專利名稱：病原相關(guān)分子模式免疫檢測(cè)芯片及其制備方法與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)，具體涉及一種用于檢測(cè)病原相關(guān)分子模 ζ (pathogen-associated molecular pattern, PAMP) % ζ iK 另ll 受{φ (pattern recognition receptor, PRR)相互作用的免疫檢測(cè)芯片或微陣列、制備方法及其應(yīng)用，其屬 于免疫學(xué)、病原微生物學(xué)及生物芯片技術(shù)交叉領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
免疫識(shí)別是生物機(jī)體對(duì)外源物質(zhì)發(fā)生免疫應(yīng)答、實(shí)現(xiàn)有效防御的基礎(chǔ)，是固有免 疫反應(yīng)中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。宿主通過(guò)模式識(shí)別受體(pattern recognition receptor, PRR)介 導(dǎo)并完成免疫識(shí)別作用，其識(shí)別的靶分子是與病原微生物致病或生存相關(guān)的病原相關(guān)分 子模式(pathogen-associated molecular pattern, PAMP)。 PAMP 主要包括細(xì)菌的月旨多 糖(lipopolysaccharides，LPS)、肽聚糖(ρ印tidoglycan，PGN)、脂磷壁酸(lipoteichoic acids，LTA)、CpG脫氧寡核苷酸(CpG 0DN)，真菌的葡聚糖(glucan)、甘露聚糖(mannan)和 病毒的雙鏈RNA(dsRNA)等。探明PRR與PAMP之間的相互作用是研究免疫識(shí)別分子機(jī)制的 基礎(chǔ)與先決條件，而多數(shù)PRR均具有PAMP結(jié)合的廣譜性，這給研究PRR與PAMP相互作用制 造了難題。鑒于免疫識(shí)別過(guò)程的重要性和PRR與PAMP結(jié)合的廣譜性，快速高通量的結(jié)合檢測(cè) 技術(shù)已成為各國(guó)學(xué)者研究的焦點(diǎn)之一。目前，常用檢測(cè)技術(shù)有SDS-PAGE法，生物大分子相 互作用儀檢測(cè)法，酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)法等?；赟DS-PAGE的檢測(cè)方法直觀，但其通量低，且 只適用于不溶性的PAMP ；生物大分子相互作用儀檢測(cè)法靈敏度高，操作簡(jiǎn)便，但需配備昂 貴的生物大分子相互作用儀，不易實(shí)現(xiàn)；酶聯(lián)免疫吸附法是目前常用的檢測(cè)方法，但存在結(jié) 果不直觀，易產(chǎn)生假陽(yáng)性的缺點(diǎn)。這些檢測(cè)技術(shù)局限性大，效率低，耗時(shí)長(zhǎng)，實(shí)用性差。因此， 建立一種快速、準(zhǔn)確、高通量的PRR與PAMP結(jié)合檢測(cè)技術(shù)，已成為免疫識(shí)別領(lǐng)域中急需解決 的問(wèn)題。而新發(fā)展起來(lái)的生物芯片技術(shù)為其提供了強(qiáng)有力的技術(shù)平臺(tái)，多樣品檢驗(yàn)并行處 理的病原相關(guān)分子模式免疫檢測(cè)芯片，在PRR和PAMP相互作用，及藥物開(kāi)發(fā)中生物大分子 相互作用的檢測(cè)上具有廣闊的應(yīng)用前景。

發(fā)明內(nèi)容
針對(duì)上述現(xiàn)狀，本發(fā)明的目的是提供一種能同時(shí)檢測(cè)多種PRR與多種PAMP相互作 用的病原相關(guān)分子模式免疫檢測(cè)芯片，用于免疫識(shí)別研究中PRR與PAMP相互作用的快速、 準(zhǔn)確、高通量的檢測(cè)。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供上述病原相關(guān)分子模式免疫檢測(cè)芯片的制備方法。本發(fā)明還有一個(gè)目的是提供上述病原相關(guān)分子模式免疫檢測(cè)芯片在PRR與PAMP 相互作用檢測(cè)中的應(yīng)用。本發(fā)明的目的是由以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的一種病原相關(guān)分子模式免疫檢測(cè)芯片，其結(jié)構(gòu)包括晶芯高分子三維基片、基片上固定有多個(gè)6X5的PAMP和抗體微陣列，各個(gè)微陣列之間用芯片專用圍欄或Super PAP Pen 劃線隔開(kāi)。病原相關(guān)分子模式免疫檢測(cè)芯片的制備方法，包括如下步驟(1)抗體的獲得及純化取健康大鼠血清，使用Amersham Phamacia Biotech公司的親和層析柱(HiTrap Protein G Sepharose Column)純化大鼠Ig，以大鼠Ig為抗原，常規(guī)方法免疫純種新西蘭 白兔，采血制備血清，親和層析純化得到兔抗大鼠Ig的抗體。(2) PAMP及抗體樣品的準(zhǔn)備用pH7. 4的含40%甘油的磷酸鹽緩沖液(PBS)溶解各種PAMP，使脂多糖(LPS)Jt 聚糖(PGN)、酵母葡聚糖(Yeast glucan)、眼蟲(chóng)β_1，3葡聚糖(β-1,3 glucan)、甘露聚糖 (mannan)、脂磷壁酸(LTA) ,Poly I C 濃度為 0. 1 2. Omg/mL, CpG ODN 濃度為 5 25 μ g/ mL ；稀釋兔抗大鼠Ig的抗體，使其濃度為0. 05 0. 2mg/mL。(3)樣品的點(diǎn)印與固定用點(diǎn)樣儀將PAMP溶液和抗體稀釋液在瓊脂糖凝膠基片的不同區(qū)域點(diǎn)樣，點(diǎn)樣量 為50 70nL，點(diǎn)直徑為500 600 μ m。每張芯片兩排五列共10個(gè)6 X 5亞陣列，每個(gè)亞陣 列所點(diǎn)樣品一致，一號(hào)為L(zhǎng)PS，二號(hào)為PGN，三號(hào)為Yeast glucan，四號(hào)為β_1，3 glucan，五 號(hào)為marman，六號(hào)為L(zhǎng)TA，七號(hào)為CpG 0DN,八號(hào)為PolyI C，九號(hào)為質(zhì)量控制點(diǎn)，所點(diǎn)樣品為 兔抗大鼠Ig的抗體作為陽(yáng)性對(duì)照及固定對(duì)照，十號(hào)為磷酸鹽甘油緩沖液作為陰性對(duì)照。各 個(gè)亞陣列之間用芯片專用圍欄或Super PAP Pen隔開(kāi)，形成獨(dú)立的反應(yīng)單元。37°C飽和濕 度放置0. 5 2. 5h，60mJ紫外照射10-40min,洗滌，晾干。(4)芯片的封閉向載玻片上點(diǎn)有樣品的區(qū)域分別滴加3%牛血清白蛋白進(jìn)行封閉，37°C飽和濕度 放置lh，洗滌，晾干，4°C密封保存，得到病原相關(guān)分子模式免疫檢測(cè)芯片。本發(fā)明的病原相關(guān)分子模式免疫檢測(cè)芯片的應(yīng)用，所述該應(yīng)用的步驟如下(1)用于檢測(cè)的樣品包括重組櫛孔扇貝C型凝集素-3 (rCfLec-3)、重組櫛 孔扇貝C型凝集素-3-糖識(shí)別結(jié)構(gòu)域-1 (rCfLec-3-CRD-l)、重組櫛孔扇貝C型凝集 素-3-糖識(shí)別結(jié)構(gòu)域_2 (rCfLec-3-CRD-2)、重組櫛孔扇貝C型凝集素-3-糖識(shí)別結(jié)構(gòu) 域-3 (rCfLec-3-CRD-3)、重組硫氧還蛋白(rTrx)，濃度為 100 μ g/mL ；(2)以rCfLec-3免疫大鼠制備抗體，親和層析純化所得抗體；(3)將親和層析純化后的大鼠抗rCfLec-3抗體用Cy3標(biāo)記，過(guò)凝膠柱純化；(4)將待檢樣品加到上述芯片的5個(gè)不同亞陣列中，加樣量為20 μ L/陣列，注意避 免不同亞陣列間的液體混合。室溫飽和濕度放置1 4h，洗滌，再加稀釋的Cy3標(biāo)記的大鼠 抗rCfLec-3多克隆抗體探針，20 μ L/陣列，37°C飽和濕度放置0. 5 2h，洗滌，晾干。(5)激光掃描上述檢測(cè)芯片用晶芯 ECoSCanTM-100(XD掃描儀掃描成像，激發(fā)波長(zhǎng)為532nm，檢 測(cè)波長(zhǎng)為585nm，熒光信號(hào)用Lab-chipscanner 2. 0軟件分析。檢測(cè)結(jié)果分析與判定掃描得到的圖像亞陣列中，十號(hào)樣品陰性對(duì)照的信號(hào)強(qiáng)度 代表實(shí)驗(yàn)的本底值大??；一號(hào)至八號(hào)樣品出現(xiàn)綠色熒光亮點(diǎn)的為陽(yáng)性，表明所檢測(cè)PRR可 與對(duì)應(yīng)的PAMP結(jié)合，無(wú)綠色熒光亮點(diǎn)的為陰性，表明所檢測(cè)PRR不能與對(duì)應(yīng)的PAMP結(jié)合；九號(hào)樣品質(zhì)量控制點(diǎn)出現(xiàn)綠色熒光為正常，如果沒(méi)有綠色熒光，說(shuō)明檢測(cè)操作有問(wèn)題，檢測(cè) 結(jié)果為無(wú)效。所述的 PAMP 為 LPS、PGN> Yeast glucan、β _l，3glucan、mannan、LTA> CpG ODN> Poly I :C八種，但不僅僅限于這八種PAMP。所用于點(diǎn)樣的 LPS、PGN、Yeast glucan、β—1，3glucan、mannan、LTA、Poly I:C 最 適濃度為1. Omg/mL，所用于點(diǎn)樣的CpG ODN最適濃度為20μ g/mL。所用于點(diǎn)樣的親和層析純化后兔抗大鼠Ig抗體最適濃度為0. lmg/mL。所述的用點(diǎn)樣儀將抗體稀釋液在瓊脂糖凝膠基片表面的不同區(qū)域點(diǎn)樣，其放置溫 度為37°C，飽和濕度下放置2h，其60mJ紫外照射時(shí)間為20min所述的待檢樣品加到芯片上后，室溫飽和濕度放置2h ；芯片上加稀釋的抗體探針 后，37 °C飽和濕度下放置Ih。所述芯片單張玻片點(diǎn)有10個(gè)亞陣列，可以根據(jù)實(shí)際需要增加亞陣列數(shù)量，能夠?qū)?現(xiàn)更多樣品的同時(shí)檢測(cè)。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于可以同時(shí)檢測(cè)多種PRR與多種PAMP的結(jié)合，它結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，成本 低廉，通量易于擴(kuò)充，實(shí)現(xiàn)多樣品的同時(shí)平行檢測(cè)，增加了不同標(biāo)本數(shù)據(jù)之間的可比性，可 簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確地檢測(cè)PRR與PAMP的結(jié)合。對(duì)樣品要求簡(jiǎn)單，少量樣品即可滿足檢測(cè)需要， 并大大簡(jiǎn)化了現(xiàn)有檢測(cè)技術(shù)不足。同時(shí)由于陽(yáng)性控制及陰性控制的設(shè)置及重復(fù)點(diǎn)樣，增加 了實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性。反應(yīng)相對(duì)較快，操作過(guò)程便捷，一般人員即可操作，適用于免疫識(shí)別 機(jī)制中PRR與PAMP相互作用的研究。


圖1 病原相關(guān)分子模式免疫檢測(cè)芯片結(jié)構(gòu)示意圖及點(diǎn)樣分布圖。1-晶芯高分子三維基片，2-點(diǎn)樣微陣列，3-芯片專用圍欄或Super PAP Pen劃線， 4-標(biāo)簽區(qū)域。點(diǎn)樣分布① LPS ；② PGN ；③ Yeast glucan ；④ β-1，3glucan ；⑤ mannan ； ⑥LTA;⑦CpG 0DN;⑧Poly I :C ；⑨兔抗大鼠Ig的抗體，作為陽(yáng)性對(duì)照及固定對(duì)照等質(zhì)量 控制；⑩含40%甘油的PBS，作為陰性對(duì)照。圖2:用病原相關(guān)分子模式免疫檢測(cè)芯片檢測(cè)重組櫛孔扇貝C型凝集 素-3(rCfLeC-3)等PRR的PAMP結(jié)合活性的CCD掃描圖(掃描儀的熒光強(qiáng)度設(shè)定為88% )。a 檢測(cè)樣品為重組櫛孔扇貝C型凝集素-3 (rCfLec-3)，表明rCfLec-3能與LPS、 PGN、Yeast glucan、β -1，3glucan、mannan 禾口 CpG ODN 結(jié)合；b 檢測(cè)樣品為重組櫛孔扇貝C型凝集素-3-糖識(shí)別結(jié)構(gòu)域-1 (rCfLec-3-CRD-l)， 表明 rCfLec-3-CRD-l 能與 LPS、PGN、Yeast glucan、β -1，3glucan 和 CpG ODN 結(jié)合；c 檢測(cè)樣品為重組櫛孔扇貝C型凝集素-3-糖識(shí)別結(jié)構(gòu)域_2 (rCfLec-3-CRD-2)， 表明rCfLec-3-CRD-2能與LPS和PGN結(jié)合；d 檢測(cè)樣品為重組櫛孔扇貝C型凝集素-3-糖識(shí)別結(jié)構(gòu)域_3 (rCfLec-3-CRD-3)， 表明 rCfLec-3-CRD-3 能與 LPS 和 mannan 結(jié)合；e 檢測(cè)樣品為重組硫氧還蛋白(rTrx)，表明rTrx不能與任何一種PAMP結(jié)合。
具體實(shí)施例方式
下面通過(guò)具體實(shí)施例來(lái)詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明。本發(fā)明所用儀器及試劑如下晶芯高分子三維基片(購(gòu)自北京博奧生物公司)； 小型手動(dòng)芯片點(diǎn)樣系統(tǒng)(購(gòu)自Whatman公司)；晶芯 ECOScanTM-100(XD掃描儀(購(gòu)自北 京博奧生物公司)；Cy3抗體標(biāo)記試劑盒(購(gòu)自GE公司)；HiTrap Protein G Sepharose Column (購(gòu)自GE公司)；牛血清白蛋白(購(gòu)自SIGMA公司)；Tween-20 (購(gòu)自SIGMA公司)； LPS、PGN、Yeast glucan、β _1，3glucan、mannan、LTA、CpG 0DN、PolyI C (購(gòu)自 SIGMA 公司)。實(shí)施例1 1.抗體的獲得及純化取健康大鼠血清，使用Amersham Phamacia Biotech公司的親和層析柱(HiTrap Protein G Sepharose Column)純化大鼠Ig，以大鼠Ig為抗原，常規(guī)方法免疫純種新西蘭 白兔，采血制備血清，親和層析純化得到兔抗大鼠Ig的抗體。2.芯片結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)該芯片結(jié)構(gòu)如圖1所示，包括晶芯高分子三維基片(1)，晶芯高分子三維基片(1) 上固定有兩排五列共10個(gè)6X5的PAMP微陣列⑵，點(diǎn)樣量為50-70nL，點(diǎn)直徑為500 600 μ m。各個(gè)微陣列之間用芯片專用圍欄或Super PAP Pen劃線(3)隔開(kāi)。在玻片一端具 有標(biāo)簽區(qū)域⑷。3. PAMP及抗體樣品的準(zhǔn)備用pH7. 4的含40%甘油的磷酸鹽緩沖液(PBS)溶解各種PAMP，使脂多糖(LPS)Jt 聚糖(PGN)、酵母葡聚糖(Yeast glucan)、眼蟲(chóng)β_1，3葡聚糖(β-1，3gluCan)、甘露聚糖 (mannan)、脂磷壁酸(LTA) ,Poly I C 濃度為 0. 1、0· 5、1. 0、1. 5、2. 0mg/mL，CpG ODN 濃度為 5、10、15、20、25μ g/mL ；稀釋兔抗大鼠 Ig 的抗體，使其濃度為 0. 05,0. 10,0. 15,0. 20mg/mL。4.樣品的點(diǎn)印與固定用點(diǎn)樣儀將PAMP溶液和抗體稀釋液在瓊脂糖凝膠基片的不同區(qū)域點(diǎn)樣，點(diǎn)樣量 為50 70nL，點(diǎn)直徑為500 600 μ m。每張芯片兩排五列共10個(gè)6 X 5亞陣列，每個(gè)亞陣 列所點(diǎn)樣品一致，一號(hào)為L(zhǎng)PS，二號(hào)為PGN，三號(hào)為Yeast glucan，四號(hào)為β-1，3gluCan，五 號(hào)為marman，六號(hào)為L(zhǎng)TA，七號(hào)為CpG 0DN，八號(hào)為Poly I C，九號(hào)為質(zhì)量控制點(diǎn)，所點(diǎn)樣品 為兔抗大鼠Ig的抗體作為陽(yáng)性對(duì)照及固定對(duì)照，十號(hào)為磷酸鹽甘油緩沖液作為陰性對(duì)照。 各個(gè)亞陣列之間用芯片專用圍欄或Super PAP Pen隔開(kāi)，形成獨(dú)立的反應(yīng)單元。37°C飽和 濕度放置2h，60mJ紫外照射20min，洗滌，晾干。5.芯片的封閉向載玻片上點(diǎn)有樣品的區(qū)域分別滴加3%牛血清白蛋白進(jìn)行封閉，37°C飽和濕度 放置lh，洗滌，晾干，4°C密封保存，得到病原相關(guān)分子模式免疫檢測(cè)芯片。實(shí)施例2 步驟1、2同實(shí)施例1。3. PAMP及抗體樣品的準(zhǔn)備用pH7. 4的含40%甘油的磷酸鹽緩沖液(PBS)溶解各種PAMP，使脂多糖(LPS)Jt 聚糖(PGN)、酵母葡聚糖(Yeast glucan)、眼蟲(chóng)β_1，3葡聚糖(β-1，3gluCan)、甘露聚糖 (mannan)、脂磷壁酸(LTA)、Poly I :C 濃度為 1. 0mg/mL, CpG ODN 濃度為 20 μ g/mL ；稀釋兔抗大鼠Ig的抗體，使其濃度為0. IOmg. mL。4.樣品的點(diǎn)印與固定用點(diǎn)樣儀將PAMP溶液和抗體稀釋液在瓊脂糖凝膠基片的不同區(qū)域點(diǎn)樣，點(diǎn)樣量 為50 70nL，點(diǎn)直徑為500 600 μ m。每張芯片兩排五列共10個(gè)6 X 5亞陣列，每個(gè)亞陣 列所點(diǎn)樣品一致，一號(hào)為L(zhǎng)PS，二號(hào)為PGN，三號(hào)為Yeast glucan，四號(hào)為β_1，3 glucan，五 號(hào)為marman，六號(hào)為L(zhǎng)TA，七號(hào)為CpG 0DN，八號(hào)為Poly I C，九號(hào)為質(zhì)量控制點(diǎn)，所點(diǎn)樣品 為兔抗大鼠Ig的抗體作為陽(yáng)性對(duì)照及固定對(duì)照，十號(hào)為磷酸鹽甘油緩沖液作為陰性對(duì)照。 各個(gè)亞陣列之間用芯片專用圍欄或Super PAP Pen隔開(kāi)，形成獨(dú)立的反應(yīng)單元。37°C飽和 濕度放置0.5,1.0,1.5,2.0,2. 5h，60mJ紫外照射20min，洗滌，晾干。5.芯片的封閉向載玻片上點(diǎn)有樣品的區(qū)域分別滴加3%牛血清白蛋白進(jìn)行封閉，37°C飽和濕度 放置lh，洗滌，晾干，4°C密封保存，得到病原相關(guān)分子模式免疫檢測(cè)芯片。實(shí)施例3 步驟1、2、3同實(shí)施例2。4.樣品的點(diǎn)印與固定用點(diǎn)樣儀將PAMP溶液和抗體稀釋液在瓊脂糖凝膠基片的不同區(qū)域點(diǎn)樣，點(diǎn)樣量 為50 70nL，點(diǎn)直徑為500 600 μ m。每張芯片兩排五列共10個(gè)6 X 5亞陣列，每個(gè)亞陣 列所點(diǎn)樣品一致，一號(hào)為L(zhǎng)PS，二號(hào)為PGN，三號(hào)為Yeast glucan，四號(hào)為β-1，3gluCan，五 號(hào)為marman，六號(hào)為L(zhǎng)TA，七號(hào)為CpG 0DN，八號(hào)為Poly I C，九號(hào)為質(zhì)量控制點(diǎn)，所點(diǎn)樣品 為兔抗大鼠Ig的抗體作為陽(yáng)性對(duì)照及固定對(duì)照，十號(hào)為磷酸鹽甘油緩沖液作為陰性對(duì)照。 各個(gè)亞陣列之間用芯片專用圍欄或Super PAP Pen隔開(kāi)，形成獨(dú)立的反應(yīng)單元。37°C飽和 濕度放置2h，60mJ紫外照射10min、20min、30min、40min，洗滌，晾干。5.芯片的封閉向載玻片上點(diǎn)有樣品的區(qū)域分別滴加3%牛血清白蛋白進(jìn)行封閉，37°C飽和濕度 放置lh，洗滌，晾干，4°C密封保存，得到病原相關(guān)分子模式免疫檢測(cè)芯片。實(shí)施例4 檢測(cè)重組櫛孔扇貝C型凝集素-3(rCfLeC-3)、重組櫛孔扇貝C型凝集 素-3-糖識(shí)別結(jié)構(gòu)域-1 (rCfLec-3-CRD-l)、重組櫛孔扇貝C型凝集素-3-糖識(shí)別結(jié)構(gòu) 域-2 (rCfLec-3-CRD-2)、重組櫛孔扇貝C型凝集素_3_糖識(shí)別結(jié)構(gòu)域_3 (rCfLec-3-CRD-3) 與PAMP的結(jié)合。步驟1、2、3同實(shí)施例2。4.樣品的點(diǎn)印與固定用點(diǎn)樣儀將PAMP溶液和抗體稀釋液在瓊脂糖凝膠基片的不同區(qū)域點(diǎn)樣，點(diǎn)樣量 為50 70nL，點(diǎn)直徑為500 600 μ m。每張芯片兩排五列共10個(gè)6 X 5亞陣列，每個(gè)亞陣 列所點(diǎn)樣品一致，一號(hào)為L(zhǎng)PS，二號(hào)為PGN，三號(hào)為Yeast glucan，四號(hào)為β-1，3gluCan，五 號(hào)為marman，六號(hào)為L(zhǎng)TA，七號(hào)為CpG 0DN，八號(hào)為Poly I C，九號(hào)為質(zhì)量控制點(diǎn)，所點(diǎn)樣品 為兔抗大鼠Ig的抗體作為陽(yáng)性對(duì)照及固定對(duì)照，十號(hào)為磷酸鹽甘油緩沖液作為陰性對(duì)照。 各個(gè)亞陣列之間用芯片專用圍欄或Super PAP Pen隔開(kāi)，形成獨(dú)立的反應(yīng)單元。37°C飽和 濕度放置2. Oh, 60mJ紫外照射20min，洗滌，晾干。
5.芯片的封閉向載玻片上點(diǎn)有樣品的區(qū)域分別滴加3%牛血清白蛋白進(jìn)行封閉，37°C飽和濕度 放置lh，洗滌，晾干，4°C密封保存，得到病原相關(guān)分子模式免疫檢測(cè)芯片。6.特異性抗體的獲得及純化以體外重組構(gòu)建、誘導(dǎo)純化的rCfLec-3為抗原，常規(guī)方法免疫大鼠，采血制備血 清，得到大鼠抗rCfLec-3抗體，親和層析純化所得抗體。7. Cy3標(biāo)記的抗體探針的制備按照Amersham Phamacia Biotech公司的產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)，使用熒光素Cy3對(duì)親和層 析純化后的大鼠抗rCfLec-3抗體進(jìn)行標(biāo)記，并過(guò)凝膠柱純化。8.樣品檢測(cè)將待檢樣品rCfLec-3、rCfLec-3-CRD-l、rCfLec-3-CRD_2、rCfLec-3-CRD_3 加到 上述芯片的4個(gè)不同亞陣列中，加樣量為20 μ L/陣列，注意避免不同亞陣列間的液體混合。 室溫飽和濕度放置l、2、3、4h，洗滌，再加稀釋的Cy3標(biāo)記的大鼠抗rCfLec-3多克隆抗體探 #,20 μ L/陣列，37°C飽和濕度放置0. 5、1. 0、1. 5、2. 0h，洗滌，晾干。9.激光掃描上述檢測(cè)芯片用晶芯 ECoSCanTM-100(XD掃描儀掃描成像，激發(fā)波長(zhǎng)為532nm，檢 測(cè)波長(zhǎng)為585nm，熒光信號(hào)用Lab-chipscanner 2. 0軟件分析。檢測(cè)結(jié)果分析與判定掃描得到的圖像亞陣列中(圖2，a-d)，十號(hào)陰性對(duì)照的無(wú) 熒光信號(hào)，表明本實(shí)驗(yàn)不受非特異性結(jié)合干擾；九號(hào)質(zhì)量控制點(diǎn)出現(xiàn)綠色熒光，表明本實(shí)驗(yàn) 結(jié)果有效；a 檢測(cè)樣品為rCfLec-3，一、二、三、四、五、七號(hào)出現(xiàn)綠色熒光信號(hào)，表明 rCfLec-3 能與 LPS、PGN、Yeast glucan、β -1，3glucan、mannan 和 CpG ODN 結(jié)合；b 檢測(cè)樣品為rCf Lec-3-CRD-l，一、二、三、四、七號(hào)出現(xiàn)綠色熒光信號(hào)，表明 rCfLec-3-CRD-l 能與 LPS、PGN、Yeast glucan、β -1，3glucan 和 CpG ODN 結(jié)合；c 檢測(cè)樣品為rCfLec-3-CRD-2，一、二號(hào)出現(xiàn)綠色熒光信號(hào)，表明 rCfLec-3-CRD-2 能與 LPS 和 PGN 結(jié)合；d 檢測(cè)樣品為rCfLec-3-CRD-3，一、五號(hào)出現(xiàn)綠色熒光信號(hào)，表明 rCfLec-3-CRD-3 能與 LPS 和 mannan 結(jié)合；實(shí)施例5 病原相關(guān)分子模式免疫檢測(cè)芯片的特異性檢測(cè)取重組硫氧還蛋白(rTrx)與病原相關(guān)分子模式免疫檢測(cè)芯片上微陣列孵育，經(jīng) 抗體探針檢測(cè)后掃描，除九號(hào)質(zhì)量控制點(diǎn)外無(wú)綠色熒光信號(hào)出現(xiàn)(圖2，d)，證實(shí)所制備的 病原相關(guān)分子模式免疫檢測(cè)芯片不與非PRR蛋白反應(yīng)。本領(lǐng)域的普通研究人員都會(huì)理解，在本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)，對(duì)于上述實(shí)施例進(jìn)行 修改、添加和替換都是可能的，其都沒(méi)有超出本發(fā)明的保護(hù)范圍。
權(quán)利要求
一種病原相關(guān)分子模式免疫檢測(cè)芯片，其特征在于它包括晶芯高分子三維基片，晶芯高分子三維基片上固定有多個(gè)病原相關(guān)分子模式(PAMP)和抗體微陣列，各個(gè)微陣列之間用芯片專用圍欄或SuperPAPPen劃線隔開(kāi)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的病原相關(guān)分子模式免疫檢測(cè)芯片，其特征在于所述的PAMP 為脂多糖(lipopolysaccharides，LPS)、肽聚糖(ρ印tidoglycan，PGN)、酵母葡聚糖(Yeast glucan)、β-1，3 葡聚糖(β-1，3glucan)、甘露聚糖(mannan)、脂磷壁酸(lipoteichoic acids, LTA)、CpG脫氧寡核苷酸(CpG ODN), Poly I C，所述抗體是兔抗大鼠Ig的抗體。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的病原相關(guān)分子模式免疫檢測(cè)芯片的制備方法，其特征是它包 括如下步驟(1)抗體的制備及純化取健康大鼠血清，親和層析純化大鼠Ig，以大鼠Ig為抗原常規(guī)方法免疫純種新西蘭白 兔，采血制備血清，親和層析純化得到兔抗大鼠Ig的抗體。(2)PAMP及抗體樣品的準(zhǔn)備用pH7. 4的含40%甘油的磷酸鹽緩沖液(PBS)溶解各種PAMP，使脂多糖(LPS)、肽 聚糖(PGN)、酵母葡聚糖(Yeast glucan)、眼蟲(chóng)β_1，3葡聚糖(β-1，3gluCan)、甘露聚糖 (mannan)、脂磷壁酸(LTA) ,Poly I C 濃度為 0. 1 2. Omg/mL, CpG ODN 濃度為 5 25 μ g/ mL ；稀釋兔抗大鼠Ig的抗體，使其濃度為0. 05 0. 2mg/mL。(3)樣品的點(diǎn)印與固定用點(diǎn)樣儀將PAMP溶液和抗體稀釋液在瓊脂糖凝膠基片的不同區(qū)域點(diǎn)樣，點(diǎn)樣量為 50 70nL，點(diǎn)直徑為500 600 μ m。每張芯片兩排五列共10個(gè)6 X 5亞陣列，每個(gè)亞陣列 所點(diǎn)樣品一致，一號(hào)為L(zhǎng)PS，二號(hào)為PGN，三號(hào)為Yeast glucan，四號(hào)為β-1，3gluCan，五號(hào) 為marman，六號(hào)為L(zhǎng)TA，七號(hào)為CpG 0DN，八號(hào)為Poly I C，九號(hào)為質(zhì)量控制點(diǎn)，所點(diǎn)樣品為 兔抗大鼠Ig的抗體作為陽(yáng)性對(duì)照及固定對(duì)照，十號(hào)為磷酸鹽甘油沖液作為陰性對(duì)照。各個(gè) 亞陣列之間用芯片專用圍欄或Super PAP Pen隔開(kāi)，形成獨(dú)立的反應(yīng)單元。37°C飽和濕度 放置0. 5 2. 5h，60mJ紫外照射10-40min，洗滌，晾干。(4)芯片的封閉向載玻片上點(diǎn)有樣品的區(qū)域分別滴加3%牛血清白蛋白進(jìn)行封閉，37°C飽和濕度放置 lh，洗滌，晾干，4°C密封保存，得到病原相關(guān)分子模式免疫檢測(cè)芯片。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的病原相關(guān)分子模式免疫檢測(cè)芯片的制備方法，其特征在于使 用兔抗大鼠Ig的抗體作為陽(yáng)性對(duì)照及固定對(duì)照。
5.病原相關(guān)分子模式免疫檢測(cè)芯片在檢測(cè)免疫識(shí)別過(guò)程中PAMP與模式識(shí)別受體 (PRR)相互作用的應(yīng)用，其特征在于它包括如下步驟(1)誘導(dǎo)并純化重組櫛孔扇貝C型凝集素-3(rCfLec-3)、重組櫛孔扇貝C型凝集 素-3-糖識(shí)別結(jié)構(gòu)域-1 (rCfLec-3-CRD-l)、重組櫛孔扇貝C型凝集素-3-糖識(shí)別結(jié)構(gòu) 域-2 (rCfLec-3-CRD-2)、重組櫛孔扇貝C型凝集素-3-糖識(shí)別結(jié)構(gòu)域-3 (rCfLec-3-CRD-3)、 重組硫氧還蛋白(rTrx)；(2)以rCfLec-3免疫大鼠制備抗體，親和層析純化所得抗體；(3)將親和層析純化后的大鼠抗rCfLec-3抗體用Cy3標(biāo)記，并過(guò)凝膠柱純化；(4)將待檢樣品rCfLec-3、rCfLec-3-CRD-U rCfLec-3-CRD-2, rCfLec-3-CRD-3, rTrx加到上述芯片的不同亞陣列中，加樣量為20 μ L/陣列，注意避免不同亞陣列間的液體混 合。室溫飽和濕度放置1 4h，洗滌，再加稀釋的Cy3標(biāo)記的大鼠抗rCfLec-3多克隆抗體 探針，20 μ L/陣列，37°C飽和濕度放置0. 5 2h，洗滌，晾干。(5)上述檢測(cè)芯片用晶芯 EcOScanTM-100C⑶掃描儀掃描成像，圖像用專業(yè)分析軟件分 析，根據(jù)熒光信號(hào)的強(qiáng)弱，得到樣品與芯片中PAMP相互作用的結(jié)果。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的病原相關(guān)分子模式免疫檢測(cè)芯片的應(yīng)用，其特征在于所用待 檢樣品為PRR，所述PAMP芯片與待檢樣品中PRR反應(yīng)形成的復(fù)合體，被高特異性的Cy3標(biāo)記 的抗體探針?biāo)R(shí)別，在532nm的激光下呈現(xiàn)綠色熒光。。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的病原相關(guān)分子模式免疫檢測(cè)芯片的應(yīng)用，其特征在于待檢樣 品滴加到芯片上后，室溫飽和濕度放置2h，玻片上加稀釋的熒光抗體探針后，37°C飽和濕度 放置Ih。
全文摘要
本發(fā)明涉及免疫學(xué)免疫檢測(cè)領(lǐng)域。本發(fā)明公開(kāi)了一種病原相關(guān)分子模式免疫檢測(cè)芯片及其制備方法與應(yīng)用。該芯片由芯片載體與固定于其上的病原相關(guān)分子模式和抗體組成。芯片載體為商品化的晶芯高分子三維基片；本發(fā)明的病原相關(guān)分子模式免疫檢測(cè)芯片，包括病原相關(guān)分子模式和抗體微陣列的制備，檢測(cè)用特異性多克隆抗體的制備和熒光素(Cy3)標(biāo)記，及應(yīng)用該芯片同時(shí)檢測(cè)多個(gè)樣品與病原相關(guān)分子模式相互作用的具體步驟及條件優(yōu)化。本發(fā)明獲得的病原相關(guān)分子模式免疫檢測(cè)芯片可用于免疫識(shí)別作用機(jī)制的研究，以及藥物開(kāi)發(fā)中生物大分子相互作用的研究。
文檔編號(hào)G01N33/531GK101893618SQ20101020935
公開(kāi)日2010年11月24日 申請(qǐng)日期2010年6月17日 優(yōu)先權(quán)日2010年6月17日
發(fā)明者宋林生, 張峘, 楊嘉龍, 王玲玲, 邱麗梅 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院海洋研究所