專利名稱：用于評(píng)價(jià)患牙周炎的危險(xiǎn)率的方法和裝置的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于測定病人患活性牙周炎或在口腔中患牙周炎的危險(xiǎn)率方法的改進(jìn)。
斑細(xì)菌移生到牙齒的侵入處并且引起細(xì)菌毒素、酶和可迅速發(fā)展成局限在齦組織的炎癥(齦炎)的代謝產(chǎn)物。局部宿主組織對(duì)細(xì)菌病原體的侵入的炎癥應(yīng)答包括在對(duì)抗由斑病原體及其產(chǎn)物所帶來的組織損傷中擔(dān)任各種角色的多種類型的細(xì)胞(如多形核白細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、血漿細(xì)胞、巨噬細(xì)胞)的浸潤。在許多個(gè)體中，斑病原體及與之相關(guān)的炎性應(yīng)答的持續(xù)存在導(dǎo)致了牙周炎，包括對(duì)用于接合牙齒的結(jié)締組織以及支持牙齒的牙槽骨的進(jìn)行性損害。
牙周附著器官由牙骨質(zhì)、牙周韌帶和把牙齒連接到牙槽骨的槽部的牙周韌帶的組元纖維組成。對(duì)健康的牙周而言，牙周正好附著在牙齒釉質(zhì)及牙根的牙骨質(zhì)之間的接界的尖端。在臨床上，對(duì)牙齒上的一個(gè)特定部位牙周附著部分的損壞測定是一個(gè)校準(zhǔn)過的牙周探頭測量根牙骨質(zhì)界與釉質(zhì)之間的距離和對(duì)牙周探針的探測產(chǎn)生機(jī)械阻力的牙周袋的基托的水平而完成的。如果存在附著損失，還可能出現(xiàn)牙周袋。如果由牙周病原體移生所致的附著損失的情況繼續(xù)發(fā)展，則可能導(dǎo)致牙槽骨損失。這種組織的損害可能放慢，但是用傳統(tǒng)的治療手段無法逆轉(zhuǎn)。
在患牙周炎的人口中，疾病發(fā)展的速度相差很大;此外，對(duì)個(gè)別的病人，疾病在口腔中的不同部位發(fā)展的速度也有很大不同。在口腔中，個(gè)別的牙齒及其相應(yīng)的牙根表面所發(fā)生的牙周炎的嚴(yán)重程度有顯著的不同。目前，據(jù)認(rèn)為該病的發(fā)展模式既可以是隨時(shí)間呈慢性地線性發(fā)展，也可以是按緩解時(shí)間區(qū)分的疾病活性突然發(fā)作的模式。顯然，在每一種情況下，對(duì)一患者群體作跟蹤時(shí)間考察時(shí)，在臨床上可表現(xiàn)出的疾病進(jìn)行的情況患者的不同及在每個(gè)患者口腔中的部位不同會(huì)有明顯的不同。
檢測出發(fā)病危險(xiǎn)率高的病人和部位可以事先區(qū)分出哪些病人和哪此部位是急需治療的或需要預(yù)防性處置的，以便阻止疾病發(fā)展到損害組織的階段。
目前，尚沒有有效的手段來評(píng)價(jià)患持續(xù)性的附著損失的病人或部位急性發(fā)病的危險(xiǎn)率。疾病進(jìn)行的臨床測量可提供早期疾病活性的測量結(jié)果，但是并不能提供區(qū)分各部位或各患者未來疾病活性水平高低的手段。
對(duì)斑病原體的宿主免疫應(yīng)答包括同時(shí)產(chǎn)生出能使齦組織免受侵入的細(xì)菌的摧毀作用的分子以及在發(fā)生可摧毀牙周組織的宿主應(yīng)答的分子。例如，淋巴細(xì)胞會(huì)產(chǎn)生可中和細(xì)菌及其有毒產(chǎn)物的阻止斑病原體的抗體。同時(shí)，炎性細(xì)胞能夠釋放出各種能分裂并降解關(guān)鍵的牙周組織結(jié)構(gòu)成分中的蛋白質(zhì)和多糖的水解酶。
為對(duì)抗牙周病原體而產(chǎn)生的抗體結(jié)合到病原體或它們的產(chǎn)物上，成為抗原-抗體復(fù)合體。這些抗原-抗體復(fù)合體導(dǎo)致了病原體及其產(chǎn)物的中和和凝集。復(fù)合體還通過多形核白細(xì)胞(PMN)促進(jìn)了對(duì)病原體和其產(chǎn)物的吞噬作用、殺滅作用和降解。不過，這些抗原-抗體復(fù)合體中的一些會(huì)因?yàn)槠浼せ钛a(bǔ)體體系的能力而引起次級(jí)炎性反應(yīng)，所述的補(bǔ)體體系是能夠激活各種炎性機(jī)制的蛋白質(zhì)水解酶的一個(gè)級(jí)聯(lián)。
作為一種水解酶和PMN激活的酶標(biāo)志的β-葡萄糖醛酸酶(BG)參與了粘多糖/蛋白多糖的酸降解。事實(shí)上，據(jù)報(bào)道，隨著牙周炎患者中發(fā)生活性牙周炎機(jī)會(huì)的增加，齦縫流體(GCF)中BG的水平也增加。因此，看來伴隨著活性牙周炎，牙周病原體在齦組織之中或周圍被PMN銜接的機(jī)會(huì)也增加了。
由于細(xì)菌病原體為發(fā)育齦炎和牙周炎所必需，因此測量特定的細(xì)菌病原體本身的存在與否并不是預(yù)測患活性疾病可能性的足夠的或有效的手段。結(jié)果，尋找預(yù)測未來疾病活性的手段的工作已集中于在在疾病過程中因宿主因子應(yīng)答而流出的齦縫流體中可見的各種分子的締合(見Lamster，I.B.等人，縫流體中的酶活性對(duì)患慢性牙周炎病的患者中臨床附著損失的檢測和預(yù)測，J.Periodontol.，59，第516-523，(1988)(以后稱為Lamster)，及Palcanis，K.G.等人，用彈性硬蛋白酶做為牙周疾病進(jìn)程的指示物，J.Periodontol.，63，第237-242，(1992)(以后稱為Palcanis))。
GCF包括與那些由在齦組織或齦縫中的宿主細(xì)胞相同的分子。因此，GCF提供了一個(gè)存在于齦組織中的宿主分子的圖象，并且可用于指示其中發(fā)生的應(yīng)答和響應(yīng)。目前的研究正傾向于集中在測量可以與破壞齦組織有關(guān)的宿主分子的存在。因此，測量可在齦縫流體中發(fā)現(xiàn)的各種炎性介體(例如前列腺素E2)、公認(rèn)的組織破壞/水解酶(例如β-葡萄糖醛酸酶和彈性硬蛋白酶)以及作為細(xì)胞死亡的酶標(biāo)志(例如天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶)的含量并同牙周附著中測不出臨床變化的情況進(jìn)行比較，以判斷這些數(shù)據(jù)與患活性疾病的危險(xiǎn)增加的那些患者或部位的關(guān)系(見Lamster和Palcanis)。現(xiàn)已證明這些分子的存在與未來疾病活性的相關(guān)性尚未強(qiáng)到使足以成為一種普遍接受和可靠的預(yù)測疾病活性的方法。
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種檢測人類及較低等的動(dòng)物牙周疾病發(fā)生的增加危險(xiǎn)率的方法。
本發(fā)明的一個(gè)進(jìn)一步的目的是提供用于檢測和評(píng)價(jià)病人或人類或較低等動(dòng)物中特定牙周位置的疾病發(fā)展的危險(xiǎn)率的診斷裝置。
本發(fā)明涉及用于檢測或評(píng)價(jià)目前或以后發(fā)生活性牙周炎的危險(xiǎn)率的方法和裝置，包括(a)采集槽縫流體;(b)測量槽縫流體中IgA的量;(c)測量槽縫流體中多形核白細(xì)胞標(biāo)志物的量;(d)比較步驟(b)與(c)中所得的量與一標(biāo)準(zhǔn)值的比值。
本發(fā)明涉及檢測人類及較低等的動(dòng)物中病人或牙周位置患活性牙周炎的危險(xiǎn)性的診斷方法。這些方法包括測量GCF中IgA和PMN標(biāo)志的水平，計(jì)算這些值的比率，并且用這個(gè)比率估價(jià)患活性牙周炎的危險(xiǎn)率。出人意料的是，IgA/PMN標(biāo)志的比值看來反映出了宿主應(yīng)答機(jī)制處于平衡態(tài)或非平衡態(tài)，從而指示了活性牙周炎發(fā)生的可能性。當(dāng)一病人或一部位的IgA/PMN標(biāo)志的比值低于沒有患活性牙周炎的危險(xiǎn)率的病人或部位中的所得的IgA/PMN標(biāo)志的比值時(shí)，該病人或部位患活性牙周炎的危險(xiǎn)率在增加。
“牙周附著”在此處指支持牙槽骨的槽中的牙齒的結(jié)締組織的附著。
“牙周炎”一詞在此處指包括牙周附著和/或牙槽骨吸收在內(nèi)的破壞組織的疾病。
“齦組織”在此處指牙齦組織和環(huán)繞牙齒和牙槽附著和牙槽骨的粘液膜。
“齦縫”在此處指同牙周附著的水平有關(guān)的、位于自出齦的內(nèi)側(cè)部分與牙釉質(zhì)或與牙骨質(zhì)之間的空間。
“牙周槽”指與由齦附著向牙根的尖移行引起的牙周疾病有關(guān)的、異常深的齦縫。
“活性牙周炎”在此處專指一種牙周炎，其中發(fā)生了臨床上可檢測得到的結(jié)締組織附著損失和/或牙槽骨吸收的增加。
“非活性牙周炎”在此處指不可檢測出結(jié)締組織附著損失和/或牙槽骨吸收的增加的疾病。
“齦縫流體”和“GCF”在此處指從自由齦中的毛細(xì)管漏流所產(chǎn)生的在齦縫中采集的血漿漏出液。
“齦炎”在此處指齦組織的炎癥。
“疾病”在此處指牙周炎。
“部位”在此處指為檢查牙周炎的有無而監(jiān)視的牙周圍特定的位置(如在牙根的正中、遠(yuǎn)中、頰向或舌向表面)。
“標(biāo)志”在此處指可以檢測和測量并且可指示是否存在一個(gè)或多個(gè)與疾病病理學(xué)機(jī)理相關(guān)的一個(gè)或多個(gè)特異性的分子。
“IgA”在此處指血清型免疫球蛋白A。
“PMN”在此處指多形核白細(xì)胞。
“GCF樣品”在此處指從一個(gè)部位或一個(gè)患者的齦縫所采集的相當(dāng)數(shù)量的GCF。
“GCF試驗(yàn)樣品”在此處指稀釋進(jìn)一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)體積的緩沖液中的GCF樣品，從所述的緩沖液中取出多個(gè)等分量用于隨后的GCFIgA或GCFPMN標(biāo)志的分析。
“GCFIgA”在此處指在一個(gè)GCF試驗(yàn)樣品中檢測出的齦縫流體血清型IgA。GCFIgA包括IgA1及IgA2同位素，并且不限于對(duì)特定的抗原特異的IgA抗體。
“GCFBG”在此處指在一個(gè)GCF試驗(yàn)樣品中所檢測到的活性β-葡萄糖醛酸酶的量。
“GCFPMN”在此處指從齦組織移生進(jìn)齦縫的齦縫多形核白細(xì)胞。
“PMN標(biāo)志”在此處指用于一GCF試驗(yàn)樣品中所檢測到的活性多形核白細(xì)胞的多種特定的標(biāo)志中的任何一種。
“GCFPMN的活化”在此處指GCFPMN與齦縫、牙周袋或牙周組織中的細(xì)菌的應(yīng)答過程，所述的應(yīng)答形成了對(duì)PMN代謝產(chǎn)物、酶和/或副產(chǎn)品的加工。
患活性疾病的危險(xiǎn)率與IgA/PMN標(biāo)志的比值的相關(guān)性大小依賴于所選擇的PMN標(biāo)志。一些IgA/PMN標(biāo)志的比值相對(duì)于其他的比值而言是更可靠的預(yù)測值。用于本發(fā)明目的的待測的適用的PMN標(biāo)志包括那些代表PMN活化和去粒水平的標(biāo)志。這些標(biāo)志包括(但不限于)β-葡萄糖醛酸酶、水解酶、彈性硬蛋白酶、組織蛋白酶(如組織蛋白酶B/L及組織蛋白酶G)以及明膠酶，反映PMN的早期活化事件的髓過氧化物酶膠其代謝產(chǎn)物(如LTB4或LTC4)。優(yōu)選的PMN標(biāo)志為彈性硬蛋白酶和β-葡萄糖醛酸酶。
可以用很多種方法得到GCFIgA/PMN標(biāo)志比，這些方法包括用一個(gè)GCF樣品中所存在的GCFIgA的總量除以一個(gè)GCF樣品中所存在的PMN標(biāo)志的總量;用GCF試驗(yàn)樣品的一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)可分量中所存在的GCFIgA的總量除以GCF試驗(yàn)樣品的一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)可分量中所存在的GCFPMN標(biāo)志的總量;用一個(gè)GCF試驗(yàn)樣品中所存在的GCFIgA的濃度除以該GCF試驗(yàn)樣品中所存在的GCFPMN標(biāo)志的濃度;或者用GCFIgA的濃度除以GCFPMN標(biāo)志的濃度。
可以用多種方法采集GCF。其中，這些方法包括Lamster、Hartley和Vogel等人的“關(guān)于齦縫流體的生化技術(shù)的進(jìn)展”，J.Periodontology，56(增補(bǔ))13-21，(1985)(以后稱為LamsterⅡ)，在此引入以供參考。通過采用上述那些采集方法，可以獲得GCF樣品。
測量GCFIgA的方法有許多方法可以用來測量GCF樣品中IgA的含量。這些方法包括(但不限于)采用酶連接免疫吸著測定(ELISA)技術(shù)的測定法，或者用作為檢測系統(tǒng)的放射免疫法(RIA)測定法。
用ELISA進(jìn)行GCFIgA測量的方法見Sengupta等人，治療對(duì)患慢性牙周炎的成年患者的齦縫液體中的IgG、IgA、IgM和α-2-巨球蛋白的作用，Arch.Oral.OralBiol.，33，No.6，第425-431頁(1988年6月)(以后稱為Sengupta)，這篇文獻(xiàn)在此引入以供參考。這些敘述的方法以及改進(jìn)了的ELISA法采用了一種非人類(最好是非靈長類)抗人類IgA“俘獲”抗體，該抗體是一種多克隆或單克隆抗IgA抗體制劑。所用的俘獲抗體對(duì)IgA特異并且不與人類IgG、IgM、IgE或IgD發(fā)生交叉反應(yīng)。
此抗IgA“俘獲”抗體通?？膳c一種固體支持器(如一種微滴定培養(yǎng)板)或與一種顆?；|(zhì)(如膠乳)發(fā)生交聯(lián)。
在對(duì)試驗(yàn)樣品培養(yǎng)期間，此“俘獲”抗體從GCF已溶解進(jìn)的試驗(yàn)樣品緩沖液或直接從GCF樣品本身俘獲GCFIgA，并且把它保持在用于有關(guān)的免疫測定試驗(yàn)中的固體支持物/顆?；|(zhì)上。然后可以將所俘獲的IgA從剩下的GCF樣品成分中分離出來，分離的方法通常可以是輕洗GCFIgA所復(fù)合的表面或者過濾俘獲IgA所復(fù)合的顆粒狀復(fù)合體。接著使所俘獲的抗體-GCFIgA復(fù)合體暴露于一種抗體酶軛合物(如過氧化物酶-軛合的兔IgG)。
這種抗體-酶軛合物中采用了一種對(duì)人類IgA免疫球蛋白特異的、并且不與抗體-IgA俘獲抗體交叉應(yīng)答的抗體。此抗體通常與一種產(chǎn)色酶(如辣根過氧化物酶、堿性磷酸酯酶、β-葡萄糖醛酸酶或糖苷酶)或與生物素相軛合/連接。如果發(fā)生生物素化抗體與所俘獲的IgA復(fù)合，隨后再用一種抗生物素抗體-酶軛合物(例如用一種上述的產(chǎn)色酶)或一種抗生物素蛋白-產(chǎn)色酶軛合物進(jìn)行培養(yǎng)。然后可將上述俘獲-抗體-IgA-抗體-產(chǎn)色酶復(fù)合物暴露在適用于相應(yīng)的軛合酶(如分別用于HRP和堿性磷酸酯酶的鄰苯二胺二鹽酸鹽和對(duì)硝基苯酚磷酸酯)的產(chǎn)色底物。然后在一種適當(dāng)?shù)木彌_液中培養(yǎng)這個(gè)混合物，使發(fā)生一種產(chǎn)色反應(yīng)，該反應(yīng)的吸收和/或強(qiáng)度正比于被俘獲抗體所束縛的IgA的量(關(guān)于ELISA方法的背景，見Notermans，S.等人，用酶連接免疫吸收測定法(ELISA)檢測和確定肉毒梭菌毒素A、B和E，METHODSINENZYMOLOGY，84，pp223-238，(1984)(以后稱為Notermans);Butler，J.E.，放大的ELISA;在生化分離中相當(dāng)數(shù)量的綱和亞綱的抗體以及抗體分布及抗原方面的原理和應(yīng)用，METHODSINENZYMOLOGY，73，第483-523(1981)(以后稱為Butler);SigmaImmunoChemicalsCatalog1992(SigmaChemicalCompany)，(以后稱為Sigma);Engvall，E.等人，酶連接免疫測定法，ELISA，Ⅲ.由酶標(biāo)志抗免疫球蛋白對(duì)涂覆抗原的管中特異抗體進(jìn)行定量化，J.OFIMMUNOL.109，pp，129-139(1972)(以后稱為Engvall);Kato，K.等人，酶聯(lián)免疫測定免IgG的FAB片段與大腸桿菌的β-半乳糖苷酶的結(jié)合及其免疫測定應(yīng)用，J.OFIMMUNOL.116，第1554-1564(1976)(以后稱為Kato);及Guesdon，J.L.，磁性固相酶免疫測定法用于對(duì)抗原和抗體的定量化人類免疫球蛋白E的應(yīng)用，METHODSINENZYMOLOGY，73，第471-482，(1981)，在此引入每一篇文獻(xiàn)以供參考)。
適用的非人類“俘獲”抗體包括從鼠、兔、豚鼠和山羊得到的抗血清(見Sengupta和Butler)。
適用的固體支持器包括聚苯乙烯，濾紙、硝化纖維素、尼龍、鐵磁珠和溴化氰活化紙。聚苯乙烯和硝化纖維素最為優(yōu)選(見Butler;PappasM.G.，點(diǎn)型ELISA在免疫寄生物學(xué)中最新的用途，VET.PARASITOLOGY，29，第105-129，(1988);LehtonenO.P.等人，ELISA中的抗原附著，J.IMMUNOL.METHODS，34，第61-70，(1980);Smith，K.O.等人，磁傳送裝置在固相放射免疫測定法和酶連接免疫吸收測定法中的應(yīng)用，J.INFECT.DIS.，136，第S329-336，(1977);Hendry，R.M.等人，用尼龍耦合的酶連接免疫測定法對(duì)流感抗原的檢測和鑒定，J.VIROL.METHODS，6，第9-17，(1983)(以后稱為Hendry);Maiolini，R.等人，酶免疫測定的疊層法。I.在鼠和人類α-胎兒蛋白的應(yīng)用;J.IMMUNOL.METHODS，8，第223-234，(1975)，以及SamantaA.K.等人，用硝化纖維素盤作為固相對(duì)睪酮的免疫測定，J.CLIN.CHEM.BIOCHEM.28，第943-947，(1990)，在此引入每篇文獻(xiàn)以供參考)。
可以使用的顆?；|(zhì)包括聚苯乙烯、膠乳、尼龍、磁珠、玻璃、瓊脂糖和瓊脂糖。串珠狀的聚苯乙烯和膠乳最為優(yōu)選(見NilssonB.，一種用于放大ELISA的通用試劑，J.Immunol.Methods，114，第89-93，(1988);Henry;Gundersen，S.G.，磁珠抗原俘獲，用于血吸蟲陽極抗原的快速檢測的微滴定盤中的酶連接免疫測定法，J.Immunol.Methods，148，第1-8，(1992);Oku，Y.，用高靈敏珠的ELISA法檢測細(xì)菌蛋白質(zhì)毒素的進(jìn)展，Microbiol.Immunol.，32，第807-816，(1988);以及Harada，T.等人，用酶連接免疫吸收測定法檢測對(duì)B類嗜血桿菌流感的囊特異性多糖特異的粘膜和血清抗體，Microbiol.Immunol.29，第591-600，(1985);及Sigma，在此引入每篇文獻(xiàn)以供參考)。
適用的抗體酶軛合物及俘獲抗體對(duì)包括與辣根過氧化物酶(HRP)、堿性磷酸酯酶、β-半乳糖苷酶或糖苷酶、堿性焦磷酸酶或脲酶軛合的IgG或IgM同型的小鼠、山羊和兔抗人類IgA抗體(見Sigma;Notermans;Butler;Kato;Engvall;及Cerrone，M.C.等人，用于有限稀釋微培養(yǎng)分析的脲酶基微ELISA法的介紹，J.Immunol.Methods，138，第65-75，(1991)(以后稱為Cerrone)，在此引入以供參考)。
適于與HRP和堿性磷酸酯酶及脲酶相軛合的適用的產(chǎn)色底物包括鄰苯二胺二鹽酸鹽、對(duì)硝基苯酚磷酸酯及脲分別加上一種pH指示劑(見Notermans;Butler;Cerrone和Sigma)。
用于本發(fā)明的合適的緩沖劑尤其包括磷酸鹽(0.001-0.1M)緩沖(pH＝6.6-7.4)鹽水溶液(0.10-0.20NNaCl)加上吐溫(0.01%-0.1%)(即PBST)。優(yōu)選的緩沖劑為PBST，包括pH為7.01的0.01M磷酸鹽緩沖劑加上含有0.05%吐溫的0.15N的鹽水溶液。
用于本發(fā)明的ELISA還可以在溶液中進(jìn)行，其中用目視法觀察顯色反應(yīng)以給出所存在的IgA的水平。還可用生色的酶(如辣根過氧化物酶、堿性磷酸酯酶和脲酶)來進(jìn)行這些顯色反應(yīng)，還可以同產(chǎn)熒光的底物偶合(見Notermans;Butler;Sigma和Magnusson，K.E.等人，用于定量分析對(duì)食物抗原的抗體的熒光連接免疫吸收測定法(FLISA)，Immunol.Invest.，16，第227-240，(1987)，在此引入以供參考)。
利用分光光度裝置或通過采用目視測定法，可以用這些顯色測定法來進(jìn)行定量評(píng)估。這些測定法可包括采用包括一種酶-抗體軛合物及其相應(yīng)的產(chǎn)色底物的PBST溶液。可以把這些溶液顏色的變化同由相應(yīng)于特定濃度的IgA在標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)樣品中所引發(fā)的產(chǎn)色底物的顏色變化的一系列顏色標(biāo)準(zhǔn)的圖進(jìn)行比較。通過將顏色的改變同相當(dāng)?shù)念伾珮?biāo)準(zhǔn)進(jìn)行對(duì)照，可以確定試驗(yàn)樣品中IgA的水平。
當(dāng)采用辣根過氧化物酶時(shí)，上述抗體軛合物的相應(yīng)的產(chǎn)色底物可以包括鄰苯二胺二鹽酸鹽;當(dāng)采用堿性磷酸酯酶時(shí)，可以包括對(duì)硝基苯酚磷酸酯;并且當(dāng)采用脲酶時(shí)，可以包括脲加上一種pH指示劑。
可以按下述方法建立一系列顏色標(biāo)準(zhǔn)對(duì)包括IgA濃度范圍已知的多個(gè)標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)樣品進(jìn)行一系列比色測定，然后通過使顏色標(biāo)準(zhǔn)與強(qiáng)度和/或吸收相對(duì)照以建立這些顏色標(biāo)準(zhǔn)。這些顏色標(biāo)準(zhǔn)可以呈能代表一定范圍的顏色強(qiáng)度/吸收的某種形式的圖，所述的顏色強(qiáng)度/吸收相應(yīng)于一個(gè)在試驗(yàn)樣品中可以發(fā)現(xiàn)的很寬范圍的IgA濃度。
這些免疫測定法可以與固相支持器、微珠、凝膠、其它顆粒物或?yàn)V器聯(lián)合使用，其中顏色改變的最終產(chǎn)品被俘獲在一個(gè)固相支持器上。
適用的固體支持器包括聚苯乙烯、濾紙和硝化纖維素。聚苯乙烯和硝化纖維素最為優(yōu)選。
可以采用的顆?；|(zhì)包括聚苯乙烯、膠乳、尼龍、磁珠、玻璃、瓊脂糖和瓊脂糖。串珠狀聚苯乙烯和膠乳較為優(yōu)選。
如上所述的溶液測定法，對(duì)GCFIgA水平的目視定量測定是通過將GCF樣品的比色反應(yīng)強(qiáng)度與代表GCFIgA水平范圍的一系列顏色標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行比較而確定的。
可以按下述方法建立一系列顏色標(biāo)準(zhǔn)對(duì)包括IgA濃度范圍已知的多個(gè)標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)樣品進(jìn)行一系列比色測定，然后通過使顏色標(biāo)準(zhǔn)與強(qiáng)度和/或吸收相對(duì)照以建立這些顏色標(biāo)準(zhǔn)。這些顏色標(biāo)準(zhǔn)可以呈能代表一定范圍的顏色強(qiáng)度/吸收的某種形式的圖，所述的顏色強(qiáng)度/吸收相應(yīng)于一個(gè)在試驗(yàn)樣品中可以發(fā)現(xiàn)的很寬范圍的IgA濃度。
測量試驗(yàn)樣品中由GCF而來的IgA的另一個(gè)方法是放射免疫測定法(RIA)。Nerenberg和Prasad，MethodsinEnzymology，73，IMMUNOCHEMICALTECHNIQUESPartB，第666-691(1981)中介紹了此方法的一個(gè)例子，在此引入此文以供參考。
測量GCFPMN標(biāo)志的方法活化的PMN存在的標(biāo)志包括β-葡萄糖醛酸酶、水解酶、彈性硬蛋白酶、組織蛋白酶(如組織蛋白酶G和組織蛋白酶B/L)，以及反映PMN早期活化活動(dòng)的明膠酶、酶髓過氧化物酶及其代謝產(chǎn)物(如LTB4或LTC4)。優(yōu)選的PMN標(biāo)志為β-葡萄糖醛酸酶(BG)和彈性硬蛋白酶。
可以用各種方法測定BG，這些方法包括(但不限于)比色法和熒光分析法。
LamsterⅡ中介紹了測量BG的比色法。這些比色測定法包括測量從酚酞葡糖醛酸中釋放出的苯基酞。可以用這些測定法來定性及定量地確定GCFBG的水平，比如用分光光度法或采用目視測定法。
可以用分光光度法來確定GCFBG的水平，步驟包括將一個(gè)等分量(50ul)的試驗(yàn)樣品加入到100ul的0.075M的乙酸鹽緩沖液(pH4.5)、50ul的0.15MNaCl鹽水和50ul的0.03M的酚酞葡糖醛酸(pH4.5)，并且在56℃下培養(yǎng)2小時(shí)。加入350ul的0.1M2-氨基-2-甲基-1-丙醇緩沖液(pH11)以終止反應(yīng)。測量在550um處相對(duì)于試劑空白的吸收，并且與一個(gè)酚酞標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行對(duì)照。用這些結(jié)果來計(jì)算每個(gè)GCF試驗(yàn)樣品中BG的水平。
可以用目視測定法通過一種改進(jìn)了的上述的分光光度測定法來確定GCFBG的水平。具體地說，可以按上述方法分析試驗(yàn)樣品，直到加入2-氨基-2-甲基-1-丙醇緩沖液為止。同時(shí)，將目視的顏色吸收/強(qiáng)度與代表BG標(biāo)準(zhǔn)曲線的吸收/強(qiáng)度范圍的顏色圖進(jìn)行比較。將試驗(yàn)樣品的目視顏色強(qiáng)度/吸收值與標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行對(duì)照;以給出GCF試驗(yàn)樣品中BG的水平。
對(duì)上述試驗(yàn)的一個(gè)進(jìn)一步的改進(jìn)是用產(chǎn)色底物對(duì)硝基苯基β-D-葡糖苷酸代替酚酞葡糖醛酸。在這種情況下，水解時(shí)BG所釋放出的黃顏色可做為試驗(yàn)樣品中BG水平的一個(gè)量度。
可用熒光測定分析法對(duì)GCFBG進(jìn)行定量分析，如Pope，M.等人在J.DentalResearch，70，Abstract704，1991年4月中所述，在此引入該文以供參考。熒光分析測定法包括對(duì)熒光分子的β-葡糖醛酸衍生物所釋放出的熒光副產(chǎn)品進(jìn)行分光光度/目視測量。對(duì)BG的熒光測定法已可用于其他用途。這些測定法見Papasian等人的“用一種產(chǎn)熒光的β-D-葡糖醛酸酶測定法對(duì)大腸桿菌的快速鑒定，DIAG.MICROBIOL.INFECT.DIS.，8(4)，第255-8，(1988年12月)，在此引入以供參考。如LamsterⅡ中所述，通過用產(chǎn)熒光的前體底物4-甲基7-羥基香豆素基-β-D-葡糖醛酸化物代替酚酞葡糖醛酸，然后通過BG釋放出的熒光副產(chǎn)品(4-甲基-7-羥基香豆素)的量評(píng)價(jià)BG的水平，可以將這些技術(shù)用于檢測GCF中的BG。測定所釋放出的熒光副產(chǎn)品水平的方法是將待測物暴露在360nm紫外光下，并且將所得的熒光強(qiáng)度與包括已知BG濃度的各種試驗(yàn)樣品標(biāo)準(zhǔn)曲線所顯示的強(qiáng)度進(jìn)行比較。
通過采用一種酶俘獲測定法，也可以檢測出GCFBG的水平。這些方法的例子見Holt等人的《用于快速檢測特蠣中大腸桿菌的酶俘獲測定法》，55，(1)，第229-32，(1989年1月)，在此引入以供參考。將這種技術(shù)應(yīng)用于檢測試驗(yàn)樣品中GCFBG的步驟包括制備對(duì)人類BG(與大腸桿菌BG相反)的抗體制劑，并且將抗人類BG抗體制劑附著在一個(gè)微滴定板或其他適當(dāng)?shù)谋砻?。隨后，與LamsterⅡ中所述的情況相同，加入試驗(yàn)樣品并且進(jìn)行培養(yǎng)。
可以用各種方法來測定GCF彈性硬蛋白酶的含量，這些方法包括(但不限于)比色測定、ELISA以及熒光分析法。一般而言，這些測定法包括從被彈性硬蛋白酶特異的水解的衍生肽中釋放出產(chǎn)色的或產(chǎn)生熒光的化合物。
可以用比色和熒光測定法來定量確定GCF彈性硬蛋白酶的水平，比如，通過分光光度法及通過目視測定法。
熒光分析法包括對(duì)從熒光分子的肽基衍生物釋放出的熒光副產(chǎn)品進(jìn)行分光光度/目視測量。各種測量GCF彈性硬蛋白酶水平的熒光分析法見Cox，S.W.和EleyB.M.，用7-氨基-4-三氟甲基香豆素的肽基衍生物檢測牙周炎患者的齦縫流體中組織蛋白酶B-和L、彈性硬蛋白酶、類胰蛋白酶、胰蛋白酶及二肽基肽酶Ⅳ類活性，J.PERIO.RES.，(24)，353-361，(1989)(以后稱為CoxⅠ)以及在Cox等人的“用于測定齦縫流體中的蛋白酶的一種簡便的組合的產(chǎn)熒光的和產(chǎn)色的方法，J.PERIO.RES.，(25)，164-171，(1990)(以后稱為CoxⅡ)，在此引入這兩篇文獻(xiàn)以供參考)。
測量GCF樣品中PMN彈性硬蛋白酶水平的適用的比色分析法見CoxⅡ，AsmanB.，PeripheralPMNcellsinJuvenilePeriodontitis;IncreasedReleaseofElastaseandofOxygenRadicalsafterStimulationwithOpsonizedBacteria.，J.CLIN.PERIODONTOL.，(15)，360-364，(1988)(以后稱為Asman)，以及Kramer等人的“MeasurementofFreeHumanLeukocyteElastase/alpha-1ProteinaseInhibitorComplexedbyanEnzyme-LinkedImmunosorbentAssay”，J.IMMUNOLOGICALMETHODS，(131)，41-48，(1990)(以后稱為Kramer)，SuomalainenK.的“CharacteristicsofNeutralProteasesinInflamedHumanGingiva”，SCAND.J.DENT.RES.，(97)，346-354，(1989)(以后稱為Soumalainen)，以及Palcanis，在此引入這些文獻(xiàn)中的每一篇文獻(xiàn)以供參考。
GCFIgA/PMN標(biāo)志比的確定可以計(jì)算某個(gè)患者或某個(gè)部位的GCFIgA/MPN標(biāo)志比。為確定某一個(gè)別患者患牙周炎危險(xiǎn)的等級(jí)，需確定取自每個(gè)有關(guān)部位的每個(gè)GCF樣品的GCFIgA和PMN標(biāo)志的水平，并且隨后確定取自每個(gè)有關(guān)部位的每個(gè)GCF樣品的GCFIgA/PMN標(biāo)志比。反過來，可以計(jì)算取自口腔中所有試驗(yàn)部位的GCF樣品的IgA/PMN標(biāo)志比的平均值，得到對(duì)于給定的患者的IgA/PMN標(biāo)志比。
GCFIgA/PMN標(biāo)志比的絕對(duì)值是所測的特定的PMN標(biāo)志、所用的檢測系統(tǒng)以及用于表示這些結(jié)果的單位的函數(shù)。GCFIgA可以表示為GCF中所存在的IgA的質(zhì)量(如ng/樣品)、每個(gè)樣品的ELISA單位的總數(shù)(如吸收單位)、每個(gè)樣品的RIA單位或用于目視ELISA測定的標(biāo)準(zhǔn)標(biāo)度的分值。例如，PMN標(biāo)志、BG和彈性硬蛋白酶可以表示為酶單位/樣品，或表示為用于目視酶俘獲測定的標(biāo)準(zhǔn)標(biāo)度的分值。采用IgAELISA單位(如每個(gè)樣品的吸收單位)將給出一個(gè)與采用每個(gè)樣品IgA的ng數(shù)不同的代表GCFIgA/BG比的絕對(duì)值。這些，對(duì)本發(fā)明的每個(gè)實(shí)施例而言，須將所述的計(jì)算結(jié)果校準(zhǔn)為特定的值以用于表示所檢測的IgA/PMN標(biāo)志的水平。
IgA/PMN標(biāo)志比的校準(zhǔn)測量IgA和PMN標(biāo)志的濃度的結(jié)果所參照的比較標(biāo)準(zhǔn)可以通過臨床試驗(yàn)來加以確定。一種獲得一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)的方法是要縱向評(píng)價(jià)正常的健康患者和牙周炎患者的群體以便根據(jù)各個(gè)IgA/PMN標(biāo)志比在隨后的臨床參數(shù)中變化校準(zhǔn)相應(yīng)的IgA/PMN標(biāo)志比。給定一個(gè)用于GCFIgA和PMN標(biāo)志濃度的定量化特定的裝置，可以采用從上述群體得到的IgA/PMN標(biāo)志比，估計(jì)統(tǒng)計(jì)標(biāo)準(zhǔn)方差，以便將某一標(biāo)志比范圍分成代表低、中、高活性牙周炎的發(fā)病率。
可以在研究過程中登記多個(gè)牙周健康患者組(即牙袋深度不超過4mm并且有關(guān)部位的附著損失不大于2mm)以及多個(gè)成人牙周炎患者組?？扇〉氖敲總€(gè)組中至少有10個(gè)患者較好;更可取的是每組中至少有40個(gè)患者。在每個(gè)患者的一系列預(yù)定的試驗(yàn)部位采集GCF樣品，可取的是每個(gè)患者至少采集2個(gè)部位時(shí)。更可取的是每個(gè)患者至少采集2個(gè)部位時(shí)更好。然后用上述一個(gè)或多個(gè)特定的測定方法(或其他方法)確定GCFIgA和PMN標(biāo)志的水平。然后對(duì)每個(gè)患者口腔中每個(gè)特定部位進(jìn)行基線臨床測量，如測量牙周附著水平或牙槽骨高度。然后可對(duì)患者進(jìn)行給定的常規(guī)牙周保持護(hù)理，如進(jìn)行刮牙和牙根修整，并且指導(dǎo)他們?cè)谝粋€(gè)標(biāo)準(zhǔn)時(shí)期(最好約6-12周)內(nèi)保持他們正常的口腔衛(wèi)生習(xí)慣。指定的時(shí)期過后，召集所有的患者，并且確定他們相應(yīng)的牙周附著損失水平。疾病進(jìn)程達(dá)到有意義的水平的那些患者和部位被認(rèn)為是活性疾病患者/部位。疾病進(jìn)程達(dá)到有意義的水平的標(biāo)志可以是損失增加，如至少一個(gè)部位的附著損失超過2mm并且/或骨損失達(dá)到一個(gè)可觀的水平(即損失大于所用的測量手段的統(tǒng)計(jì)偏差)。為確定將個(gè)體患者的比值所進(jìn)行比較的標(biāo)準(zhǔn)，計(jì)算患活性疾病的患者組和未患活性疾病的患者組GCFIgA/PMN標(biāo)志比的平均值。(以后將這些值分別稱為“活性組平均值”和“非活性組平均值”)。對(duì)于一個(gè)有效的標(biāo)準(zhǔn)，非活性組平均值與活性組平均值之間的差值必須大于它們的標(biāo)準(zhǔn)偏差之和。為確定將個(gè)體部位的比值所進(jìn)行比較的標(biāo)準(zhǔn)，另外還須計(jì)算患活性疾病的部位及未患活性疾病的部位的平均GCFIgA/PMN標(biāo)志比(以后稱這些值為“活性部位平均值”和“非活性部位平均值”)。對(duì)于一個(gè)有效的標(biāo)準(zhǔn)，非活性部位平均值與活性部位平均值之間的差別必須大于標(biāo)準(zhǔn)偏差之和。
其后，當(dāng)采用同樣的IgA和PMN標(biāo)志測定法時(shí)，將平均總的口腔IgA/PMN比值高于一個(gè)低于非活性組平均值的標(biāo)準(zhǔn)偏差的任何患者稱為低危險(xiǎn)患者。與此相似，將平均總的口腔IgA/PMN比值低于一個(gè)高于非活性組平均值的標(biāo)準(zhǔn)偏差的任何患者稱為高危險(xiǎn)患者。將那些平均總的口腔IgA/PMN比值在一個(gè)高于活性組平均值的標(biāo)準(zhǔn)偏差和一個(gè)低于非活性組平均值的標(biāo)準(zhǔn)偏差之間的患者稱為中等危險(xiǎn)患者。
與此相似，當(dāng)采用與用于確定活性和非活性部位手段相同的IgA和PMN標(biāo)志測定法時(shí)，將平均總的口腔IgA/PMN比值高于一個(gè)低于非活性組平均值的標(biāo)準(zhǔn)偏差的任何部位稱為低危險(xiǎn)部位。與此相似，將平均總的口腔IgA/PMN比值低于一個(gè)高于非活性組平均值的標(biāo)準(zhǔn)偏差的任何部位稱為高危險(xiǎn)部位。將那些平均總的口腔IgA/PMN比值在一個(gè)高于活性組平均值的標(biāo)準(zhǔn)偏差和一個(gè)低于非活性組平均值的標(biāo)準(zhǔn)偏差之間的部位稱為中等危險(xiǎn)部位。
診斷裝置本發(fā)明還涉及檢測或評(píng)價(jià)人類或較低等動(dòng)物中目前或以后患活性牙周炎的危險(xiǎn)率的診斷產(chǎn)品。這些診斷產(chǎn)品包括一個(gè)用于測量存在于所診斷的人類或較低等動(dòng)物口腔中一個(gè)或多個(gè)部位中的齦縫流體中所存在的IgA量的裝置和一個(gè)用于測量PMN標(biāo)志的量的裝置。
這類診斷產(chǎn)品的一個(gè)例子是用于檢測和評(píng)價(jià)人類或較低等動(dòng)物中的患者或部位疾病發(fā)展的危險(xiǎn)率的診斷用品。
一種用于確定患者/部位的IgA/PMN標(biāo)志比的診斷用品包括確定IgA和一種指定的PMN標(biāo)志的存在所必需的材料。
對(duì)分光光度ELISA分析而言，此診斷用品內(nèi)必須包括一種采集一個(gè)或多個(gè)GCF樣品的裝置以便可以得到IgA和PMN標(biāo)志中GCF水平的測量結(jié)果。為實(shí)現(xiàn)此目的，所述的用品可包括多個(gè)預(yù)先切割好的濾紙塊、毛細(xì)管、毛細(xì)吸管、微量吸管、沖洗齦縫的試劑(例如，與微珠、凝膠或磁性顆粒交聯(lián)以從齦縫中收集IgA和BG的特定的抗體)。
為分析IgA，用品可包括容器、試管、培養(yǎng)管、試劑瓶以及含有緩沖鹽水溶液的微型離心管，所述的緩沖鹽水溶液包括必要的試劑并且/或者為檢測GCFIgA的存在所制備的樣品和所進(jìn)行的測定都是在這些溶液中完成的。這些組分可包括緩沖范圍為pH＝6.6-7.4的磷酸鹽(0.001-0.1M)、NaCl(0.10-0.20N)以及吐溫(0.01-.10%)(即PBST)，并且PBST溶液包括必要的試劑和產(chǎn)色底物。最好PBST包括0.01M的磷酸鹽緩沖劑(pH＝7.01)、帶0.05%吐溫的鹽水(0.15NNaCl)。
診斷用品還可包括進(jìn)行測定所需的培養(yǎng)容器。適用的培養(yǎng)容器可包括試管、培養(yǎng)管、小杯和微滴定板。優(yōu)選的培養(yǎng)容器為微滴定板。培養(yǎng)容器為96凹坑的聚苯乙烯微滴定板更好，比如可以是Nunc型免疫板1(丹麥的Roskilde)。
診斷用品還可包括一個(gè)用于從試驗(yàn)樣品中俘獲IgA并且在ELISA(如抗血清)的發(fā)育過程中把它保持在微滴定井的底部的裝置。適用的抗血清可包括非人類的抗人類IgA“俘獲”抗體，如多克隆或單克隆抗IgA抗體制劑，它對(duì)IgA特異并且人類IgG、IgM、IgE或IgD交叉反應(yīng)?？寡迦∽苑庆`長類較好，最好取自山羊抗人類IgA。更為優(yōu)選的是山羊IgG抗人類IgA抗血清和一種碳酸鹽/碳酸氫鹽緩沖溶液(最好為pH9.6的0.1M的緩沖溶液)。在4℃下將俘獲抗體在多個(gè)微滴定板中的碳酸氫鹽緩沖溶液中培養(yǎng)48小時(shí)，以使俘獲抗體附著在微滴定板凹坑的底部。
診斷用品中可能需要包括一種被誘導(dǎo)的抗血清以利于檢測由俘獲抗體所保持的IgA。最好被誘導(dǎo)的抗血清為上述的那類未標(biāo)志的抗血清。適用的標(biāo)志可包括酶標(biāo)志(如辣根過氧化物酶、堿性磷酸酯酶或脲酶)、生物素標(biāo)志、放射標(biāo)志和熒光標(biāo)志。優(yōu)選的抗血清為辣根過氧化物酶標(biāo)志的山羊IgG抗人類IgA。
如果所述的用品包括一種生物素標(biāo)志的抗IgA抗血清，那么在PBST緩沖溶液中還可包括一種抗生物素蛋白標(biāo)志的軛合物?？股锼氐鞍讟?biāo)志的軛合物特異地與抗生物素結(jié)合并且使得可用IgA和俘獲抗體檢測生物素標(biāo)志的抗IgA抗血清復(fù)合物。在軛合物中的抗生物素蛋白上的適用的標(biāo)志包括酶標(biāo)志(如帶有辣根過氧化物酶、堿性磷酸酯酶的酶標(biāo)志)、放射標(biāo)志和熒光標(biāo)志。優(yōu)選的抗生物素蛋白標(biāo)志的軛合物是一種抗生物素蛋白酶軛合物，最好是一種抗生物素蛋白-辣根過氧化物酶軛合物。
為通過產(chǎn)生一種可見的色基而檢測IgA俘獲抗體復(fù)合物，診斷用品還可包括一種含有一種生色團(tuán)體系的緩沖溶液。適用的生色團(tuán)體系包括正鄰苯二胺和對(duì)硝基苯酚磷酸酯。如果緩沖液包括鄰苯二胺，那么它還可包括約0.01%-1%的過氧化氫。
為使pH值保持在一個(gè)人類PMN標(biāo)志實(shí)現(xiàn)最佳的酶機(jī)能相一致的范圍，診斷用品可包括一種緩沖溶液。適用的緩沖包括pKa處于pH4.9周圍0.5pH單位的緩沖溶液，比如一種乙酸鹽緩沖溶液。優(yōu)選的緩沖溶液是醋酸鈉緩沖溶液。如果采用的是乙酸鹽，優(yōu)選的濃度在約0.01M-約0.5M之間。緩沖溶液優(yōu)選的pH在約4.5-約5.5之間，最好在約4.9左右。
診斷用品還可包括一種可與聚苯乙烯或其他固體支持器(如濾紙、硝化纖維素、凝膠、微膠囊或微珠)連接的抗血清β-葡糖醛酸酶抗體。優(yōu)選的情況是，抗人類BG抗體連接到聚苯乙烯上，連接到聚苯乙烯微滴定板上更好。
為檢測人類BG的存在，用品還可包括一種用于人類BG的產(chǎn)色底物。這類底物包括β-D-葡糖醛酸的軛合物，如酚酞葡糖醛酸，4-硝基苯基β-D-葡糖苷酸以及4-甲基-7-羥基香豆素基-β-D-葡糖苷酸。優(yōu)選的底物為酚酞葡糖醛酸。如果用品中包括了酚酞葡糖醛酸，最好以pH為約4.5至約5.5的狀態(tài)提供這種酸。
診斷用品還可包括一種鹽水溶液，以便用這種溶液在IgA的ELISA測定法的各個(gè)培養(yǎng)步驟之間沖洗來自ELISA板的試劑。適用的鹽水沖洗溶液包括磷酸鹽緩沖的鹽水吐溫溶液。
也可以將一種HCl溶液加入到ELISA反應(yīng)中，以便在用分光光度測定法讀取吸收值時(shí)使反應(yīng)終止。這些，用品還可包括一種HCl溶液，用它來終止ELISA測定工作。所述的HCl溶液最好為濃度約為0.1M的溶液。
為終止BG的測定，用品中有必要包括一種緩沖劑。適用的緩沖劑包括氨基醇，如2-氨基-醇。優(yōu)選的緩沖劑為2-氨基-2-甲基-1-丙醇。優(yōu)選的緩沖液為濃度為約0.01M至約1M的水溶液，濃度為約0.1M更好。緩沖液的pH值為約9-至13，為約11更好。
在診斷用品中包括這些用于相應(yīng)測定的標(biāo)準(zhǔn)曲線是有用的。這些標(biāo)準(zhǔn)曲線可以將用例如吸收單位和色強(qiáng)度獲得的相應(yīng)的IgA和PMN標(biāo)志測定的數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換成試驗(yàn)樣品中的IgA和PMN標(biāo)志的水平。因此，用相應(yīng)的測定單位(例如吸收單位和色強(qiáng)度)的數(shù)據(jù)可以表示為水平或濃度(例如IgA為mg/ml或μg/μl或PMN標(biāo)志活性為單位/ml)(例如吸收單位或色強(qiáng)度)的函數(shù)。標(biāo)準(zhǔn)曲線可以通過制備代表GCF中IgA和PMN標(biāo)志濃度的整個(gè)范圍的標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)溶液，然后通過進(jìn)行相應(yīng)的IgA和PMN標(biāo)志的比色測定并且將結(jié)果圖示的方式測定那些標(biāo)準(zhǔn)溶液來得到。這樣的曲線可以表示為對(duì)應(yīng)于標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)測定的吸收值的圖形，這個(gè)圖形作為相應(yīng)的測定結(jié)果對(duì)由附加到相應(yīng)的試驗(yàn)樣品上的等級(jí)所表示的IgA和PMN標(biāo)志的濃度的關(guān)系曲線。
方法和診斷用品的例子下列非限定性例子以舉例的方式說明了本發(fā)明內(nèi)容的相應(yīng)的方法和診斷用品。
例1下面是本發(fā)明方法的一個(gè)代表性的例子。
測定患活性疾病的危險(xiǎn)率的分光光度法包括首先在每個(gè)牙周炎患者的16-20個(gè)部位采集GCF樣品。采集工作是按照LamsterⅡ中所述的操作進(jìn)行的。
隨后是按照Sengupta中所述的方法對(duì)GCFIgA水平的分光光度分析;按照LamsterⅡ中所述的方法對(duì)GCFBG水平的分光光度分析。然后計(jì)算IgA/部位的平均值(如每30秒所采集的GCF中IgA的ng數(shù))以及BG/部位的平均值(如每30秒所采集的GCF中BG活性的單位)。再計(jì)算每個(gè)患者IgA/BG比的平均值[(即對(duì)每個(gè)目標(biāo)準(zhǔn)(平均的IgA/部位)/(平均的BG/部位)]。
舉例來說，用上述方法從一個(gè)患者(“MG”)采集GCF，然后測定該患者的平均IgA/GCF樣品/部位為45ng，而平均BG/GCF樣品/部位為2.3單位。再通過計(jì)算確定該患者M(jìn)G的平均IgA/BG比為19.6。
采用與上述相同的分光光度測定法進(jìn)行的臨床研究表明，患活性牙周炎的患者的平均IgA/BG比為21.1±7.2;而沒有出現(xiàn)附著損失的患者的平均IgA/BG比為125.2±46.6。
用臨床研究結(jié)果作為標(biāo)準(zhǔn)，并且將MG比值與所述標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行比較，患者M(jìn)G的IgA/BG比值低于上述的那些患活性牙周炎的目標(biāo)值的平均值的一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)偏差。這樣，MG患者處在患活性牙周炎的高危險(xiǎn)率區(qū)(或然率大于80%)。
例Ⅱ下面是說明本發(fā)明方法的另一個(gè)例子，并且是對(duì)IgA和BG測定的一種目視定量方法。
按照LamsterⅡ中所述方法采集GCF;按照Sengupta所述方法進(jìn)行GCFIgA的測定，所不同的是通過將所測定的溶液的顏色的改變與代表GCFIgA濃度范圍的一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)系列的顏色強(qiáng)度進(jìn)行比較來評(píng)價(jià)產(chǎn)色反應(yīng)。
用LamsterⅡ中所述方法來進(jìn)行GCFBG的分析，所不同的是通過將所測定的溶液的顏色的改變與代表在人類GCF中所發(fā)現(xiàn)的GCFBG水平的范圍內(nèi)BG產(chǎn)色反應(yīng)的一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)系列的顏色強(qiáng)度進(jìn)行比較來評(píng)價(jià)BG的水平。
這些比較顏色改變的顏色標(biāo)準(zhǔn)是通過對(duì)一系列試驗(yàn)樣品進(jìn)行IgAELISA和BG酶測定而得到的。每個(gè)試驗(yàn)樣品包括不同的已知濃度的IgA和BG，以及代表一個(gè)寬范圍IgA和BG濃度的系列物。然后將每個(gè)相應(yīng)的樣品的產(chǎn)色的顏色反應(yīng)與包括適當(dāng)?shù)娜玖系膫€(gè)別的溶液相對(duì)照以得到一系列與所試驗(yàn)的IgA和BG樣品顏色相同的溶液，進(jìn)而得到一系列代表不同IgA和BG濃度的有色溶液。此系列溶液是同從待估價(jià)牙周炎發(fā)病危險(xiǎn)率的患者所采集的GCF樣品所進(jìn)行的產(chǎn)色的顏色反應(yīng)測定結(jié)果相比較的顏色強(qiáng)度標(biāo)準(zhǔn)。
通過將由所測的GCF樣品所得的IgA和BG顏色強(qiáng)度與一個(gè)基質(zhì)表上的相應(yīng)的顏色標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行對(duì)照，可以確定IgA/BG比，所述的矩陣表的Y軸代表人類GCF中所發(fā)現(xiàn)的BG濃度的增加，其X軸代表IgA濃度的增加。由相應(yīng)的“X”和“Y”值所確定的矩陣表上的點(diǎn)落在一個(gè)危險(xiǎn)率將為高、中等或低的區(qū)域中;代表低IgA/BG比的、離Y軸較低的三角形區(qū)域代表較高的危險(xiǎn)率。
例Ⅲ下面是本發(fā)明的一個(gè)用品的一個(gè)有代表性的例子。
一個(gè)用于IgA/BG分析的分光光度用品被指定與一個(gè)微滴定板讀出器和一個(gè)分光光度計(jì)一同使用以便讀出測定結(jié)果。
為了采集GCF，用品包括20個(gè)預(yù)裁好的濾紙帶。
為了分析GCFIgA部分，用品包括20個(gè)包括PBST(0.01M磷酸鹽緩沖的、pH為7.01的0.15N的NaCl鹽水，帶0.05%的吐溫)的微離心管50mlPBST沖洗溶液;4個(gè)微滴定板;10ml在0.1MpH為9.6的碳酸鹽/碳酸氫鹽緩沖劑中稀釋成1∶256000的山羊抗人類IgA抗血清;10ml過氧化物酶標(biāo)志的山羊抗人類IgA，在PBST緩沖劑中稀釋為1∶4000;10ml的0.1M包括30mg鄰苯二胺與0.3%過氧化氫的檸檬酸鹽緩沖溶液;10ml的0.1MHCl溶液，以及一個(gè)IgA測定用的標(biāo)準(zhǔn)曲線。
為了測定BG部分，用品包括10mlpH為4.9的0.075M乙酸鹽緩沖溶液;5mlpH為4.5的0.03M酚酞葡糖醛酸溶液;5ml0.15N的NaCl鹽水溶液;50mlpH為11的0.1M的2-氨基-2-甲基-1-丙醇緩沖溶液;以及一個(gè)用于測定BG的標(biāo)準(zhǔn)曲線。
用品還包括一個(gè)矩陣表，其中所標(biāo)定的X軸代表IgA水平的增加，所標(biāo)定的Y軸代表在人類GCF中所發(fā)現(xiàn)的BG水平的增加，并且該表具有為表示出在高、中等和低危險(xiǎn)率意義的標(biāo)志區(qū)域中上面有相應(yīng)的IgA和BG坐標(biāo)限定點(diǎn)的標(biāo)志的表區(qū)域。
例Ⅳ下面是本發(fā)明的一個(gè)用品的另一個(gè)有代表性的例子。
用于分析IgA/彈性硬蛋白酶比的分光光度用品包括GCF采集部分20個(gè)預(yù)裁好的濾紙帶。
GCFIgA分析部分20個(gè)包括PBST(0.01M磷酸鹽緩沖的、pH為7.01的0.15N的NaCl鹽水，帶0.05%的吐溫)的微離心管;50mlPBST沖洗溶液;4個(gè)微滴定板;10ml在0.1MpH為9.6的碳酸鹽/碳酸氫鹽緩沖劑中稀釋成1∶256000的山羊抗人類IgA抗血清;10ml過氧化物酶標(biāo)志的山羊抗人類IgA，在PBST緩沖劑中稀釋為1∶4000;10ml的0.1M包括30mg鄰苯二胺與0.3%過氧化氫的檸檬酸鹽緩沖溶液;10ml的0.1MHCl溶液，以及一個(gè)IgA測定用的標(biāo)準(zhǔn)曲線。
彈性蛋白酶測定部分2ml的TST緩沖溶液(50mM的TrisHCl，pH為7.0，0.15NaCl以及1%的三硝基甲苯X-100;如CoxⅡ中所述)，2個(gè)白色塑料盤;40個(gè)6mm直徑的Whatman3MM紙盤，用一種彈性硬蛋白酶底物(即溶于50mMTrisHCl中的250μM的甲氧基琥珀酰-Ala-Ala-Pro-Val-7-氨基-4-三氟甲基香豆素，pH為9.0，以及350mMNaCl和5%的二甲基甲酰胺并且干燥一整夜)浸漬過;以及1ml溶于1.0N的HCl中的1%的對(duì)二甲氨基肉桂醛。
然后將相應(yīng)樣品的產(chǎn)色的顏色反應(yīng)同含有適當(dāng)?shù)娜玖系娜芤合鄬?duì)照以得到一系列與所試驗(yàn)的IgA和彈性硬蛋白酶樣品同樣顏色的溶液，進(jìn)而得到一系列代表不同濃度的IgA和彈性硬蛋白酶的有色溶液。這個(gè)系列溶液就是同對(duì)取自危險(xiǎn)率待測的患者的GCF樣品所做的產(chǎn)色的顏色反應(yīng)測定所得結(jié)果所以比較的顏色強(qiáng)度標(biāo)準(zhǔn)。
確定IgA/彈性硬蛋白酶比的方法包括將由所測定的GCF樣品得到的IgA和彈性硬蛋白酶顏色強(qiáng)度與相應(yīng)的在一個(gè)基質(zhì)臺(tái)上的顏色標(biāo)準(zhǔn)相對(duì)照，所述的基質(zhì)臺(tái)的Y軸代表人類GCF中所發(fā)現(xiàn)的彈性蛋白酶濃度的增加，并且X軸代表IgA濃度的增加。由坐標(biāo)所確定的基質(zhì)臺(tái)上的點(diǎn)落在一個(gè)將在確定為高、中等或低危險(xiǎn)的區(qū)域中;越靠近Y軸的區(qū)域危險(xiǎn)率越高。
權(quán)利要求
1.一種檢測或評(píng)價(jià)目前或以后患活性牙周炎的危險(xiǎn)率的方法，包括a)采集齦縫流體；b)測量齦縫流體中IgA的含量；c)測量齦縫流體中多形核白細(xì)胞的標(biāo)志的含量；d)將從步驟(b)和(c)所得的量的比與一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行比較。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其中IgA為總血清形IgA，并且多形核白細(xì)胞的標(biāo)志為β-葡萄糖醛酸酶。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其中IgA為總血清形IgA，并且多形核白細(xì)胞的標(biāo)志為彈性硬蛋白酶。
4.一種用于檢測或評(píng)價(jià)目前或以后患活性牙周炎的危險(xiǎn)率的用品，包括(a)一個(gè)用于測量一個(gè)或多個(gè)齦縫流體樣品中IgA的量的裝置;(b)一個(gè)用于測量一個(gè)或多個(gè)齦縫流體樣品中多形核白細(xì)胞標(biāo)志的量的裝置;以及(e)一個(gè)由步驟(a)和(b)的裝置所確定的量的比值所進(jìn)行比較的標(biāo)準(zhǔn)。
5.如權(quán)利要求4所述的用品，其中測量多形核白細(xì)胞標(biāo)志的量的裝置是一個(gè)測量β-葡糖醛酸酶的裝置。
6.如權(quán)利要求4所述的用品，其中測量多形核白細(xì)胞標(biāo)志的量的裝置是一個(gè)測量彈性硬蛋白酶的裝置。
全文摘要
本發(fā)明涉及檢測或評(píng)價(jià)目前或以后患活性牙周炎的危險(xiǎn)率的方法和用品，包括(a)采集齦縫流體；(b)測量齦縫流體中IgA的量；(c)測量齦縫流體中多形核白細(xì)胞的標(biāo)志的量；(d)將從步驟(b)和(c)所得的量的比與一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行比較。
文檔編號(hào)G01N33/68GK1093168SQ9311933
公開日1994年10月5日 申請(qǐng)日期1993年9月18日 優(yōu)先權(quán)日1992年9月18日
發(fā)明者R·E·辛格 申請(qǐng)人:普羅格特-甘布爾公司