專利名稱：檢查或測量細胞相關性分子總量的方法和裝置的制作方法
本申請是申請日為1992年10月30日的序號為968，793的部分繼續(xù)。
存在大量的細胞相關性分子，包括細胞表面抗原，胞內(nèi)細胞因子，微生物抗原，藥物試劑及其代謝物，和核酸。其中許多細胞相關性抗原涉及對免疫功能較重要的各種細胞對細胞的相互作用和通信。還有一些其它的分子是免疫機能障礙和其它疾病癥狀的重要標記物。特定分子的檢查在對正常及反常情況的分析中可能是有用的。
細胞因子細胞因子是一組較大的各種各樣的生物活性蛋白質(zhì)和多肽，一般具有相當?shù)偷姆肿恿空{(diào)節(jié)眾多的細胞活性。例如，細胞因子調(diào)節(jié)B淋巴細胞的免疫球蛋白產(chǎn)量和各種細胞類型的生物合成活性。白細胞介素—2(IL—2)(最初發(fā)現(xiàn)為一種T細胞生長因子)和其它免疫學活性細胞因子與T細胞功能和各種造血細胞類型的生長及分化相聯(lián)系。
細胞因子一般以非構成方式產(chǎn)生，通常需要可能通過一種細胞表面受體對生產(chǎn)細胞的活化或刺激。盡管許多較好特征化的細胞因子由免疫系統(tǒng)的細胞產(chǎn)生，細胞因子也由范圍較寬的各種細胞類型產(chǎn)生。典型地，一種給定的細胞類型產(chǎn)生一定數(shù)量的不同細胞因子。細胞因子影響大范圍的各種免疫和炎癥反應。其作用以復雜的相互作用網(wǎng)絡來進行，其中一種細胞因子的釋放可能導致一系列的多種生理學反應，有些還歸功于其它細胞因子的誘導。
使用體外培養(yǎng)系統(tǒng)對細胞因子的生產(chǎn)和作用進行了大量的研究。事實上，大多數(shù)細胞因子在血流中不可檢測，即使在免疫應答期間也一樣。因為在免疫應答中細胞因子的活性表現(xiàn)出所設計的在短范圍和短時間間隔內(nèi)作用，它們在非常低的濃度下一般顯示活性。大多數(shù)細胞因子研究根據(jù)在各種生物學測定中對細胞因子生物學活性的測量進行。在免疫試驗，如酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)中測量了血液中的細胞因子水平。然而，當對血清中來源于細胞的細胞因子進行檢查時，這方面的研究受到一些局限，因為它們的濃度較低且在體內(nèi)的半衰期極短。用單克隆抗體以ELISA對血清細胞因子的檢測性受到一些因素的影響，如1)體內(nèi)局部產(chǎn)生的細胞因子迅速被靶細胞受體吸收并可能不會到達血漿；2)細胞因子的半衰期短使取樣時間變得很重要；和3)細胞因子蛋白質(zhì)在樣品貯存期間通常不穩(wěn)定。一般來說，對存在于血清中的分子的免疫試驗對于檢測不能穩(wěn)定貯存的蛋白質(zhì)沒有用處。由于所有上述原因，需要改進檢查和測定血樣中細胞因子的方法。
微生物抗原大多數(shù)成功增殖的微生物中一些在進入身體部位的上皮細胞內(nèi)或在其表面繁殖，導致在上皮內(nèi)傳播感染，接著排出到外表面。例如，通常限定于上皮表面的病毒感染包括流感，副流感，鼻病毒，冠形病毒和乳頭瘤。
在本領域需要一種簡單的，直接的和敏感的方法，通過檢查或測定在上皮細胞，組織或液體樣品中與病毒相關的分子或抗原的總量來檢測侵入上皮中的微生物的存在。
一些較重要的病毒穿過上皮表面后一般形成全身性感染。這些包括細胞內(nèi)的微生物。對于傳播到全身的專性細胞內(nèi)微生物，它們必須先進入血液或淋巴。這意味著它們必須作為一種自由生物體進入上皮下的淋巴腔或血管中，或先進入可動細胞(如白細胞)并由它載入血液或淋巴。感染白細胞的生物體的例子包括麻疹和小痘病毒。這些生物在細胞內(nèi)增殖而能避開細胞內(nèi)的防御機制，如溶酶體降解。
如果能對含有該生物的體液或含該生物的宿主細胞以極微量的處理和加工樣品進行簡單直接和敏感的試驗來檢查和定量各種病原性微生物將有極大的益處。本發(fā)明試圖提供這種試驗方法。
核酸細胞中DNA(脫氧核糖核酸)或RNA(核糖核酸)的總量是某些細胞相關性分子存在的有用標志。而且，DNA或RNA的檢測對于鑒定惡性或惡性前細胞的存在可能是有用的。正常細胞僅含有單拷貝的細胞DNA而惡性細胞常是多倍體。通常用DNA結合染料以流式細胞光度術分析總細胞DNA來測定多倍體。本發(fā)明允許缺乏流式細胞光度計的實驗室以直接試驗檢查多倍體或測量細胞內(nèi)的DNA或RNA總量，因此，提供了一種在細胞樣品中檢查各種成分，和甚至腫瘤細胞的方法。
細胞表面抗原大量分子，包括蛋白質(zhì)、糖蛋白、糖脂，寡聚糖苷，和類似的物質(zhì)在細胞膜表面表達。在細胞表面，或在細胞內(nèi)分室里還能檢測到的是由細胞內(nèi)寄生物(如病毒)產(chǎn)生的分子。細胞表面分子也存在于細胞質(zhì)中。常規(guī)流式細胞光度術試驗檢測或計數(shù)在其表面表達一種給定分子的細胞，這由觀察或測量抗體與細胞上的該分子抗原決定基的結合來實現(xiàn)。熟知的具臨床意義的細胞表面分子包括T細胞受體分子。許多這類分子以它們與特定單克隆抗體的反應來定義。特別地，表達CD4和CD8分子的T細胞之鑒別和計數(shù)已具有重大的臨床實用性。事實上，追蹤CD4＋細胞的循環(huán)水平是評介獲得性免疫缺陷綜合癥(AIDS)進展的關鍵前兆指示劑。
T細胞的兩組主要的分子稱為CD4和CD8。以其調(diào)節(jié)功能，分別為輔助劑/誘導劑和抑制劑/細胞毒素來區(qū)別。CD4分子是一種大約為55千道爾頓的糖蛋白單體，存在于細胞外，橫跨膜和細胞質(zhì)區(qū)域。CD4分子能發(fā)揮傳導細胞內(nèi)信號和調(diào)節(jié)T細胞活化的功能，T細胞的活化導致B細胞信號的產(chǎn)生和經(jīng)細胞因子的釋放誘導CDT細胞產(chǎn)生細胞毒性。另外，CD4可以作為附著分子幫助MHCII級分子或存在于細胞中的抗原與T細胞受體錨著。因此，CD4分子用作輔助T淋巴細胞的表型標記。
一般來說，以細胞表面標記物對人類B和T淋巴細胞群的鑒定可得到正常及病理學狀態(tài)下的免疫狀態(tài)情況。例如，在大于90％的血液B淋巴細胞中發(fā)現(xiàn)細胞表面抗原CD19，CD20和CD21，而CD2和CD3幾乎在全部正常外周血T淋巴細胞中表達。用于細胞介導免疫的T淋巴細胞依賴于其表型，對MHC的受體特異性和細胞功能可進一步分化成兩類細胞群。一般來說，CD4＋CD8－輔助T淋巴細胞包含大約65％的外周T細胞并在與MHCII級分子相聯(lián)系的抗原活化下能分泌細胞因子。另一類細胞群，即CD4－CD8＋細胞毒性淋巴細胞(大約35％的外周T細胞)在由MHC I級提供的抗原活化后能溶融靶細胞。
經(jīng)過對這些各種細胞表面標記物使用單克隆抗體試劑并結合流式細胞光度術方法可監(jiān)測外周血淋巴細胞群中與各種自身免疫和免疫缺陷疾病，白血病和淋巴瘤，以及移植排異相聯(lián)系的成分變化。在AIDS病例中，已發(fā)現(xiàn)CD4分子是人免疫缺陷病毒(HIV)的細胞表面受體并顯示出可監(jiān)測CD4 T淋巴細胞的減少，它是AIDS發(fā)展的特征。
測定淋巴細胞群的早期方法，如以噬斑和細胞介導功能的分析具有高度技術依賴性并且不具有細胞譜系特異性。利用單克性抗體對細胞表面標記物的有效性，以流式細胞光度術對細胞表面CD4的測量擴展了以免疫監(jiān)測對淋巴細胞群鑒定的研究。然而，這一方法需要使用復雜的程序，昂貴的儀器和很高的勞動強度。TRAXTMCD4是一種酶免疫試驗，用它可以全血溶胞產(chǎn)物中鑒定總CD4蛋白質(zhì)。使用這種基于酶免疫試驗(EIA)和是到的結果與以流式細胞光度術測定的CD4T淋巴細胞計數(shù)值相比具有大于88％的相關性。
干燥血跡(DBS)樣品收集介質(zhì)被證實為對流行病學的研究是一種有用的方法。按常規(guī)收集新生兒腳后跟穿刺血樣并顯示出對PKU和甲狀腺機能減退，鐮狀細胞性貧血和其它血紅蛋白病，以及HIV的檢測是有用的。在發(fā)展中國家，成人手指穿刺DBSS提供了一種給公眾取樣并向試驗實驗室運輸穩(wěn)定樣品的方法。然而，這一技術至今來未被運用到對包含在細胞內(nèi)或在細胞表面的細胞相關性分子的鑒定技術中。直到現(xiàn)在，干燥的血液收集方法尚未用于對血液中CD4淋巴細胞的鑒定中。
本發(fā)明提供了測定細胞相關性抗原的方法。在一個實施例中，測定了一個全血樣品中選擇的細胞相關性抗原(例如，CD4)的總量，在一個具體實施方案中，血樣點樣到濾紙上，濾紙干燥后放入含有選擇的稀釋劑和裂解試劑的小瓶中，在選擇的溫度下培養(yǎng)一段選擇的時間。然后從小瓶中回收選擇大小的樣品并在標準試驗(例如免疫測定試驗)中測定。根據(jù)本發(fā)明的方法可測定細胞相關性抗原，如CD4，CD8，CD3，CD19，CD25(IL—2R)，CD2，CD56，CD54(ICA M—1)，細胞內(nèi)病毒、細胞因子和核酸。與血漿部分中的可溶性抗原相反，發(fā)現(xiàn)細胞相關性抗原存在于細胞內(nèi)或在細胞表面。還提供了用于本發(fā)明試驗中的裝置。
本發(fā)明的進一步的實施例提供了對樣品中給定細胞相關性分子陽性細胞之近似數(shù)目的測定。根據(jù)本發(fā)明的之一方面，測定細胞相關性分子的方法可用于計數(shù)表達特定細胞相關性分子的細胞。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)細胞相關性分子總量可以收集在紙上或與細胞數(shù)相關的其它合適的收集裝置上的樣品中回收。根據(jù)本方法，可從樣品得到的細胞相關性分子總量與根據(jù)常規(guī)細胞數(shù)測定方法中得到的測量值表現(xiàn)出線性相關。本發(fā)明的方法優(yōu)于背景技術的方法。
根據(jù)本方法，分析了樣品中選擇的細胞相關性分子(例如CD4)的總量。一種樣品，優(yōu)選血液樣品，更優(yōu)選的是一種全血樣品，被收集到合適的收集材料上(優(yōu)選一種濾紙)。濾紙干燥后回收細胞相關性分子。在優(yōu)選的方法中，經(jīng)將紙或其它合適的收集材料放入含有選擇的回收試劑(例如，稀釋劑和裂解試劑)之小瓶中并在選擇的溫度下培養(yǎng)一段選擇的時間來回收細胞相關性分子。然后從小瓶中回收選擇大小的樣品并在標準試驗(例如免疫測定試驗)中進行測定。以免疫測定對細胞相關性樣品的檢測提供了在樣品中存在的細胞相關性分子總量的信息。根據(jù)本發(fā)明，細胞相關性樣品的量與細胞數(shù)相聯(lián)系。


圖1顯示了在CD4，TRAXTM試驗中干燥的血液極端品與溶胞產(chǎn)物的相關性。CD4干燥的血液樣品值以單位每ml(V/ml)來表示。一單位定義為用1％NP—40溶融的103個Jurkat細胞中發(fā)現(xiàn)的CD4總量。
圖2顯示了在CD4 TRAXTM試驗中干燥的血液樣品與流式細胞光度計測量的相關性。CD4干燥的血液樣品值以單位每ml(V/ml)來表示。一單位定義為用1％NP—40溶融的103個Jurkat細胞中發(fā)現(xiàn)的CD4總量。V/ml向相當?shù)腃D4值的轉換是根據(jù)在V/ml和以流式細胞光度術測定的CD4細胞值之間建立的線型關系來實現(xiàn)的。具有較寬范圍的CD4水平的病人臨床研究數(shù)據(jù)用于產(chǎn)生轉換等式。TRAXTM試驗試劑盒的標準值校正為CD4T淋巴細胞數(shù)，樣品結果直接從標準曲線上讀出并報道為細胞數(shù)/μl。
本發(fā)明指導對樣品中細胞相關性分子(下文稱作“靶分子”)總量的檢查或測量并將該檢查或測量用于檢測，診斷。階段確定，嚴重性鑒定，和疾病及紊亂的治療，以及對表達靶分子的細胞計數(shù)中。本發(fā)明的方法和裝置允許檢查或測量以前用與結合配偶體(如抗體)結合不易檢測的靶分子。
根據(jù)本發(fā)明的方法可檢查或測定可得到結合配偶體的任何靶分子。靶分子可以是內(nèi)源性的(由宿主細胞基因組編碼或由宿主細胞產(chǎn)生的分子)。內(nèi)源性靶分子的例子包括細胞因子，細胞附著分子，表型標記物，活化標記物，和核酸。
靶分子也可以是外源性分子(由非宿主細胞的基因組編碼的或由外源試劑產(chǎn)生的分子)。根據(jù)本發(fā)明可測量的典型外源性靶分子是與微生物病原體相聯(lián)系的分子如病毒抗原。
本發(fā)明試圖提供的靶分子之非限制性例子有蛋白質(zhì)，肽，糖蛋白，糖多肽，糖脂，多聚糖苷，寡聚糖苷，核酸，藥物學試劑及其代謝物，和類似物，或其片段。根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的靶分子是微生物相關性分子。細胞因子，附著分子，藥物學試劑或其代謝物，和類似物。在具體實施方案中，本發(fā)明提供了檢查或測量細胞內(nèi)靶分子總量的方法。在另一實施方案中，靶分子是細胞表面分子。本文所用的“細胞相關性分子”意思是附著于細胞表面或存在于細胞內(nèi)的分子。
依賴于樣品和靶分子的性質(zhì)，靶分子總量的測定可用直接計數(shù)表達靶分子的細胞來代替，并在監(jiān)測對病人的治療學效果，對病人疾病的檢查，診斷或狀態(tài)確定，和預測治療結果或疾病預測和在評價和監(jiān)測病人的免疫狀態(tài)中可能是有用的。
用于本發(fā)明試驗的結合配偶體包括(但不局限于)靶分子的受體和抗體。尤其是不為抗體的結合配偶體包括靶分子的細胞表面受體。
在優(yōu)選的實施方案中，靶分子是抗原，并且靶分子的檢查或測定用靶分子與至少一種抗體的免疫特異性結合方法來實現(xiàn)。帶有可在免疫試驗中檢測或定量的抗原決定簇或抗原決定基的所有抗原都在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
可得到用于本發(fā)明方法之樣品的優(yōu)選實驗對象是脊椎動物，包括但不局限于，哺乳動物，魚類、兩棲類、爬行類、鳥類，有袋動物且最優(yōu)選的是人類。因此，本發(fā)明的方法可運用于人類臨床和獸醫(yī)用途。
本文所用的“樣品”涉及在獲得樣品的內(nèi)環(huán)境中的細胞收集物，即生物學液體，涉及細胞的膜和/或細胞內(nèi)胞質(zhì)成分?？杀粶y量總分子的樣品來自于生物學液體，例如全血，血漿，血清，血細胞，唾液，尿，滑液，胸膜滲出物，腫瘤和組織滲透物，羊水，脊髓液或腦顱液。在另一實施方案中，生物學液體可以是細胞培養(yǎng)液。樣品可包含組織，包括組織液。在優(yōu)選情況下，當樣品是組織樣品時，處理組織使結締組織基質(zhì)破裂，例如用胰蛋白酶消化或勻漿作用來實現(xiàn)。在另一實施方案中，樣品包含來自上述來源的細胞。
在優(yōu)選的實施方案中，樣品包含血液樣品，更優(yōu)選的是全血樣品。全血意思是未分部分離的血液，可經(jīng)針刺收集。
所用的樣品量依賴于靶分子類型的功能及其在制品中的豐度，并能由本領域的普通技術人員不經(jīng)過度的實驗而測定。
本發(fā)明提供的方法。正如下面所作的更詳細的描述，克服了許多背景技術的局限，特別是關于細胞相關性分子的測量和檢查，以前需要進行細胞分離，接著用顯微鏡或流式細胞光度術進行直接或間接免疫熒光分析。
背景技術：
程序的局限包括需要新鮮的樣品，相當大的樣品量，濃縮的細胞群體而不是全組織或血液，大量的制樣時間和昂貴的儀器如流式細胞光度計。本文提供的方法克服了這些局限。令人驚奇的是，本文所述的方法和裝置適于分析新鮮樣品中的各種成分，即，全血，并且樣品體積相當小。即大約20-100μl。因此，樣品收集涉及簡單的技術如手指穿刺。而且樣品較穩(wěn)定，便于以郵寄或其它方式適輸?shù)椒治鲋行奶?，因而避免了對新鮮血液樣品和靜脈切開放血術的需要。
在本發(fā)明的方法步驟中，選擇的液體生物學樣品的量被收集到合適的收集材料上。在一個實施方案中樣品點樣到紙收集裝置上。適合于本發(fā)明內(nèi)容的收集材料包括，但不局限于濾紙。適于本文目的的濾紙是本領域一般已知的和可以商品買到的。各種等級一般可得到并涉及紙的孔隙度，以及其吸收力，密度和其制造材料。
本文所用的“點樣”意思是樣品與(例如)濾紙收集材料接觸并將全部或部分樣品轉移到裝置上。至于濾紙，當樣品被吸入到濾紙的纖維成分中時以吸入來實現(xiàn)這種吸附。
本領域的技術人員可優(yōu)化這些參數(shù)，達到在濾紙的限定區(qū)域內(nèi)樣品分散總體上的均勻性，以便當控出一塊圓片時，從樣品到樣品基質(zhì)上樣品濃度相當均勻。在某些優(yōu)選的實施例中，例如在全血樣品中當白細胞標記物是靶分子時，優(yōu)選的濾紙含100％棉花纖維。在這一方案中，每濾紙點平均吸收血清大約1.4到大約1.7μl，特別優(yōu)選的是大約1.5到大約1.6μl。血清吸收是常規(guī)的吸收力測量，因此可用這一技術鑒定和優(yōu)化吸收力。一般優(yōu)選的吸收時間為大約1分鐘內(nèi)，更優(yōu)選5—30秒。密度可用吸入時間和流動均勻性來測量?？紫抖壬婕拔蘸兔芏?。因為紙的孔大小和孔分布影響前述參數(shù)。在一些實施例中，合成纖維織物，(編織的和非編織的)如聚酯，或GorteXTM可在總體測量效果中提供優(yōu)勢。
適于本目的的樣品量相當小，這就是說優(yōu)選的量范圍從大約150微升到大約10微升，特別優(yōu)選大約80微升到大約40微升。轉移后的樣品可優(yōu)先在室溫條件下干燥，一般變動范圍可從大約18℃到大約29℃，更典型的是大約20℃到大約26℃，或者如果不需要樣品的長期穩(wěn)定性時，在大約30℃到37℃處理一段更短的時間。干燥步驟一般從大約1至4小時。此后，樣品可貯存起來直到用于進一步的分析，或按本文所述可立即進行進一步的處理。干燥樣品可被送到中心試驗機構進行這種進一步的處理，或可在取樣點進行該步驟。
從點樣區(qū)域取出適當量的干燥樣品，與選擇的稀釋劑及裂解試劑接觸一段時間以溶解所述樣品。一般來說， 英寸直徑的圓片攜帶大約12μl樣品，對某些試驗狀態(tài)來說，這可能是合適的樣品大小。而其它試驗需要的量可能更大或更小?？紤]到通過常規(guī)優(yōu)選，本領域的技術人員可以測定其需要。例如，更小的圓片可用于對相當?shù)蜐舛鹊姆治?，即小于大約10-11，而多個圓片(直徑大約5.5mm)可用于更高濃度，即大于大約10-11。“溶解”意思是溶融生物學樣品的固態(tài)部分(即完整細胞)，使靶分子釋放到稀釋劑和溶融試劑中。在優(yōu)選的實施方案中，這一步驟的時間是在室溫下至少大約2小時。合適的稀釋劑包括生理上合適的緩沖液，如磷酸緩沖鹽水，鹽水，Dulbecco培養(yǎng)基，及其類似物。特別優(yōu)選的緩沖液包含磷酸緩沖鹽水，優(yōu)選加入至少一種蛋白質(zhì)，如來源于牛的血清蛋白質(zhì)。合適的溶胞試劑包含至少一種非離子去污劑。其中可提及的非離子去污劑有Triton系列，如Triton X—100，X—114，X—305，X—405；Brij系列，如Brij 35，56，58；Tween系列，如Tween 20，Tween 80。Nonidet P—40(NP40)，和兩性離子去污劑，如CHAPS和CHPSO及其類似物。用于本文所優(yōu)選的是Triton和NP40以相當高的濃度組合。與樣品相聯(lián)系的優(yōu)選濃度范圍分別為大約6—10％和大約4—7％，當白細胞標記物是靶分子時特別優(yōu)選的分別是大約9％和6％(考慮到液體樣品的稀釋因素，所有測量的濃度基礎不是終濃度)。根據(jù)本文的方法，溶解的樣品可進一步加工或貯存至所需的進一步處理，貯存時，優(yōu)選在至少大約-20℃冷藏，更優(yōu)選大約-20℃到至少大約-70℃，特別優(yōu)選至少大約-70℃。
收集選擇量的所說可溶樣品并與至少一種靶分子特異性的結合配偶體接觸以便進行檢測或計數(shù)。這一步驟可用普遍接受的免疫試驗檢測試劑盒和用于這一目的的類似物來進行。作為例子，對于檢測CD4受體的分析，可從T細胞診斷，Inc.，Cambridge，MA(見國際專利申請?zhí)朩O92108981，1992年5月29日公開，由Rittershans，C.提交)得到TRAXTMCD4測定試劑盒，接該試劑盒提供的測定方案用于本目的。也可用其它常規(guī)測定技術或甚至是用于其它細胞表面受體的類似物的以商品形式可獲得的測定試副來實現(xiàn)。
在優(yōu)選的實施方案中，毛細血管或靜脈血樣被收集到濾紙上并干燥。從干燥的血跡中取下適當?shù)拿娣e，例如，從干燥的血中挖出一塊5.5mm(0.25英寸)的圓片，用緩沖的去污劑溶液室溫下從紙片上洗脫至少2小時得到分析樣品。
然后在標準TRAXTMCD4微滴定板ELISA試驗中分析50微升(50μl)洗脫物以測定血樣中的CD4細胞數(shù)。同批內(nèi)和間隔試驗的試驗CVS都不超過8％。試驗靈敏度是大約86—130個細胞/μl，特別是每μl 86個細胞，且與流式細胞光度術的相關性大約為90％。當在4℃下與干燥劑一起貯存時樣品可穩(wěn)定幾個月。去污劑處理后溶解的樣品也可冷凍貯存，例如在-20℃，優(yōu)選在-70℃。這樣帶來的優(yōu)勢是在一次試驗中允許同時份析取自不同時間的多份樣品，因此減少了間隔試驗的變異性。本發(fā)明的方法表明其適用的極廣，流式細胞光度術的范圍卻受到局限。
本發(fā)明的濾紙收集裝置可以適于“野外”收回生物學樣品的分開包裝形式提供。還將提供的是一種容器，便于當紙點樣后滯留樣品，它可幫助容納可能有傳染性的樣品。另外，對實施本發(fā)明有用的剩余試劑可以與濾紙收集裝置聯(lián)合或單獨以試劑盒的形式按常規(guī)提供。本發(fā)明試劑盒的部分必須成分是濃縮的非離子去污劑溶液和以免疫學檢測抗原存在的方法。
試劑盒可包含本領域已知的任何免疫學檢測方法，即多層試驗形式，競爭免疫測定形式，及類似方法。優(yōu)選的免疫學檢測方法是先俘獲細胞相關性分子特異性的抗體，再檢測細胞相關性分子特異性抗體。提供的第一抗體可在固態(tài)支持物上，如玻璃或塑料珠，膜，塑料棒，微孔，玻璃或塑料試管，或本領域已知的用于免疫測定的其它固態(tài)技術物。作為選擇，提供的第一抗體可用于滯后制動。第一抗體和第二抗體可用能重建的凍干制品或以濃縮溶液的形式提供。第二抗體可用標記方法檢測。在優(yōu)選的實施方案中，標記方法是一種酶。
提供的去污劑溶液在容器中，該容器有足夠的容積容納期望以試劑盒進行的一定量試驗所必需的溶液量。優(yōu)選的去污劑溶液含有兩種或多種非離子去污劑。在一個優(yōu)選的實施例中，去污劑溶液包含溶于蒸餾水的9％Triton X—100和6％的N—40。這一特定的去污劑濃度對CD4和CD8的測定都是最佳的。
優(yōu)選的試劑盒包含一種以溶液或可恢復的凍干品形式的細胞相關性分子標準品。更優(yōu)選的試劑盒包含一種含有已知數(shù)目的目標分子陽性細胞的標準品。因此，未知樣品中細胞相關性分子活性的測定可直接與已知樣品進行比較，由此計數(shù)未知樣品中對該分子呈陽性的細胞數(shù)。
根據(jù)本發(fā)明，樣品中對白細胞標記物呈陽性的細胞數(shù)可用下面方法測定(1)根據(jù)本發(fā)明的方法測定樣品中細胞相關性分子總量，和(2)從細胞相關性分子總量計算對細胞相關性分子呈陽性的細胞總數(shù)。在一個實施方案中，可用細胞相關性分子總數(shù)對細胞相關性分子陽性細胞總數(shù)的標準曲線得到一個公式，細胞相關性分子總量列入公式中。
當?shù)诙贵w經(jīng)附著到抗體標記物上可檢測時，試劑盒還可包含一種與標記物發(fā)生反應的試劑。例如，當標記物是一種酶時，試劑盒能提供酶底物。試劑盒還能提供一種稀釋緩沖液為達到終濃度，它可用于對高濃度的稀釋或?qū)Ω稍飿悠返闹亟ā?br> 在另一實施方案中，試劑盒提供對超過1種分子的免疫學檢測方法。在優(yōu)選的實施方案中，試劑盒包含對CD4和CD8抗原的免疫學檢測方法。
本發(fā)明用下面非限制性的實施例來作進一步的說明。
實施例1試驗方案皮膚穿刺或手指刺扎后，全血點樣到Schleicher andSchuell，Inc.(Keene，NH)903級濾紙上。環(huán)形標記內(nèi)充滿了大約60μl血液。紙片在室溫下干燥大約2小時并立即使用或與干燥劑一起在大約4℃下貯存于密封的容器中。
從干燥的血跡上挖下0.25英寸的圓片并放入12×75mm的玻璃管中，加入100μl洗脫緩沖液。洗脫緩沖液是6∶1的TRAXTMCD4樣品稀釋劑(T細胞診斷公司；Cam-bridge，MA)溶液和TRAXTMCD4溶胞試劑(T細胞診斷；Inc；Cambridge，MA)，例如1.0ml樣品稀釋劑(含有牛血清蛋白質(zhì)或thimerosal的緩沖溶液)加入0.2ml溶胞試劑(6％Nonidet P—40(NP—40)和9％Triton X—100溶于1XPBSK)。然后蓋上玻璃管并放在一搖動器上以200rpm室溫下處理至少2小時。結束后，用吸管尖端小心擠壓圓片并混勻溶液，然后從玻璃管中取出50μl。按照TRAXTMCD4試驗試劑盒說明(T細胞診斷公司；Cambridge，MA)的方案將50μl樣品加入到標準TRAXTMCD4試驗中。
實施例2 TRAXTMCD4試驗TRAXTMCD4試驗是用于定量測定總CD4蛋白質(zhì)和用于人血CD4淋巴細胞計數(shù)的多層EIA。使用本試驗得到的結果被證實與用流式細胞光度術結合血液學資料測定的絕對CD4T淋巴細胞數(shù)相對應。對全血樣品的簡單預處理使CD4蛋白質(zhì)從淋巴細胞中釋放出來，然后樣品可用EIA進行分析和/或貯存于-20℃到-70℃以備以后的試驗。試驗在微滴定孔中進行。該孔預先用人CD4蛋白質(zhì)的單克隆抗體覆蓋。在加入標準品，對照或樣品后，與辣根過氧化物酶結合的第二抗CD4單克隆抗體吸入到孔中。存在于標準品，對照或樣品中的可溶CD4蛋白質(zhì)與覆蓋在板上的抗體結合，而結合的抗體與CD4分子上的第二抗原決定基結合完成多層試驗，培養(yǎng)一段時間后，徹底洗滌各孔去掉未反應的成分并加入酶特異性色素溶液。再培養(yǎng)一段短時間后，終止反應并在490mm下測定吸光率。終點的顏色結果與存在的CD4蛋白質(zhì)總量直接成比例并與原始樣品中CD4 T淋巴細胞數(shù)相對應。用標準品制備標準曲線，對照和樣品值從標準曲線中測定并以細胞/μl來表示。
實施例3 CD4 TRAXTM紙圓片試驗—抑制和回收5份新鮮全血樣品被收集到EDTA中每樣品的一半體積中CD4被耗盡。測量時，用它稀釋剩余的一半樣品，以便造成已知量的CD4增加。以4種不同的濃度進行增加。根據(jù)實施例1所述的程序?qū)⑺鼈兣c高值樣品(純凈樣)和耗盡部分的樣品一起點樣到S&S 903濾紙上。所進行的稀釋覆蓋了標準曲線的范圍。按照上面實施例所述的程序進行試驗。根據(jù)回收的量除以增加的量(從純凈樣和耗盡值測定)計算回收率。結果如表1所示。在標準曲線范圍內(nèi)加入已知量的CD4到5個不同的新鮮全血吸附樣品中后回收率平均為98％。
表1
實施例4 CD4 TRAXTM紙圓片試驗—直線性11份新鮮全血樣品被收集到EDTA中并根據(jù)實施例1所述的程序點樣到S&S 903濾紙上。每份樣品保留一部分用于流程測定和用于溶胞產(chǎn)物制備。對點樣物進行的稀釋覆蓋了標準曲線的范圍。根據(jù)實施例1和2所述的程序進行試驗。根據(jù)純凈樣值計算回收率。結果如表2所示。在標準曲線范圍內(nèi)對11份新鮮全血點樣樣品平行稀釋后的回收率平均為112％。
表2
實施例5 CD4 TRAXTM紙圓片試驗—同批內(nèi)試驗的精確性在一個試驗中，以一式三份測定10份樣品，(即，每份樣品測3個點樣點)。結果如表3所示，一式3份(點樣點)的上述10份樣品的平均相關值(CV)是4.1％。
表3
實施例6 CD4 TRAXTM紙圓片試驗—間隔試驗的變異性測定4份樣品以研究間隔試驗的變異性，結果如表4所示。
表4
>按下面測定平均CV為5.9樣品n 平均值SD CV99719106.2 7.47.09982076.3 5.57.21000 1996.1 3.84.01001 1877.6 4.15.3實施例7 CD4 TRAXTM紙圓片試驗—干燥血液樣品與溶胞產(chǎn)物的相關性測定了干燥血液樣品與溶胞產(chǎn)物的相關性。結果如表5和圖1所示。
表5
實施例8 CD4 TRAXTM紙圓片試驗—干燥的血液吸附點與流式細胞光度術的相關性測定了干燥的血液樣品結果與用流式細胞光度術所得結果之間的相關性。結果如表6和圖2所示。
表6
所發(fā)現(xiàn)的相關性為0.93，如圖2所示。
權利要求
1.一種檢查或測定來自實驗對象的樣品中細胞相關性分子總量的方法，包括如下步驟(a)將來自實驗對象的選擇量的液體生物學樣品點樣到濾紙收集裝置上；(b)將濾紙收集裝置與選擇的稀釋劑和溶胞試劑在選定的溫度下接觸給定的時間以產(chǎn)生可溶的樣品；(c)回收選定量的所說的可溶樣品；(d)在允許發(fā)生特異性結合的條件下將所說的可溶樣品與至少一種細胞相關性分子特異性的結合配偶體接觸；和(e)檢查或測定樣品成份與所說的至少一種結合配偶體發(fā)生的特異性結合的量，其中，檢查或特異性結合的量顯示了樣品中細胞相關性分子的存在或含量。
2.權利要求1的方法，其中所說的細胞相關性分子選自由CD4，CD8，CD3，CD19，CD25，CD2，CD56和CD54所組成的組。
3.權利要求2的方法，其中所說的細胞相關性分子是CD4。
4.權利要求1的方法，其中所說的細胞相關性分子包含細胞因子。
5.權利要求1的方法，其中所說的細胞相關性分子是一種細胞內(nèi)病毒抗原。
6.權利要求1的方法，其中所說的細胞相關性分子包含核酸。
7.權利要求1的方法，其中所說的細胞相關性分子包含一種藥物學試劑或其代謝物。
8.權利要求1的方法，其中所說的選定的稀釋劑包含一種緩沖液和溶胞試劑。
9.權利要求1的方法，其中所說的選定的緩沖溶胞試劑包含一種非離子去污劑。
10.權利要求9的方法，其中所說的非離子去污包含Triton X—100和Nonidet P—40。
11.權利要求1的方法，其中濾紙收集裝置與稀釋劑和溶胞試劑在大約室溫下至少接觸2小時。
12.權利要求1的方法，其中所說的選定的可溶樣品量50μl。
13.權利要求1的方法，其中將血液點樣到收集裝置上包含將血樣收集到濾紙上并使它干燥以產(chǎn)生干燥的血斑。
14.權利要求13的方法，其中取出0.25英寸直徑的干燥血斑部分。
15.權利要求13的方法，其中在(b)步驟中將所說的0.25英寸直徑部分接著與稀釋劑和溶胞試劑接觸。
16.權利要求1的方法，其中所說的濾紙收集裝置包含在其上有圓形標記的903級濾紙。
17.權利要求16的方法，其中所說的圓形標記內(nèi)可容納大約60μl血液。滲透物，脊髓液，滑液和血液組成的組。
19.一種計數(shù)樣品中細胞相關性分子陽性的細胞之近似數(shù)量的方法，包含(a)根據(jù)權利要求1—3和11—17的方法測定細胞相關性分子總量和(b)從(a)步中測定的細胞相關性分子總量計算細胞相關性分子陽性細胞的近似數(shù)目。
20.權利要求17的方法，包含下面步驟(a)將來自實驗對象的選定量的液體生物學樣品點樣到濾紙收集裝置上；(b)將濾紙收集裝置與選定的稀釋劑和溶胞試劑在選定的溫度下接觸一段選定的時間以產(chǎn)生可溶樣品；(c)回收選擇量的所說可溶樣品；(d)在允許發(fā)生特異性結合的條件下將所說的可溶樣品與至少一種細胞相關性分子特異性的結合配偶體接觸；(e)檢查或測定樣品成份與所說的至少一種結合配偶體發(fā)生特異性結合的量，其中檢查或特異性結合的總量顯示了樣品中細胞相關性分子的存在或含量；和(f)根據(jù)樣品中細胞相關性分子總量計算近似細胞數(shù)。
21.權利要求20的方法，其中的生物學樣品包含全血。
22.權利要求21的方法，其中的細胞相關性分子是CD4。
23.一種用于計數(shù)細胞相關性分子陽性細胞近似數(shù)的試劑盒，包含(a)紙收集裝置；(b)去污劑；和(c)免疫學檢測方法。
全文摘要
本發(fā)明涉及檢查或測量生物學液體樣品中細胞相關性分子總量的方法和裝置?？杀粰z查或測量的細胞相關性分子包括(但不局限于)細胞表面抗原，細胞內(nèi)的細胞因子，微生物抗原藥物學試劑或其代謝物，和核酸。在優(yōu)選的實施例中，全血樣品被收集到濾紙上并干燥。從干燥的血跡上挖出一塊圓片，用緩沖的，相當高濃度的去污劑溶液從紙片上洗脫出感興趣的物質(zhì)進行分析。然后在標準試驗(如免疫試驗)中測定洗脫物。
文檔編號G01N33/543GK1122614SQ94192039
公開日1996年5月15日 申請日期1994年5月11日 優(yōu)先權日1993年5月14日
發(fā)明者喬治·H·帕森, 約翰·A·瑪格麗特, 魯格·E·阿瑟 申請人:T細胞診斷公司