個羥基、鹵素原子(氟、氯、溴、碘)取代的低級烷基，其中以一個羥基取代的甲基和乙基為優(yōu)選。
Z所示低級烷基同上所述，Z優(yōu)選硫原子。
X-所示陰離子為鹵素離子(氟、氯、溴、碘離子)、鹵化硼離子(BF4-、BCl4-、BBr4-等)、磷化物離子、鹵酸根離子、氟代硫酸離子、甲磺酸根離子、芳香環(huán)上有鹵素或鹵代烷基取代的四苯基硼化合物離子等；其中優(yōu)選溴離子或BF4-。
上述式(I)中色素的具體例子如以下的色素A、色素B和色素C。對這些色素A、色素B、色素C來說，特開平9-104683號記載了詳細的合成方法。
作為合成方法的一例，式(I)中n＝1的化合物是由式(II)所示的化合物和N，N-二取代甲脒反應所得產(chǎn)物再和式(III)所示的喹啉衍生物反應，最后經(jīng)氟硼酸鈉處理而得。
另外，式(I)所示化合物中，n＝2的化合物是將上述反應中的N，N-雙取代甲脒用比如丙醛酸雙苯基亞胺(malonaldehydebis(phenylimine))鹽等物質(zhì)代替從而反應得到。
還有，前述的MOLECULAR PROBES，INC的手冊中也記載了幾種色素。上述色素只是一些例子，本發(fā)明并不受這些所限制。
在配制測定用樣品時，只要將溶血劑、含色素的溶液以及血液樣品混合就行?；蛘撸瑢⑸赜靡叶嫉人苄杂袡C溶劑溶解后，使用時和溶血劑混合也可以。這樣操作能使色素保持較高的穩(wěn)定性。對于所使用色素相應的合適濃度來說，操作者能很容易地從實驗中求出。例如，用溴化乙啡啶時0.01～100ppm的范圍合適，優(yōu)選0.1～30ppm。
此外，血液樣品和含色素的溶血劑溶液的混合比是1∶10～1∶1000，反應溫度為20～40℃，反應時間為5秒～5分鐘。反應溫度高時可望相應縮短反應時間。
對配制好的樣品進行測定時，可使用如

圖1所示結(jié)構(gòu)的流式細胞計。市售的流式細胞計(例如FACScan，Becton Dickinson公司制)不必作特殊的改良就可以使用。光源可選擇和所使用的熒光色素激發(fā)波長相適應的光源。
對于散射光的檢出來說，前方散射光(小角度或大角度)和側(cè)方散射光都是可以的。
以下通過實施例來說明本發(fā)明，但本發(fā)明范圍并不受這些所限制。實施例1測定用試劑聚氧乙烯(16)十六烷基醚24.0g/lN-月桂酰肌氨酸鈉 1.5g/lDL-甲硫氨酸 20.0g/lHEPES 12.0g/l1N-NaOH 0.3g/lNaCl 4.0g/l色素A 3.0mg/l上述試劑1ml與血液33μl混合，10秒鐘后用流式細胞計測定側(cè)方散射光和紅色熒光(光源紅色半導體激光，波長633nm)。
所得結(jié)果如圖2(A-c)所示。A是正常血液的測定結(jié)果，B是出現(xiàn)早幼粒細胞的血液，C是出現(xiàn)早幼粒細胞和原始細胞的樣品的測定結(jié)果。圖中Lymph表示淋巴細胞，Mono表示單核細胞，Gran表示粒細胞，IG表示早幼粒細胞，Blast表示原始細胞。
圖2的A中白細胞分為淋巴細胞、單核細胞、粒細胞3類。B中除了正常的3類分布區(qū)域外還有早幼粒細胞的分布區(qū)域。C除了正常的3類分布區(qū)域外還有早幼粒細胞和原始細胞的分布區(qū)域。
接下來，將本發(fā)明方法測定的結(jié)果和現(xiàn)有方法的測定結(jié)果進行比較，作出相關(guān)分析?，F(xiàn)有方法是用多功能自動血細胞分析裝置(SE-9000，東亞醫(yī)用電子株式會社)進行測定。
所得結(jié)果如圖3(A～D)所示。淋巴細胞(A)、單核細胞(B)及粒細胞(C)的比例，還有白細胞總數(shù)(WBC，圖3的D所示)中的任一個都可見以前方法和本發(fā)明的方法有良好的相關(guān)性。另外，SE-9000的粒細胞數(shù)是以NEUT(中性粒細胞)+EO(嗜酸性細胞)+BA(嗜堿性粒細胞)而求得。實施例2所用試劑和實施例1中相同，在給與G-CSF之后出現(xiàn)造血前體細胞的檢品用流式細胞計進行側(cè)方散射光和紅色熒光的測定。結(jié)果如圖4所示。確認熒光強度低的區(qū)域，細胞群是早幼白細胞區(qū)域。
此外，還可利用造血前體細胞對CD34反應陽性的性質(zhì)，將造血前體細胞進行分離測定。首先用血液成分分析裝置配制富含單核細胞的樣品；然后，將樣品和結(jié)合有抗CD34單克隆抗體(Beaton DickinsonImmunocytometry System Co.，Ltd公司制)的磁珠(DynabeadsTM；DYNAL及市售的)反應，接著用磁細胞分離器(IsolexTM；Baxter Co.，Ltd.)將CD34反應陽性的造血前體細胞分離。然后用酶(木瓜凝乳蛋白酶)處理將CD34陽性細胞從磁珠上分離下來。
這樣配制的樣品用同樣的試劑，也用流式細胞計測定出側(cè)方散射光和紅色熒光。結(jié)果如圖5所示。同樣可見熒光強度低的區(qū)域的細胞群是早幼白細胞區(qū)域。
本發(fā)明所進行的加溶血劑的處理、對損傷細胞進行染色、以及散射光和熒光的組合測定等使以前方法不可能同時進行的正常白細胞分類計數(shù)和早幼白細胞分類計數(shù)成為可能，從而使白細胞計數(shù)一體化成為可能。
附圖的簡要說明〔圖1〕所示的為本發(fā)明方法使用的流式細胞計概略圖。
〔圖2〕所示的為用本發(fā)明方法測定的結(jié)果。A為正常血液測定結(jié)果，B為出現(xiàn)早幼粒細胞的血液測定結(jié)果，C為出現(xiàn)早幼粒細胞、原始白細胞的樣品的測定結(jié)果。
〔圖3〕所示的為本發(fā)明測定法的結(jié)果和以前方法測定結(jié)果進行比較所得的相關(guān)分析結(jié)果。
〔圖4〕所示的為用本發(fā)明方法對G-CSF給與后出現(xiàn)造血前體細胞的樣品進行測定的結(jié)果。
〔圖5〕所示的為CD34陽性的造血前體細胞分離之后，用本發(fā)明的方法測定而得的結(jié)果。
權(quán)利要求
1.1種早幼白細胞分類計數(shù)法，其特征在于，是按以下程序進行的(1)加入血液學試劑溶血劑對血液樣品進行處理，使早幼白細胞保持生存狀態(tài)，而使其它白細胞損傷。(2)用可以將前述損傷白細胞和損傷細胞染色的熒光色素進行染色；然后(3)對上述程序處理的白細胞進行至少一次的散射光和一次的熒光測定，以其強度差作白細胞分類計數(shù)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1記載的方法，其特征在于，可以在對早幼白細胞分類計數(shù)同時檢測正常白細胞進行，對全體白細胞進行計數(shù)。
3.根據(jù)權(quán)利要求2記載的方法，其特征在于，對正常白細胞至少3種進行分類計數(shù)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1～3任一項記載的方法，其特征在于，所用的溶血劑含有以下成分(1)對早幼白細胞的細胞質(zhì)及細胞膜進行固定的聚氧乙烯類非離子型表面活性劑；(2)對血細胞細胞膜進行損傷及縮小化的可溶化試劑；(3)對早幼白細胞的細胞質(zhì)及細胞膜進行固定化的氨基酸；以及(4)pH5.0～9.0，滲透壓為150～600mOsm/kg的緩沖液。
5.根據(jù)權(quán)利要求1～4任一項記載的方法，其特征在于，熒光色素是從以下組中選擇的(1)如式(I)的化合物
(式中R1為氫原子或低級烷基；R2以及R3為氫原子、低級烷基或低級烷氧基；R4為氫原子、?；虻图壨榛?；R5為氫原子、可被取代的低級烷基；Z為硫原子、氧原子或低級烷基取代的碳原子；n為1或2；X-為陰離子)；(2)溴化乙啡啶、碘化丙啡啶(3)乙啡啶-吖啶雜二聚體(ethidium-acridine heterodimer)、乙啡啶二嗪(ethidium diazide)、乙啡啶同型二聚體-1(ethidiumhomodimer-1)、乙啡啶同型二聚體-2(ethidium homodimer-2)、乙啡定單嗪(ethidium monoazide)、TOTO-1、TO-PRO-1、TOTO-3、TO-PRO-全文摘要
本發(fā)明提供了1種進行高精度早幼白細胞測定的同時也能對正常白細胞進行分類并計數(shù)的方法,是按以下程序進行的早幼白細胞分類計數(shù)法:(1)加入溶血劑對血液樣品進行處理,使早幼的細胞保持生存狀態(tài),而使其它白細胞損傷。(2)用可以將前述損傷白細胞染色的熒光色素進行染色;然后(3)對上述程序處理的白細胞進行至少一次的散射光和一次的熒光測定,以其強度差作白細胞分類計數(shù)。
文檔編號G01N33/52GK1183559SQ9712313
公開日1998年6月3日 申請日期1997年11月19日 優(yōu)先權(quán)日1996年11月20日
發(fā)明者坂田孝, 水上利洋, 中加代 申請人:東亞醫(yī)用電子株式會社