評(píng)價(jià)內(nèi)體運(yùn)輸?shù)臏y(cè)定的制作方法
【專利說(shuō)明】評(píng)價(jià)內(nèi)體運(yùn)輸?shù)臏y(cè)定
[0001] 本發(fā)明設(shè)及用于評(píng)價(jià)分子遞送到真核細(xì)胞內(nèi)的效率的測(cè)定和相應(yīng)試劑盒。
[0002] 任何潛在治療分子發(fā)揮功效的關(guān)鍵要求是其必須能夠表現(xiàn)出良好的效能。本發(fā)明 設(shè)及經(jīng)由熟知的內(nèi)吞過(guò)程進(jìn)入真核細(xì)胞胞質(zhì)的分子。鑒于此，重要的是理解該細(xì)胞進(jìn)入模 式所設(shè)及的步驟。因而，為了幫助例示與該細(xì)胞進(jìn)入模式相關(guān)的關(guān)鍵步驟，可參考圖1。在 步驟1中，分子與細(xì)胞表面上存在的結(jié)合位點(diǎn)（例如受體或接受體）結(jié)合。在步驟2中，受 體（加上結(jié)合的分子）變成內(nèi)化到細(xì)胞中-該步驟通稱為"內(nèi)吞"或"內(nèi)體形成"。在步驟 3中，在內(nèi)化之后，分子插入內(nèi)體膜，并實(shí)現(xiàn)所述分子（或其一部分）從內(nèi)體內(nèi)、穿過(guò)內(nèi)體膜 和進(jìn)入真核細(xì)胞胞質(zhì)的釋放。一旦在胞質(zhì)中（步驟4)，所述分子能夠作用于其胞內(nèi)祀（例 如抑制祀分子，如蛋白水解切割細(xì)胞祀蛋白）。
[0003] 因此良好效能測(cè)試有賴于準(zhǔn)確評(píng)價(jià)一個(gè)或多個(gè)上述步驟。
[0004] 迄今為止，對(duì)能夠經(jīng)由"受體介導(dǎo)的內(nèi)吞"進(jìn)入真核細(xì)胞的分子的效能測(cè)試集中在 毒性分子如梭菌神經(jīng)毒素。舉例而言，W下測(cè)定已被用于市售的梭菌神經(jīng)毒素（例如肉毒 桿菌神經(jīng)毒素，其市售名諸如Dysport?，Neurobloc?和Botox?)。
[0005] 小鼠LDg。測(cè)定是目前唯一經(jīng)抑A批準(zhǔn)用于發(fā)布肉毒桿菌毒素的測(cè)定。該測(cè)定同時(shí) 測(cè)試肉毒桿菌神經(jīng)毒素的所有=個(gè)結(jié)構(gòu)域的作用（即結(jié)合、易位和蛋白酶）。更具體而言， 其限定該毒素在限定時(shí)間點(diǎn)（通常在給藥后2-4天）的半數(shù)致死腹膜內(nèi)劑量（活性W小鼠 LDg。單位表示）。然而令人遺憾的是，LD5。測(cè)定使用大量動(dòng)物。而且，LD5。單位不是絕對(duì)測(cè) 量值，因?yàn)槠洳皇巧飳W(xué)常數(shù)-由此其高度取決于測(cè)定條件。特別是，伴隨該測(cè)定的誤差在 不同測(cè)試設(shè)施間可W高至 60%(Sesardicetal.2003 巧iologicals31(4):265-276)。
[0006] 小鼠弛緩性麻搏測(cè)定，也稱為"小鼠腹下垂測(cè)定"，將肉毒桿菌毒素的活性與將毒 素皮下注射到小鼠左腹股溝下肢區(qū)域后看到的腹部凸出程度相關(guān)聯(lián)-麻搏大小程度是劑 量依賴性的。該方法被提出作為小鼠LDg。測(cè)試的改進(jìn)，因?yàn)槠浣⒃谌说赖慕K點(diǎn)上。該測(cè) 定比LDg。測(cè)定更敏感約10倍，使用亞致死劑量的毒素，且比LDW測(cè)試更迅速-其在24-48 小時(shí)提供結(jié)果，相比于典型LDg。測(cè)定的72-96小時(shí)。來(lái)自該測(cè)定的結(jié)果顯示出與LDW值優(yōu) 異的一致性（Sesardicetal.，1996)。盡管該測(cè)定使用LD日。測(cè)定中所用動(dòng)物的20%，其仍 然必需使用動(dòng)物。
[0007] 諸如小鼠/大鼠隔神經(jīng)半隔測(cè)定（其基于使用離體神經(jīng)肌肉制備物）的測(cè)定將 肉毒桿菌神經(jīng)毒素的活性與將其應(yīng)用于維持培養(yǎng)基后所述制備物抽動(dòng)反應(yīng)幅度的下降相 關(guān)聯(lián)。該測(cè)定的通常終點(diǎn)是觀察到幅度下降50%前所需的時(shí)間。但是遺憾的是，半隔測(cè)定 (象LDg。測(cè)定）導(dǎo)致使用大量動(dòng)物。此外，該測(cè)定需要培訓(xùn)過(guò)使用復(fù)雜且昂貴設(shè)備的高技 能人員。
[000引使用培養(yǎng)脊髓神經(jīng)元的底物切割測(cè)定將肉毒桿菌神經(jīng)毒素的活性與對(duì)所述神經(jīng) 元中存在的特異性蛋白質(zhì)的切割相關(guān)聯(lián)。盡管該測(cè)定比體內(nèi)江町。，小鼠弛緩性麻搏）和離 體測(cè)定（半隔）使用較少的動(dòng)物，所述測(cè)定需要高技能人員來(lái)進(jìn)行解剖和培養(yǎng)-解剖和培 養(yǎng)技術(shù)是耗時(shí)的且必須在需要進(jìn)行前~3周計(jì)劃。另一個(gè)缺陷是底物切割測(cè)量值可W是高 度可變的。
[0009] 所有上述測(cè)定都具有特定的缺點(diǎn)，尤其是動(dòng)物福祉問(wèn)題和/或限制于測(cè)試與神經(jīng) 肌肉接頭（NMJ)結(jié)合的分子-后者是天然梭菌神經(jīng)毒素結(jié)合的祀細(xì)胞。
[0010] W095/33850描述了一種無(wú)細(xì)胞底物切割測(cè)定，其中通過(guò)表位特異性抗體來(lái)檢測(cè)切 割產(chǎn)物。由于所述抗體能夠區(qū)分經(jīng)切割的底物和未切割底物蛋白，有可能定量梭菌神經(jīng)毒 素的效能。盡管該測(cè)定沒(méi)有上述動(dòng)物福祉或NMJ特異性不足，其實(shí)際上是"無(wú)細(xì)胞"測(cè)定且 由此僅僅能夠評(píng)價(jià)在蛋白質(zhì)切割方面的效力。相應(yīng)地，W095/33850不能評(píng)價(jià)在任何一個(gè)或 多個(gè)同等重要的步驟方面的效能，尤其是；細(xì)胞結(jié)合；內(nèi)體形成；或穿過(guò)內(nèi)體膜易位。換言 之，（根據(jù)W095/33850)鑒別為有效的底物切割分子的分子可能具有極少或沒(méi)有有用的治 療效能-例如由于其缺乏W下任何一種或多種；最佳的細(xì)胞結(jié)合；最佳的內(nèi)體形成；和/或 最佳的易位功能。
[0011] 因此本領(lǐng)域需要替代和/或改進(jìn)的效能測(cè)定，其解決一個(gè)或多個(gè)上述問(wèn)題。例如， 需要解決現(xiàn)存的動(dòng)物福祉問(wèn)題的人道性測(cè)定。類似地，不限于測(cè)試特異性結(jié)合NMJ和/或 神經(jīng)元細(xì)胞的分子的測(cè)定。類似地，需要提供可靠的分子效能結(jié)果的測(cè)定，特別是提供反映 體內(nèi)效能的效能結(jié)果的測(cè)定。
[0012] 本發(fā)明通過(guò)提供一種測(cè)定解決了上述問(wèn)題，其包括：
[0013] i)使真核細(xì)胞與有待評(píng)價(jià)內(nèi)體釋放能力的測(cè)試分子接觸，其中所述真核細(xì)胞包含 細(xì)胞膜，其包括存在于所述細(xì)胞細(xì)胞膜外表面上的結(jié)合位點(diǎn)；
[0014] ii)使測(cè)試分子與所述真核細(xì)胞溫育，并由此允許
[0015] a)測(cè)試分子與存在于真核細(xì)胞上的結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合并形成結(jié)合復(fù)合物，從而允許所 述結(jié)合復(fù)合物通過(guò)內(nèi)吞進(jìn)入真核細(xì)胞；
[0016] b) -個(gè)或多個(gè)內(nèi)體在所述細(xì)胞之內(nèi)形成，其中所述一個(gè)或多個(gè)內(nèi)體含有測(cè)試分 子；和
[0017] C)所述測(cè)試分子通過(guò)穿越所述一個(gè)或多個(gè)內(nèi)體的內(nèi)體膜進(jìn)入所述真核細(xì)胞的胞 質(zhì)；
[0018] iii)除去未與存在于真核細(xì)胞上的結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合的過(guò)量測(cè)試分子；
[0019] iv)在預(yù)定時(shí)間段后，檢測(cè)存在于所述一個(gè)或多個(gè)內(nèi)體中的測(cè)試分子的量，或者檢 測(cè)存在于所述真核細(xì)胞的胞質(zhì)中的測(cè)試分子的量；
[0020] V)將步驟iv)中檢測(cè)到的測(cè)試分子的量與對(duì)照值相比較，其中所述對(duì)照值代表在 步驟iv)之前存在于所述一個(gè)或多個(gè)內(nèi)體中的測(cè)試分子的量或存在于胞質(zhì)中的測(cè)試分子 的量；
[0021] Vi)通過(guò)確定存在于所述一個(gè)或多個(gè)內(nèi)體之中的測(cè)試分子的量的相對(duì)變化，或者 通過(guò)確定存在于所述真核細(xì)胞胞質(zhì)中的測(cè)試分子的量的相對(duì)變化，計(jì)算測(cè)試分子的內(nèi)體釋 放值。
[0022] 所述真核細(xì)胞可選自酵母細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞、脊椎動(dòng)物細(xì)胞、哺乳動(dòng)物細(xì)胞、植物細(xì) 胞和真菌細(xì)胞。該類動(dòng)物細(xì)胞的實(shí)例包括人類、曬齒類、小鼠和倉(cāng)鼠細(xì)胞。
[0023] 在一個(gè)實(shí)施方案中，所述真核細(xì)胞結(jié)合位點(diǎn)能夠?qū)崿F(xiàn)受體介導(dǎo)的內(nèi)吞或者非受 體介導(dǎo)的內(nèi)吞。所述結(jié)合位點(diǎn)可W是受體或接受體。經(jīng)由非受體結(jié)合位點(diǎn)內(nèi)吞的膚序列 的實(shí)例包括具有富含精氨酸的序列（例如RRRRRRRR，RRRRRRRW)的膚，和諸如W下的膚： PHLIP,P巧-1，SAPE,PFVYLI,和KaposiFGF衍生AAVALIPAVILALLAP。該些膚據(jù)信經(jīng)由非特 異性離子相互作用被內(nèi)吞如細(xì)胞。所述結(jié)合位點(diǎn)可w是在真核細(xì)胞細(xì)胞表面上天然存在的 結(jié)合位點(diǎn)?；蛘撸婧思?xì)胞可W是經(jīng)修飾W表達(dá)不會(huì)天然存在于所述真核細(xì)胞細(xì)胞表面上 的結(jié)合位點(diǎn)的重組真核細(xì)胞。
[0024] 溫育步驟U)可^進(jìn)行任意給定時(shí)間段，例如從5分鐘到5天的時(shí)間段。典型的 時(shí)間段是1-12小時(shí)，例如2-10小時(shí)，4-8小時(shí)，或6-8小時(shí)。在此期間，真核細(xì)胞（即細(xì)胞 膜的外表面）暴露于測(cè)試分子（典型地是過(guò)量的測(cè)試分子），結(jié)果實(shí)現(xiàn)"穩(wěn)態(tài)"，其中測(cè)試分 子W大致相同的速率進(jìn)入并離開(kāi)胞內(nèi)的內(nèi)體。該一時(shí)間點(diǎn)代表進(jìn)行步驟iii和/或iv)的 最佳時(shí)間點(diǎn)。
[0025] 步驟iii)設(shè)及減少或去除真核細(xì)胞外的測(cè)試分子來(lái)源，從而減少進(jìn)入細(xì)胞的測(cè) 試分子的量（或?qū)嵸|(zhì)上防止測(cè)試分子進(jìn)入細(xì)胞）。所述進(jìn)入真核細(xì)胞的測(cè)試分子的量的減 少繼而提供進(jìn)入內(nèi)體的測(cè)試分子的量的改變，其繼而導(dǎo)致離開(kāi)內(nèi)體和/或進(jìn)入真核細(xì)胞胞 質(zhì)的測(cè)試分子的量（或速率）的改變。正是離開(kāi)內(nèi)體結(jié)構(gòu)的測(cè)試分子的量（或速率）提供 了本發(fā)明測(cè)定的基礎(chǔ)-所述測(cè)試分子離開(kāi)內(nèi)體結(jié)構(gòu)的量（或速率）可W通過(guò)存在于內(nèi)體中 的測(cè)試分子的量的變化和/或通過(guò)存在于胞質(zhì)中的測(cè)試分子的量的變化來(lái)衡量。當(dāng)測(cè)量存 在于內(nèi)體中的測(cè)試分子的量時(shí)，通常觀察到存在的測(cè)試分子的量的減少。當(dāng)測(cè)量存在于胞 質(zhì)中的測(cè)試分子的量時(shí)，可觀察到存在于胞質(zhì)之中的測(cè)試分子的量的增加或減少。舉例而 言，當(dāng)在建立測(cè)試分子的穩(wěn)態(tài)內(nèi)體運(yùn)輸之前啟動(dòng)步驟iii)時(shí)，可觀察到胞質(zhì)中的測(cè)試分子 的量的增加。或者，當(dāng)測(cè)試分子從真核細(xì)胞的細(xì)胞分泌速率超過(guò)測(cè)試分子內(nèi)體運(yùn)輸從內(nèi)體 進(jìn)入胞質(zhì)中的速率時(shí)，可觀察到胞質(zhì)中的測(cè)試分子的量的減少。
[0026] 測(cè)定中所用的真核細(xì)胞可固定在表面上。細(xì)胞的固定可作為測(cè)定前步驟進(jìn)行（即 預(yù)固定），或者可W作為測(cè)定規(guī)程的一部分來(lái)進(jìn)行。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，對(duì)測(cè)定的細(xì)胞 進(jìn)行預(yù)固定。