專利名稱：利用光散射技術(shù)的多部分鑒別分析裝置的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明總地來說涉及微粒分析裝置，更具體地說是涉及通過Coulter類型的技術(shù)而不利用細胞化學染色技術(shù)或材料來達到單個血細胞類型(例如白細胞的五種基本類型)的選擇，區(qū)分和鑒別分類的裝置和方法。
眾所周知，利用流動細胞計數(shù)儀而不使用細胞化學染色，白細胞可被鑒別和劃分為三個主要類型即淋巴細胞，單核細胞和粒細胞。有一種這樣的方法包括使用低角度光散射與90°或高角度光散射相結(jié)合。某些方法利用了一種溶解試劑來從全血稀釋液中除掉不需要的紅細胞，其它方法則依靠密度或離心技術(shù)，如利用ficolpague的單位比重分離法，其中ficolpague是合成多糖聚合物與(例如)泛影酸鈉鹽的混合物;或用葡聚糖分離，或用淺黃層技術(shù)，該淺黃層是指全血經(jīng)離心后在頂層血小板和底層紅細胞之間的淺黃層白細胞;等等。此外，某些方法利用細胞化學染色以便進一步細分按其免疫功能定義的淋巴細胞子類。
授予S·L·Ledis和H·R·Crews並轉(zhuǎn)讓給Coulter電子公司(Hialeah，F(xiàn)lorida)的PCT專利PCT/US85/00868號中描述了一個系統(tǒng)和技術(shù)，它利用試劑系統(tǒng)產(chǎn)生出被稱為四種群鑒別的結(jié)果，其方式是將紅細胞有效地從樣本中除掉，由于溶解以及必要時的固定處理，使粒細胞的一個子群(即嗜酸性細胞)被分離出來，與其相對比，以上描述的技術(shù)中只有三個種群可被看出或顯現(xiàn)出來，隨后嗜酸性細胞就與其它子群不能區(qū)別了。
先有技術(shù)中描述了一種獲得四部分白細胞鑒別(淋巴細胞、單核細胞、中性白細胞和嗜酸性細胞)的方法和裝置，它是通過將細胞進行細胞化學染色並經(jīng)過低角度光散射和吸收的結(jié)合而產(chǎn)生出四個互不相同的群。吸收是軸向光損失的一個分量。
同樣，如美國專利3，502，974號專利中所揭示的技術(shù)中是將電“混濁度”作為檢測特定細胞或細胞群的一個獨立的參數(shù)來描記，這三個種群仍然被鑒別出並被很好的限定和分離開。然而，在這種情況下，粒細胞子群的中性白細胞，嗜酸細胞，嗜堿細胞是在粒細胞群數(shù)據(jù)之內(nèi)，它隱藏並掩蓋了這三種細胞使其不能鑒別。
先有技術(shù)的文獻，科學論文和報告中說明、描述和討論了以相對于所利用的光束軸線的不同角位置上利用光散射技術(shù)夾照射和探查樣本。然而，到目前可獲得和考慮的大多數(shù)文獻材料都將相對于光軸的光線夾角限制為0°-23°或90°，或二者並存。
本發(fā)明提供了一種新的、有用的、到目前為止非顯而易見的生物細胞計數(shù)、測量和鑒別的方法和裝置，用于將生物細胞樣本中的細胞類型高速、精確地分析和彼此分離開。
總地來說，本發(fā)明提供了一種結(jié)構(gòu)上的結(jié)合，其中一個生物樣本以流體動力聚焦的微粒流的形式進入和通過一個點聚焦的電磁輻射能的波束(激光)。相對于激光能量的軸線適當定位的光響應裝置提供了表明每個細胞通過的光輸出脈沖。在流體流動通道內(nèi)的電傳導觸點提供了附加的電脈沖輸出作為每個細胞的CoulterDC體積和RF/DCCoulter混濁度探查的結(jié)果。
利用適當?shù)碾娮泳€路可將這些輸出脈沖或信號結(jié)合起來以限定出至少五種不同類型的白細胞，將每一種細胞類型與另一類型有效地區(qū)分開，盡管事實上某些統(tǒng)計學上不普遍的細胞子群可能被它們的總的細胞類型所掩蓋或隱藏。
本發(fā)明還涉及了只利用光散射技術(shù)以及與Coulter類型的DC和RF技術(shù)相結(jié)合而產(chǎn)生的多個生物細胞類型的一個或多個數(shù)據(jù)表示。
更確切地說，本發(fā)明提供了利用從光響應脈沖發(fā)生組件導出的信息或數(shù)據(jù)的新型裝置和方法，該組件被安排在一個被遮掩的激光束的輸出區(qū)域，其相對于激光軸線的角度范圍是從大約10°到大約70°，以下將其稱為中角度光散射MALS。
本申請涉及下列專利和/或申請，並通過對其引證將其揭示出的本申請所依據(jù)的附加說明性細節(jié)結(jié)合在此，其中這些細節(jié)已被說明是必須的和所需要的。題為“從全血樣本中分離，確認和/或分析白細胞的方法及試劑系統(tǒng)”，美國專利申請?zhí)?7/025，303，1987年3月13日提交，申請人為StephenL，Ledis等人，已轉(zhuǎn)讓給本申請的受讓人。共同未決的美國專利申請，申請?zhí)枮?7/025，337，申請日1987年3月13日，申請人WallaceH·Coulter等人，題為“快速混合小容量以加強生物反應的方法和裝置”。美國專利申請?zhí)?6/921，654，申請日1986年10月21日，申請人WallaceH·Coulter等人，題為“測量微粒的電阻和電抗的微粒分析器”，已轉(zhuǎn)讓給本申請的受讓人。
從本世紀五十年代早期的構(gòu)思開始，由WallaceH·Coulter發(fā)明的微粒計數(shù)和量尺寸的原理已經(jīng)產(chǎn)生了用于顯微顆粒的電子計數(shù)、量尺寸、研究和分析的多種方法和流過式裝置。這些微粒是在懸浮液中被掃描，如授予Coulter的開創(chuàng)性美國專利2，656，508中所示。在這一先有技術(shù)的安排當中，通過在兩個腔中的懸浮液內(nèi)的懸浮電極在兩個容器或小室之間建立一個直流電流。兩個腔體之間唯一的流體連系是通過一個孔;因此，在該孔內(nèi)建立起一個電流和電場。該孔和在其內(nèi)部和周圍所造成的電場構(gòu)成一個傳感區(qū)。當每個微粒通過該傳感區(qū)時，在其通過的時間內(nèi)，傳感區(qū)內(nèi)容的阻抗將改變，由此而調(diào)制了傳感區(qū)內(nèi)的電流和電場並導致一個信號的產(chǎn)生，該信號被施加到經(jīng)適當安排以響應于這一變化的一個檢測器上。
授予W·H·Coulter和W·R·Hogg，並轉(zhuǎn)讓給Coulter電子公司(Hialeah，F(xiàn)lorida)的3，502，974號美國專利中描述了微粒分析裝置，該裝置響應于通過一個顯微通道的流體懸浮微粒而產(chǎn)生並檢測出作為這種流通結(jié)果的信號。將這些信號同由于微粒的通過在通道中引起的電流變化相聯(lián)系，並且這些變化中主要包括反應微粒的物理特性的電阻和電抗的電流分量。通道中的電流是由至少是射頻的而最好再與另一個不同頻率相結(jié)合的電流激勵裝置來提供;然而，任何兩個不同的頻率都可適用，以便這些信號因為它們在頻譜中的位置和/或它們的相位關(guān)系而彼此可分離開。對每一個微粒至少要導出兩個結(jié)果信號並且要能夠使其用于確定每個微粒的一項以上的物理特性，這樣即使同樣大小但不同實質(zhì)的微粒都可被分離檢測出來。
授予W·H·Coulter和W·R·Hogg，並轉(zhuǎn)讓給Coulter電子公司(Hialeah，F(xiàn)lorida)的3，502，973號美國專利(3，502，974號美國專利的部分繼續(xù)申請)描述的裝置中具有由于從前一Coulter類型的微粒分析裝置接收脈沖串的兩個頻道，每個脈沖一般均具有一個由同一微粒在該微粒分析裝置中產(chǎn)生的伴隨脈沖，並且其配有的裝置可用于獲得代表脈沖間關(guān)系的信號。在幾種實施方案中，一個脈沖要根據(jù)特定的因數(shù)進行衰減，然后與一個閾值電路的信號相比較，這樣只有特定范圍的脈沖將產(chǎn)生輸出信號。在其它的實施方案中，利用成對的閾值來形成電子窗口，每對中的一個信號在兩個衰減器中經(jīng)過衰減處理以提供限定一個給定范圍的兩個信號。只有落入該范圍的關(guān)系可產(chǎn)生輸出信號。
授予W·H·Coulter並轉(zhuǎn)讓給Coulter電子公司(Hialeah，F(xiàn)lorida)的4，527，114號美國專利描述了一種微粒分析裝置，它包括一個具有流動室的流動單元，室內(nèi)有一個攜帶了單個微粒的懸浮液流沿著一個預定的通道前進;一對電極被置于該預定通道的相對兩側(cè)，其中一個電極一端的寬度平行于該預定通道，其長度小于一個給定微粒的長度，電極的該端被置于緊鄰該預定通道;在該對電極之間提供一個橫穿該預定通道的電場的激勵源;和一個微粒脈沖檢測器，用于檢測由通過該電場的微粒引起的微粒脈沖。
授予Michae｜R·Groves和W·H·Coulter並轉(zhuǎn)讓給Coulter電子公司(Hialeah，F(xiàn)lorida)的4，298，836號美國專利所描述的裝置和方法中，液流內(nèi)的微粒經(jīng)流體的動力聚焦以便通過一個阻抗傳感孔，一個低頻電流源提供通過該孔的電流以產(chǎn)生代表微粒大小的信號，一個高頻電流源提供通過該孔的電流以產(chǎn)生代表微粒大小和內(nèi)阻的信號，一個檢測器確定微粒的長度，還有一個數(shù)字計算機綜合每一微粒的信號並計算它的形狀因數(shù)，變形程度或自然形狀，真正的體積和內(nèi)電阻率。
授予WilliamA·Newton和MarshallD·Graham並轉(zhuǎn)讓給Coulter電子公司(Hialeah，F(xiàn)lorida)的4，420，720號美國專利描述了一個微粒分析器，其中具有攜帶單個微粒的一個懸浮液流沿著一個預定的通道流動;一對中央電極被置于該預定通道的相對兩側(cè);該對中央電極被激勵以便在兩者之間提供一個傳感電場，兩對外部電極被置為每對在該中央電極的一側(cè);該外部電極被定向排列和/或激勵以使它們的電場在中央極板的傳感電場的方向上向外凸起以壓縮傳感電場沿預定通道的寬度。此外，中央極板之間的電場可在附加的方向上聚焦并且傳感電極的排列可在具有或沒有小孔的流動單元內(nèi)實現(xiàn)，或在一個基片的表面上實現(xiàn)。
授予JohnD·Hollinger和PaulI·Pedroso並轉(zhuǎn)讓給Coulter電子公司(Hialeah.Florida)的4，515，274號美國專利描述了一個流動通過的微粒分析器和對微粒流同時進行光和電阻抗測量的分類裝置，它包括一個流動單元，該單元具有由一個微粒檢測孔進行流體連接的一對通道，微粒流通過該孔並被分析;一個安裝在通道下流端的噴嘴，以限定一個流動室;一個包層液體在流動室的底部被引入以使微粒流進行流體動力聚焦並從噴嘴處以一個液體流束的形式將微粒噴射出來;和一個用于從該液體流束中產(chǎn)生微滴的系統(tǒng)並用于此后對微滴分類。
授予RohertC·Leif並轉(zhuǎn)讓給Coulter電子公司(Hialeah，F(xiàn)lorida)的4，348，107號美國專利描述了一個電-光傳感器，它用于對通過位于一個光學上清晰的球形部件內(nèi)的小孔的液流中懸浮的微粒同時進行光學測量和電學體積測量。
通過舉例，本發(fā)明的示意性實施方案將參照附圖予以說明，在附圖中

圖1是一個流動單元和可運行的相關(guān)硬件的理想化示意圖，包括實現(xiàn)本發(fā)明的光檢測器組件。
圖1A是圖1中流動單元沿孔徑面的水平截面的俯視圖;
圖1B是實現(xiàn)了具有平展的內(nèi)和外表面的方形石英孔徑的一個流動單元的俯視圖;
圖1C是光檢測器組件的正視圖，表示信號接收區(qū);
圖2是圖1的流動單元在孔徑水平截面的俯視圖，具有兩個45°角的光檢測器組件;
圖2A是圖2的裝置的孔徑部分的放大透視圖(不成比例);
圖3是圖1B的裝置的一個改進形式的俯視圖(不成比例);
圖4是圖1B的裝置的再一個改進形式的俯視圖;
圖5，5A和圖5B共同構(gòu)成利用Coulter體積孔徑實現(xiàn)本發(fā)明的運行電子線路和裝置的框圖;
圖6，6A和6B共同構(gòu)成利用光學流動室的圖5，5A和5B的電路的一個改進形式的框圖;
圖6C是沒有Coulter類型檢測孔徑的一個改進的流動單元的展開側(cè)視圖(不成比例);和圖7至圖27是顯示和解釋本發(fā)明的方法和裝置的結(jié)果的頻率曲線(histogram)和散射曲線(Scattergram)。
“頻率曲線”(Histogram)被定義為一個單個變量的頻率分布圖，顯示為一條兩維曲線圖，它將變量描記在X軸上而將頻率(表示為＃)描記在y軸上。頻率曲線還被定義為在計算機或在其它電路形式中所表示的這樣一條曲線圖的抽象數(shù)表。
“點陣”(Matrix)被定義為兩個獨立變量的頻率分布圖，顯示為一個三維輪廓圖，將一個變量描記在X軸上，第二個變量描記在y軸上，而頻率或計數(shù)顯示為等計數(shù)輪廓線。為了清楚起見，只顯示一條等計數(shù)輪廓線表明種群的輪廓。點陣還被定義為在計算機或其它電路形式中所表示的這樣的一個圖形的抽象數(shù)表。在本說明書中描述一個點陣時，X軸的變量將列在第一，隨后是y軸變量。
“參數(shù)”是獨立變量的同義詞，在以下的說明書中給出的本發(fā)明中，它是指從任何在流動血細胞計數(shù)器中被分析的微?；蚣毎蝎@得的同時的和獨立的測量值。通過某種數(shù)學函數(shù)將兩個或多個參數(shù)相結(jié)合被定義為產(chǎn)生另一個參數(shù)。
“選通”(Gating)被定義為一個濾波過程，它被用于在查詢一個或多個其它參數(shù)的同時從多參數(shù)數(shù)據(jù)中建立一個參數(shù)的頻率曲線。對于單個白血細胞通過流動單元並由參數(shù)傳感器產(chǎn)生細胞測量值的每一個情況，和用于選通的每個參數(shù)相對應的值或叫測量值均與一或兩個參數(shù)值或叫閾值相比較，並“檢驗”它是小于該閾值，大于閾值或是在兩個閾值之間。如果這一檢驗給出了所有被考慮的選通參數(shù)的真正結(jié)果，于是該情況即被包括在頻率曲線中。選通也可用于建立一個點陣。這樣，通過利用選通可以簡化多參數(shù)數(shù)據(jù)的分析和曲線表示。
“低角度光散射”LALS被定義為從相對于激光束軸小于10°不包括0°的范圍內(nèi)獲得的光散射信息?！案呓嵌裙馍⑸洹盚ALS被定義為相對于激光軸90°為中心處的光散射信息。“中角度光散射”MALS被定義在10°和70°之間的角度內(nèi)獲得的光散射信息。
“光束障”(Beamdump)被定義為去掉不需要的激光的一個遮擋物，它一般表現(xiàn)為橫貫光檢測器的一個水平線，這是激光束與流動單元相互作用的結(jié)果，它降低了被檢測的光散射信號。
“掩模”(Mask)被定義為一個圓形或橢圓形遮擋物，它去掉不需要的低角度光散射信息以及0°或叫激光軸上的信息，並防止這些信息被光檢測器接收。
在以下段落和整個描述中，光散射角度被定義為在一個孔徑或叫傳感區(qū)內(nèi)光線射出生物細胞的角度，這在以下進行說明。簡單地說，散射光射在光檢測器組件上的角度可能不同于在孔徑內(nèi)的真實角度。這是由于樣本稀釋劑和/或流體動力學的包層流動液，空氣以及流動單元的材料的折射指數(shù)均不同，並且還由于流動單元10的結(jié)構(gòu)，如斯內(nèi)耳氏定律(Snell′sLaw)所述。
圖1示出采用本發(fā)明的方法和過程的一種微粒分析裝置。圖1中可見，該裝置包括一個長形的圓柱體部件，標為流動單元10可為任何光學透明材料，例如，石英玻璃，石英或藍寶石。流動單元部件10的內(nèi)部為貫通其長度的園柱形，除了一個狹窄的或叫頸縮的孔徑12，通過該孔由圖中未示出的已知裝置使生物細胞樣本流過而成為流體動力聚焦的流14。部件10的外壁表面15是圓柱形並包括一個光學平面16，用于將在以下描述中變得更加明了的目的。一個透鏡系統(tǒng)18將最好是來自一個激光器22的電磁光能的波束20聚焦為孔徑12處的一個光斑。在一個優(yōu)選實施方案中，該激光器是一個氦-氖激光器，發(fā)射波長632.8nm，其它發(fā)射波長的激光器(例如488nm)也可使用，並產(chǎn)生與以下描述類似的效果。一個光檢測器組件結(jié)構(gòu)24作為散射輻射時的接受器而安裝在與激光輻射的軸26成正交的平面內(nèi)並以軸26為中點。
光檢測器組件24包括一個光檢測器25，它具有上文中定義的一個掩模28和一個光束障30。光檢測器25可以是任何類型的光敏電氣裝置，例如一個光電倍增管。在本實施方案中，光檢測器25是一個硅光電檢測器，其型號為VTS3081，由Vactec公司制造。
如上所述，光檢測器組件24的中部配有一個光散射掩模28。掩模28按要求可以是一個圓形，橢圓形或其它形狀，以便從不同結(jié)構(gòu)的流動單元10(如上文所述)獲得等效的光散射信息。掩模28與激光束20同軸定向。如圖所示，所謂的光束障30橫貫面對激光束的光電二極管組件24而水平伸展。該光束障30可以按以下所示從中軸稍微按角度展開，以此提供更清晰的信號對噪音的輸出。
圖1A是圖1中流動單元10的俯視圖，水平截過孔徑平面。所示光檢測器組件24具有以激光束軸26為中心的掩模28。光束障30在圖中未示出。
在圖1的左側(cè)，孔徑12的后側(cè)射出的光線在照射或叫探詢液流14中的一個細胞之后造成其播散為漏斗狀，它被標為“光散射”32。掩模28和光束障30的角方向為可使光散射輸出32在相對于激光軸的一個60°的角度范圍內(nèi)被接收到，即40°±30°，或叫從大約10°到大約70°。這樣就提供了一個以激光束軸26(它被作為0°)的大約40°為中心的一個角度范圍，它是向前的方向，即圖1中向左的方向。這一光學安排提供了一個±30°的收集范圍，它又提供了一個從激光束軸的大約10°到70°一個環(huán)形。
從以上的描述中可以看清，本發(fā)明利用了一個基本上扁平的平面光檢測器結(jié)構(gòu)或叫組件24。如圖所示，該組件是位于流動單元(換能器)10的前面。組件24配有圓形掩模28，以便去掉或遮擋以上所述的低于10°的低角度光散射。此外，為了實際的構(gòu)造，將水平的光束障30與掩模28連接。該光束障可采用蝴蝶結(jié)的形狀，在其兩個外端大于或?qū)捰谄渲胁浚降墓馐?0被用于光學調(diào)節(jié)以適應激光束被整形的情況，這樣使其在水平方向上伸展或壓縮，以使系統(tǒng)在細胞或微粒流過細胞室10的時候?qū)毎蛭⒘５奈恢貌缓苊舾?。這樣，這一光學整形提供了一個更均恒的光輸出信號，以便對光散射信號的輸出進行電子學利用。
圖1C是圖1中所示光檢測器組件24的正視圖。圖1C中示出圓形掩模28，光束障30，和光檢測器28的暴露的表面，它提了中角度光散射信號，以下稱之為MALS。圖1中所沒有其它內(nèi)容是一條虛線600，它將MALS劃分為角度信息602和604的兩個區(qū)域。虛線600表明了20°的光散射照射在光檢測器25的表面上的位置。根據(jù)流動單元10的幾何形狀和上文中解釋的其它因素，虛線600可表示為一個圓或一條拋物線。(如圖1C中所示)，當利用優(yōu)選實施方案中所述的流動單元10時(它在接收MALS的方向上具有圓柱形孔徑12和圓柱形外表面15)，虛線600在光檢測器25的表面映射為一條拋物線。
掩模28與虛線600之間的區(qū)域602接收在10°和20°角范圍內(nèi)的散射光。該區(qū)域602將被叫作“15°LS”，以下在整個文件中稱之為“低中角度光散射”LMALS。由虛線600和光檢測器25的外緣限定的區(qū)域604接收20°和65°范圍內(nèi)的散射光，以下將其稱為“上中角度光散射”UMALS。
在本說明中，假定血細胞是一個接一個的通過圖1所示流動單元10的孔徑12。以下將提供一個完整的系統(tǒng)描述，詳細說明血細胞或其它微粒是如何被引入流動單元10，這些細胞的多參數(shù)數(shù)據(jù)是如何獲得和處理以實現(xiàn)其分類。如前所述，在基本上自然的狀態(tài)下，橫穿孔徑12的白細胞將在10°到70°的中角度范圍內(nèi)散射光線。嗜酸性細胞與中性細胞相比將在上中角度光散射范圍UMALS內(nèi)(圖1C中的區(qū)域604)散射出更多的光線。在上部區(qū)域604中，中性細胞將比淋巴細胞，嗜堿性細胞和單核細胞散射更多的光線。在標為區(qū)域602的下中角度光散射范圍LMALS內(nèi)，嗜酸性細胞和中性細胞將散射出大約同等量的光線，使嗜酸性細胞與中性細胞不能區(qū)分。相對于由淋巴細胞，嗜堿性細胞和單核細胞散射的光量，由中性細胞散射的光量在LMALS區(qū)域602中要遠大于UMALS區(qū)域604。將下部區(qū)域602與上部區(qū)域604結(jié)合為一個單一的測量值，中角度光散射MALS給出的一個測量值提供了三個群之間的最大差別，光散射信號幅值按下降順序為嗜酸性細胞;中性細胞;和淋巴細胞、嗜堿性細胞以及單核細胞。
由于全部MALS中由UMALS子集產(chǎn)生的結(jié)果在本文的其余部分都是相似的，所以談到中角度光散射MALS時可指全部MALS測值或上部UMALS子集。以下描述的轉(zhuǎn)換光散射RLS可類似地用全部MALS或UMALS計算。以下描述的用染色劑處理白細胞時，有可能通過LMALS信號的幅值將嗜酸性細胞與中性細胞鑒別開。上述不同細胞類型之間UMALS的關(guān)系實質(zhì)上未改變。
本發(fā)明適合于某些已構(gòu)成好的變換和組合。該創(chuàng)造性裝置的一個改進的形式如圖1B中所示。在這一實施方案中提供了具有平面的內(nèi)表面40和42的一個“正方”的石英孔徑38。光檢測器組件24的位置如圖1B中所示，其構(gòu)成類似于圖1中的檢測器組件24。由于石英、空氣和樣本液體等等的折射指數(shù)不同，如斯內(nèi)耳氏定律所述，這將導致光析射。在這種情況下，從圖1B左側(cè)流動單元后面射出的光線48向相對于光束軸的高角度方向彎折，由于流動單元10的拐角處的光干涉而留下一個小的死區(qū)50。與微粒和細胞計數(shù)及分類有關(guān)的所有其它角度，無論這些角度在檢測器24的表面如何交叉，均能被收集到。
在另一實施方案中，圖2的俯視圖與圖1所示及上文所述流動單元10的俯視1A相似。一個或兩個光檢測器組件34，36可置于和偏離激光軸26為45°的線成正交，面向前並與樣本流14的軸平行。檢測器34，36的輸出信號將在電子控制電路中相加以便增加信噪比。
圖2A示出圖2的流動單元10的側(cè)視圖和光檢測器組件34和36的位置。斜線的區(qū)域是由光束障30掩蔽的部分，對應于由光束整形透鏡18和流動單元10的結(jié)合所產(chǎn)生的激光的水平模式。
圖3的實施方案示出本發(fā)明的基本構(gòu)思的再一個變型。在這種情況下，具有如圖1B所示的“正方”孔徑的一個流動單元與圖2的一個或兩個光檢測器組件34，36相結(jié)合。如上文所述，光線將經(jīng)過彎折，但由該實施方案獲得的光散射信息與圖2所示實施方案獲得的信息實際上相同。
圖4示出本發(fā)明的另一實施方案。在這一結(jié)構(gòu)中，光電二極管檢測器52，54和56被置于正方孔徑38的兩側(cè)和前方。一個圓形掩模58被置于前部光電二極管54的前面以遮擋低于10°的激光散射，其結(jié)果是留下一個暗區(qū)60。正如圖3的結(jié)構(gòu)，還是由于斯內(nèi)耳定律，在激光軸每一側(cè)的拐角處存在著暗區(qū)62和64。一個類似于圖1和2中的光障30的水平光束障(圖4中未示出)被用于所有的光電二極管檢測器52，54和56。
除了MALS，本發(fā)明還能利用至少另外七個參數(shù)，DC，RF，混濁度，RLS，NALS，All，和15°的LS，它是MALS的一個子集。
DC和RF是指孔徑阻抗細胞傳感的Coulter原理。DC被定義為施加一個直流或低頻電流使細胞膜不被穿透並且沒有電流流過細胞時獲得的脈沖峰值信息。DC脈沖的峰幅值是細胞體積的一個函數(shù)。RF被定義為施加一個高頻電流使細胞膜被短路並且有電流流過細胞時獲得的測量值中導出的脈沖峰值信息。RF是細胞體積和內(nèi)部導電性的一個函數(shù)。“混濁度”被定義為對每一單個細胞測量或每一情況用DC信號數(shù)據(jù)除RF信號數(shù)據(jù)而獲得的信號值或數(shù)據(jù)，這給出一個新的細胞參數(shù)，它獨立于大小但卻是內(nèi)部導電性的一個函數(shù)。
轉(zhuǎn)換光散射RLS被定義為一個函數(shù)，它是由從MALS的對數(shù)導出的脈沖峰值信息加上一個常數(shù)再除以上文定義的DC加上一個常數(shù)。提供RLS的電路的一個詳細實例在本說明書中另有描述。該RLS函數(shù)具有去掉體積分量的作用，產(chǎn)生的測量值與內(nèi)部結(jié)構(gòu)更加相關(guān)。獲得RLS的一個替換辦法包括將MALS信號數(shù)據(jù)的對數(shù)除以DC信號數(shù)據(jù)的對數(shù)。
窄角度光散射NALS是低角度光散射LALS的一個子集，它在文獻中已明確定義為在向前方向上偏離激光束軸0.5°到2°的一個角度范圍。軸向光損失ALL是在激光束從流動單元10射出并通過大小僅能接受該激光束的一個小孔徑之后將一個光檢測器置于與該激光束同線而獲得的一個信號，然后將由于微?；蚣毎ㄟ^檢測區(qū)12引起的該信號幅值的變化放大。NALS和ALL均受細胞大小的強烈影響，這樣可用于代替DC。15°LS被定義為是通過僅充許光檢測器上偏離激光軸15°並具有可接受的偏角±5°的一個環(huán)形范圍內(nèi)獲得的MALS的一個子集，允許的環(huán)形區(qū)從偏離激光軸10°到20°。利用NALS，ALL，和15°LS的實施方案在本說明書中另有描述。
利用自然的，非染色的白細胞，由以前描述的硬件有可能產(chǎn)生圖7到27的頻率曲線，其中不同的細胞群表現(xiàn)為所示的總體上相分離的群，參數(shù)1和2相結(jié)合被用于產(chǎn)生RLS參數(shù)。如圖所示，淋巴細胞，單核細胞，中性細胞、嗜酸性細胞和嗜堿性細胞被顯示為分離的群。
八個參數(shù)中的每一個將在以下考慮到一張或幾張附圖時給予一定程度的詳細討論。
本發(fā)明的射流的和電的控制電路是在圖5的框圖中給出。圖中示出一個樣本窗口70，它可以是一個試管，一個試管類的透明小容器，或其它適當?shù)挠糜谌菁{一定量的被檢查物質(zhì)的類似裝置，在這種情況下是“自然”的或未進行細胞化學染色的白細胞。在目前的情況下是用Coulter電子公司的標準采樣閥74通過一個吸入針72向流動單元10提供固定量的全血。大約二十八微升的樣本被注入和混合到來自試劑盒部分78的溶解劑76之中並通過導管82送到混合室80。在混合室80中，全血細胞樣本與溶解劑在一個混合致動器84的控制下被搖混大約五到六秒鐘，正如題為“為速迅混合小容積以加強生物反應的方法和裝置”，申請?zhí)枮?7/025，337，申請日為1987年3月13日，申請人為WallaceH·Coulter等人的共同未決美國專利申請中的描述和圖示的方式?；旌蠌姸仁峭ㄟ^調(diào)整致動器的頻率和占容比來控制。經(jīng)過五到六秒后，向混合和溶解的樣本中加入抑制液86並繼續(xù)混合另外的五到六秒鐘。這時所產(chǎn)生的樣本即被認為是準備妥當。在此用的“產(chǎn)生”一詞是為了提請注意事實上溶解劑76已將紅細胞和血小板溶解，留下基本上“自然”的血細胞子群。在此用“準備妥當”一詞是為了提請注意事實上抑制液86已中止了溶解過程，此外還為以后的分析準備好了白細胞及其懸浮介質(zhì)。溶解劑和抑制劑的配方和細節(jié)在題為“從全血樣本中分離、確認和/或分析白細胞的方法及試劑系統(tǒng)”。申請?zhí)枮?7/025，303，申請日為1987年3月13日，申請人為StephemL·Ledis等人，並以轉(zhuǎn)讓給本申請的受讓人Coulter電子公司的共同未決美國專利申請中給出。如圖5所示，其中另外給出了利用一個所謂的“預先制備”工作模式的裝置。在這一模式中，經(jīng)過(例如)離心，密度或淺黃層分離技術(shù)，提供了提純的白細胞樣本，由此使樣本中沒有紅細胞。樣本按上述方式吸出，但它通過一個預先制備線87到混合室80，此后它被引入細胞流動室10。從這里開始，很顯然系統(tǒng)不在需要溶解、抑制、也不需要任何試劑來幫助獲得所希望的輸出結(jié)果。于是混合被停止並且從一個射流和氣流力學供應單元88向混合室80加壓。然后，混合樣本通過一個小的引入管90被送入流動單元10的引入口92。流動單元10配有一對電極94和96，它們裝在孔徑12的相對兩側(cè)，用于以下將要說明的目的?？讖?2和流動單元10已參見圖1予以說明。這樣流動單元10即能夠同時進行電子的和化學的細胞分析測量，這將在以下說明。細胞由包層液體98進行流體動力聚焦，並以本領(lǐng)域公知的方式通過孔徑的中央。樣本物質(zhì)和包層液體通過一個排出口99流出細胞室並進入一個廢液溶器100。
氦-氖激光器22的能量相對較低(例如為0.8毫瓦)，並且直接進入透鏡系統(tǒng)18。透鏡系統(tǒng)18包括兩個交叉圓柱形(Cross-Cylindrical)透鏡。該透鏡系統(tǒng)的透鏡焦距長度被設(shè)計為能共同工作以產(chǎn)生扁的或拉長的光束20以使光束水平展開，(如上文所述)。這一光學安排不干擾光學輸出而允許光路的較小偏差。
一個電源單元102提供了用于RF和DC的電流源，檢測、和放大裝置。來自振蕩-檢測器101的射頻電流和來自直流源103的直流在耦合電路105內(nèi)相加並通過連線111送到電極94和96以建立起通過孔徑12的電流。臨時橫穿孔徑12的微?；蚣毎淖兞丝讖?2的阻抗，調(diào)制了通過孔徑的RF和DC電流分量。由這一阻抗變化引起的RF電流調(diào)制經(jīng)濾波通過耦合電路105被送入振蕩一檢測器101，由其為RF前置放大器107提供一個檢測脈沖，該放大器輸出一個“RF脈沖”118。與此同時，由阻抗變化引起的直流調(diào)制經(jīng)濾波通過耦合電路105送入DC前置放大器109，並輸出“DC脈沖”116。上述電源單元102是一個優(yōu)選的形式，它在題為“測量微粒的電阻和電抗的微粒分析器”，申請?zhí)枮?6/921，654，申請日為1986年10月21日，申請人為WallaceH·Coulter等人，並轉(zhuǎn)讓給本申請的受讓人Coulter電子公司的未決美國專利申請中得到充分地描述。該電源單元102可由任何其它能夠產(chǎn)生相同結(jié)果的設(shè)計來構(gòu)成。本發(fā)明的某些實施方案僅利用DC而不用RF，這樣，在這種情況下電源單元102將僅包括DC源103和DC前置放大器109。
在圖5中，所示出的散射光檢測器組件24以激光軸26為中心，具有掩模28和光束障30，用于去掉激光噪音以及相對于激光軸的低角度向前的光散射(低于10°的散射光)，正如圖1到圖4中所述。光檢測器組件24收集並能轉(zhuǎn)換出MALS或叫10°到70°的環(huán)形光收集范圍，這個信號是以脈沖的形式提供，代表孔徑12中穿過激光束20的微?；蚣毎?，這些脈沖為前置放大器104的輸出。
如圖5A所示，由電-光系統(tǒng)產(chǎn)生三個電輸出，即作為電脈沖116，118和120的DC，RF和MALS。這些脈沖被送入對應的放大器124，122和126，這些部件包括濾波和脈沖整形電路。例如DC復原，下一步放大器的輸出被送入對應的峰值檢測電路130，128和132，其中對相應信號的峰值進行檢測，然后每個峰值的電壓被送入相應的模-數(shù)轉(zhuǎn)換器134，136和138放大器126提供了一個對數(shù)的響應，這使脈沖峰值檢測電路132的輸出與MALS的對數(shù)成比例。
來自模-數(shù)轉(zhuǎn)換器的輸出被送入一個數(shù)據(jù)處理單元140(例如一個IBMPC)進行進一步的處理，這馬上要進行說明。一個帶式或卡式打印機142可與數(shù)據(jù)處理輸出144相連，第二輸出146可將主處理器140的信息送入曲線打印機148。視頻監(jiān)視器150(例如一個CRT)可用于由主處理器140處理的數(shù)據(jù)狀況的瞬時監(jiān)視。
一個除法器電路154(它有市售的器件)被連接來接收DC峰值脈沖和RF峰值脈沖，以DC輸出送入除法器154的分母端，而RF輸出送入除法器154的分子端。除法器電路154的輸出線160如此提供的信號被標為“混濁度”，它與A/O轉(zhuǎn)換器172相連。
一個函數(shù)電路161(其細節(jié)在圖5B中)產(chǎn)生“轉(zhuǎn)換光散射”或RLS170。參見圖5B，一個DC峰值檢測器輸出152被連接到一個衰減因數(shù)為K的衰減器155上。然后被衰減的DC被連接到加法電路166和一個節(jié)點上。一個常數(shù)補償電壓V2153施加到加法電路166的另一個節(jié)點上，其輸出被送到模擬除法器162的分母輸入端D。光散射的對數(shù)LLS的輸出164被送入加法電路168的一個節(jié)點上。一個常數(shù)補償電壓A1165被施加到加法電路168的另一輸入節(jié)點上，並將其輸出施加到模擬除法器162的分子輸入端N。函數(shù)電路161的輸出170被定義為RLS＝(LLS+V1)/《(DC/K)+V2》。例如假定峰值檢測器的輸出范圍是0-10伏，衰減因數(shù)K被設(shè)為5，V1設(shè)定為-4.83伏，V2設(shè)定為+4.0伏，當兩個輸入的比值為1時，模擬除法器162的輸出170被定義為滿度值，即+10伏。RLS輸出170被施加給模-數(shù)轉(zhuǎn)換器174。換一種方式，RLS參數(shù)也可由數(shù)字邏輯電路導出。
圖5，5A和5B的電路安排提供了三個原始參數(shù)DC、RF和光散射，以及兩個計算出的或叫導出的參數(shù)，即“混濁度”和“轉(zhuǎn)換的光散射”。這就使該優(yōu)選實施方案的系統(tǒng)能夠檢查五個獨立的微粒群，這將在以下描述。
五個主要信號RF、混濁度、DC、RLS和MALS被送入一個示波器切換控制和種群識別電路180，由該電路將一個信號送入一個數(shù)據(jù)顯示示波器186的x和y軸182和184。每次細胞數(shù)據(jù)存在時，一個照明脈沖178也被送入示波器186。該數(shù)據(jù)顯示示波器可顯示在一個實時基礎(chǔ)上來自任何兩個參數(shù)的數(shù)據(jù)。在電路180之內(nèi)，多個模擬比較器對由這些脈沖值代表的數(shù)據(jù)執(zhí)行選通功能，然后將五個計數(shù)器188，190，192，194和196中的一個增值，五個計數(shù)器分別代表所確認的中性細胞，嗜酸性細胞，嗜堿性細胞，淋巴細胞和單核細胞子群。這樣，根據(jù)細胞類型，一個單獨的計數(shù)器被增值，同時曲線打印機148或卡片打印機142可產(chǎn)生實際細胞子群的頻率曲線或點陣，用于可視的研究和/或診斷。
如上文所述，本系統(tǒng)能夠產(chǎn)生有關(guān)生物細胞子群的有用數(shù)據(jù)和信息，而無需采用Coulter類型的孔徑或利用CoulterDC或RF信號處理。
圖6和6A示出的系統(tǒng)采用了與上述圖5，5A和5B相同的樣本取入和/或制備。流動單元10左側(cè)的每一元件均與圖5，5A和5B中的同一元件完全相同並用相同的參考字符標出。
在圖6和6A的純光學方案中不包括由虛線包圍的部分，該部分包括與電參數(shù)DC和RF的檢測與處理相關(guān)的部件。圖6C的展開圖中示出的結(jié)構(gòu)顯示了一個流動單元199，它並不要求一個Coulter類型的檢測區(qū)12及其相關(guān)的用于電檢測(DC和RF)的電極94和96，而是可包括一個長形、均勻、正方的具有250微米的內(nèi)部截面的石英通道，它的一個例子被用在CDULTER EPICSRC中作為Biohazard流動單元。
在圖6C的右側(cè)，與流動室199分離安排的是一個MALS傳感器200，它可被制成如圖所示的兩部分的組件，或者它可以是一單個的，整體的結(jié)構(gòu)，只要有一個中央軸向開孔或孔徑202即可。
傳感器組件200的光路下流方是一個掩模204，它可以是一個整體的硬件，其上配有多個光孔206，208，210和212。開孔206和212被安排在15°±5°的角度處用于提供15°LS。圖中示出光線211照射在光檢測器214和216上?？?02被置于偏離軸向約0.5°-2°並允許拾取窄角度光散射(NALS)信息。圖中示出光線226照射在光檢測器218上。孔210被置于相對于激光束20的軸上并提供了軸向光損失(ALL)信息。圖中示出光線224照射在光檢測器220上。光散射信號光檢測器214，216，218和220位于緊靠掩模204之后，用于分別產(chǎn)生與15°光散射，窄角度光散射和軸向光損失相關(guān)的信號信息，由于由每一光散射傳感器200，214，216，218和220所形成的電信號輸出相對較低，對每一輸出信號提供一個獨立的前置放大器222，264，266和228，將檢測器214和216的輸出由前置放大器228相加，然后經(jīng)過前放的信號在相應的放大器230，232，234，和236被放大隨后送入單個的峰值檢測器238，240，242和244。使各峰值檢測器的輸出端上有每一信號脈沖的電壓值，然后相應輸出信號被送到相應A/O轉(zhuǎn)換器246，248，250和252，此后再到數(shù)據(jù)處理器(CPU)140，如同圖5，5A和5B。
示波器切換控制和種群識別電路180的作用如前所述，但僅利用MALS信號，ALL信號，NALS信號和15°LS信號，以產(chǎn)生頻率曲線和點陣，這將予以說明。
在另一方案中，圖6和6A的所有部分均被采用。電的RF和DC，以及光的MALS，ALL，NALS和15°LS參數(shù)上文已描述。采用了一個附加的模擬除法器254，將ALL輸出的信號送入分子輸入端而將DC輸出信號送入除法器254的分母輸入端，然后所產(chǎn)生的ALL/DC信號被送入一個A/D轉(zhuǎn)換器256和示波器切換控制及種群識別電路180，如上文所述。
在剛敘述的裝置中獲得的ALL數(shù)據(jù)提供了細胞相對大小的測量值，它近似于用電子細胞體積或叫Coulter體積而獲得的值，稱之為CoulterDC或在本發(fā)明中稱為DC。計算ALL/DC的除法產(chǎn)生一個新的參數(shù)，它在區(qū)分一定的細胞種群時有幫助，這在以下示出。
圖7到27是由本系統(tǒng)的不同實施方案利用全血、自然白細胞群和子群求出的信息的數(shù)據(jù)表現(xiàn)形式。
以下各段參見圖5和5A中所示的系統(tǒng)框圖，其中細胞由它們對DC，RF和MALS的響應來分類。
圖7是圖1的裝置的MALS輸出的頻率曲線圖，是由圖5的電-光系統(tǒng)所提供。圖8中顯示了相同數(shù)據(jù)。它代表了MALS的對數(shù)的頻率曲線。圖7和8都示出三個種群或峰值，這將白細胞分為三組淋巴細胞，單核細胞和嗜堿性細胞301;中性細胞302，以及嗜酸性細胞303。垂直實線304和305代表分“隔”這三個峰的谷。
圖9被稱為一個點陣，示出MALS數(shù)據(jù)與DC數(shù)據(jù)之比。圖10示出的一個logMALS比DC的點陣。在這兩種情況下，數(shù)據(jù)中包含了相同的信息，僅有尺度的不同。有五個白細胞群被鑒別出中性細胞302，嗜酸性細胞303，單核細胞306，淋巴細胞307和嗜堿性細胞308。兩條實線304和305對應于圖7和圖8中的垂線。
圖12示出RLS的頻率曲線，它是通過用DC除logMALS而獲得。它的數(shù)據(jù)與圖7和圖8中相對應。圖11示出RLS比DC的點陣，它的數(shù)據(jù)與圖9和10相對應。將MALS數(shù)據(jù)進行變換提供了三個峰301，302和303之間更好的分離，這在圖12中可見。圖11和12中所示的虛線315和316描繪出種群間的改進的分離線，它們也在圖10中示出以幫助說明比例函數(shù)。
圖13示出logMALS比RF的點陣。五個白細胞種群可被區(qū)分開，並且它們與圖9、10和11所示的種群相同，只有一個主要的差別，即與圖9、10和11相比嗜堿性細胞308被更好地同淋巴細胞307分離開。
圖14示出RF比DC的點陣。四個白細胞種群被鑒別出單核細胞306，淋巴細胞307，嗜堿性細胞308，以及包括中性細胞和嗜酸性細胞的一個群309。由于DC測量細胞的體積而RF測量與DC高度相關(guān)，用DC除RF產(chǎn)生出混濁度，它獨立于體積並與細胞內(nèi)部的導電性相關(guān)。
圖15示出混濁度比DC的點陣，它包括圖14所示的同樣的四個種群，但其尺度不同。特別有意義的是這些種群可被混濁度劃分為兩組，如圖15中的線322所示，而同樣的劃分卻不能用對角劃出的等混濁度線322單獨由RF或DC來完成，如圖14所示?，F(xiàn)在將線322的用途說明如下。
對小于由圖12中的線315所標出的那些值進行選通並產(chǎn)生混濁度比DC的點陣將導致圖16中所示的數(shù)據(jù)。只有圖12中線315左側(cè)所示出的那些白細胞種群出現(xiàn)在圖16中，即單核細胞306，淋巴細胞307和嗜堿性細胞308。一條水平虛線314將單核細胞306與另外兩個種群307-308分離開。一條實線322將淋巴細胞307與嗜堿性細胞308分離開。以下是獲得線314和322的方法，在圖17中，圖16的數(shù)據(jù)的DC頻率曲線示出包含兩組的兩個峰值單核細胞306，以及淋巴細胞及嗜堿性細胞的一群310。這個數(shù)據(jù)是通過對圖12中小于線315所標出的值進行RLS選通並產(chǎn)生一個混濁度比DC點陣而獲得。兩個峰之間的谷由圖17中虛線314來確認。線314還在圖10、11和16中示出。在圖17中，峰值330對應于異常的小體積的白細胞，它可在淋巴細胞加嗜堿性細胞的峰值310的左側(cè)被發(fā)現(xiàn)，並由線334分隔開。
參見圖11，對小于線315的值進行RLS選通並對小于線314的值進行DC選通再產(chǎn)生一條混濁度頻率曲線將給出圖18，它示出兩個峰值淋巴細胞307和嗜堿性細胞308，由線322將它們分隔開。第三個峰322代表異常的低混濁度的白細胞，它可在正常白細胞307的左側(cè)被發(fā)現(xiàn)並由線340分隔開。
圖19示出對所有白細胞的RLS比DC的點陣。它包括圖11所示所有的種群，並包括僅在異常情況下存在的附加白細胞種群;未成熟粒細胞312，它與中性細胞302部分重疊;小體積白細胞330由線334與正常淋巴細胞307分隔開;和種群324，它可包括高光散射白細胞，損壞的中性細胞，或這兩種細胞都包括，並且它由線336與正常中性細胞302分隔開。
在對圖19中線315和316之間的RLS值進行選通時產(chǎn)生一個混濁度比DC的點陣將給出圖20中示出的以下種群正常的成熟的中性細胞302;未成熟粒細胞312;高光散射淋巴細胞326;和損壞的中性細胞328。后兩個種群均由線336與正常中性細胞302分隔開，並由線338將彼此分隔開，在圖19中作為一個種群324出現(xiàn)。
圖24示出一個混濁度比DC的點陣，如圖19所示，它是對小于線315的RLS值進行選通而獲得，由實線的輪廓線示出的是正常的種群淋巴細胞307，嗜堿細胞308和單核細胞306，它由虛線314與前兩個種群分隔開。這個數(shù)據(jù)等效于圖16所示的數(shù)據(jù)。虛線所示為兩個異常種群小體積淋巴細胞330，它由線334與所有其它種群分隔開;和低混濁度淋巴細胞332，它在圖19中完全與正常淋巴細胞307重疊。
從以上利用圖5和5A所示實施方案的裝置獲得的在圖7到19中所示數(shù)據(jù)的以上描述中可見，一種通過利用DC，RF和MALS將白細胞劃分為至少五個種群的方法描述如下1.產(chǎn)生RLS頻率曲線(圖12)並找出分隔線315和316。對中性細胞302和嗜酸性細胞303進行計數(shù)。
2.對小于線315的RLS值進行選通;產(chǎn)生DC頻率曲線(圖17)並找出分隔線314。對單核細胞306計數(shù)。找出小體積分隔線334並對異常小體積白細胞330(如果有的話)進行計數(shù)。
3.在圖12中對小于線315的RLS值進行選通並對圖17所示線334和314之間的DC值進行選通;然后產(chǎn)生混濁度頻率曲線(圖18)。找出分隔線322並對淋巴細胞307和嗜堿性細胞308進行計數(shù)。找出線340並對異常低混濁度白細胞332(如果有的話)進行計數(shù)。換一種方式，將一個高斯或正態(tài)分布曲線與白細胞峰值307相配合;去掉峰值307;對淋巴細胞307，嗜堿性細胞308和低混濁度淋巴細胞332計數(shù)。
4.對圖19的線315和316之間的RLS值進行選通;產(chǎn)生DC頻率曲線(未示出);找出將正常中性細胞302與異常種群324分隔開的線336，如圖19所示。
5.選通圖19中線315和316之間的RLS值和大于線336的DC值;產(chǎn)生一條混濁度頻率曲線(未示出);確認正常中性細胞峰值302並對其左側(cè)的異常未成熟粒細胞312計數(shù)，如圖20所示。
6.選通圖19中線315和316之間的RLS值和小于線336的DC值;產(chǎn)生一條混濁度頻率曲線(未示出);找出線338並對其左側(cè)的高光散射淋巴細胞326和右側(cè)損壞的中性細胞328進行計數(shù)，如圖20所示。
圖5和5A的另一實施方案利用MALS、DC和RLS，在這種情況下，電源單元102將僅包括DC源103和DC前置放大器109。振蕩一檢測器101，RF前置放大器107，耦合電路105，放大器122，峰值檢測器128，除法電路154，模-數(shù)轉(zhuǎn)換器136和172是與RF相關(guān)所以不再使用。圖11示出一個RLS比DC點陣，如前所述，它有五個白細胞種群。利用DC和MALS將上述白細胞劃分為至少五個種群的方法描述如下1.產(chǎn)生RLS頻率曲線(圖12)並找出分隔線315和316。對中性細胞302和嗜酸性細胞303計數(shù)。
2.選通小于線315的RLS值，產(chǎn)生DC頻率曲線(圖17)並找出分隔線314。對單核細胞306計數(shù)。
3.選通小于線315的RLS值並選通小于線314的DC值，產(chǎn)生RLS頻率曲線(未示出)。對淋巴細胞和嗜堿性細胞進行識別和計數(shù)。
在圖5和5A的再一個實施方案中僅使用了RF和MALS。在這種情況下，所有與DC有關(guān)的元件DC源103，DC前置放大器109，放大器124，峰值檢測器130，除法電路156，模擬函數(shù)電路151和模-數(shù)轉(zhuǎn)換器134，172，174都被省略。圖13中的logMALS比RF的點陣示出五個白細胞種群;淋巴細胞307，嗜堿性細胞308，單核細胞306，中性細胞302和嗜酸性細胞303。
以下各段是關(guān)于圖6的第一方案中描述的系統(tǒng)框圖，它涉及一個僅包括光學測量而不要求DC或RF測量，也不要Coulter類型的孔徑的流動細胞計數(shù)系統(tǒng)，虛線中包圍的部件都不包括。
在圖6和6A的一個實施方案中僅利用了窄角度光散射和MALS的對數(shù)，它有可能獲得四個白細胞種群的鑒別計數(shù)。
參見圖21，一個logMALS比窄角度光散射NALS的點陣清楚地示出四個種群淋巴細胞307，單核細胞306，中性細胞302和嗜酸性細胞303;將第五種群(嗜堿性細胞308)與淋巴細胞307和單核細胞306相重疊。
在圖6和6A的另一個實施方案中僅利用了MALS和軸向光損失，產(chǎn)生了如圖22中所示的logMALS比ALL的點陣，它可以識別五個白細胞種群，即淋巴細胞307，嗜堿性細胞308，單核細胞306，中性細胞302和嗜酸性細胞303。選通線304和317可被用于將中性細胞302與其它細胞類型相鑒別。線317可根據(jù)logMALS除以ALL的數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換而求出。
在圖6和6A的再一個實施方案中僅采用了15°LS和ALL，產(chǎn)生了圖23的表現(xiàn)形式。
圖23示出一個15°LS比ALL的點陣。有五個白細胞種群被檢出並且形式類似于圖22的情況，只有一點例外，圖23的中性細胞302和嗜酸性細胞303之間的分隔不象圖22中那么好。15°LS和ALL都不能靠它們自己進行中性細胞302和嗜酸性細胞303之間的鑒別。需要將兩個測量值相結(jié)合。最好的選通或分隔線318是一條對角線，是通過用ALL除15°LS而獲得。一條選通線319提供了中性細胞302與其它三個細胞種群306，307和308之間的分隔，並且是類似于MALS或logMALS上的線304。
以下段落描述了用圖6和6A中所示整個系統(tǒng)獲得的數(shù)據(jù)。
在如圖6和6A中所示的一個系統(tǒng)中至少采用了DC，MALS和ALL，以下參見圖11，25，26和27描述一種將白細胞劃分為五個種群的方法。
圖25示出一個ALL比DC的點陣。由于ALL與DC具有很高的相關(guān)性，僅有三個白細胞種群可識別出淋巴細胞307，嗜堿性細胞308，以及相互重疊的單核細胞、中性細胞和嗜酸性細胞320。這兩個測量值的比值產(chǎn)生一個獨立的參數(shù)。
圖26示出一個ALL/DC比DC的點陣，並示出剛說明的相同種群，但經(jīng)過了變換以產(chǎn)生更大的分離，特別是在淋巴細胞307和嗜堿性細胞308之間。
如前所述，中性細胞302和嗜酸性細胞303可通過RLS比DC來識別和計數(shù)(見圖11)。圖17所示的DC頻率曲線是通過對圖11所示小于線315的RLS值進行選通而產(chǎn)生。在這條DC頻率曲線上，包括淋巴細胞和嗜堿性細胞的一個群310由線314與單核細胞306相分離。單核細胞被計數(shù)。最后，通過對小于線315的RLS值和小于線314的DC值都進行選通(如圖11所示)，如圖27所示的ALL/DC的頻率曲線產(chǎn)生出兩個種群淋巴細胞307和嗜堿性細胞308。
至此已經(jīng)描述了一種新穎的和非顯而易見的技術(shù)和裝置，用于即可提供一個單純光學的也可提供一個電-光學的裝置，以此提供至少五部分的生物細胞種群的鑒別分析，並將與這些種群相對應的數(shù)據(jù)顯示為頻率曲線和點陣以用于診斷目的。
應當理解，在此提出的示意性實施方案構(gòu)成了本發(fā)明原理的實例，但本領(lǐng)域的一般技術(shù)人員無須背離本發(fā)明的范圍即可作出多種變換。
權(quán)利要求
1.在一個血液樣本中選擇性地鑒別至少一個白血細胞子群的裝置，由此進行的鑒別是基于單個血細胞的光散射，上述裝置包括一個細胞計數(shù)流動單元(10)，包括以懸浮液的形式引入和流出血樣液樣本的引入(92)和引出(99)裝置；將白血細胞的樣本導入上述流動單元的引入口以使該白細胞樣本流過上述流動單元(10)的引導裝置(74，80)；一束光線(20)被安排為使光線的軸(26)以相對上述白細胞流成直角通過上述流動單元；與上述光線的軸(26)軸向?qū)R的遮光裝置(28，30)，用于在白細胞通過上述光束時遮時擋響應于光沖擊而由白細胞造成的一些光線散射；光收集裝置(24)，響應于上述細胞通過上述光束(20)和上述遮光裝置(28，30)之后散射的光線；和利用裝置(140，142，148，150)，利用來自上述光收集裝置(24)的輸出信號以產(chǎn)生表明白細胞子群的數(shù)據(jù)；上述裝置的特征在于它的構(gòu)成能進行白血細胞鑒別，特別是包括未被染色的嗜酸性血細胞；上述遮光裝置(28)的作用是遮擋對上述光束細(26)為低角度的散射光線；上述光收集裝置(24)被構(gòu)成和安排為響應于相對上述光軸(26)大于10°但小于70°的收集角內(nèi)的散射光，以產(chǎn)生表明細胞的輸出信號；和上述利用裝置(140，142，148，150)被構(gòu)造和安排為產(chǎn)生至少表明嗜酸細胞子群的鑒別數(shù)據(jù)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的裝置，其特征在于所述光遮擋裝置為蝴蝶結(jié)形狀(30)，其相對兩端的寬度大于其中央部。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的裝置，其特征在于所述遮光裝置(28)被置于能攔截和遮擋以40°±20°為中心區(qū)之外的所有其它散射光。
4.根據(jù)權(quán)利要求1的裝置，其特征在于所述遮光裝置包括一個掩模部件(28)，它被置于同出自流動單元(10)的光線為直角並與之軸向?qū)R，並具有一個橢圓形的遮光部分。
5.根據(jù)權(quán)利要求1的裝置，其特征在于所述遮光裝置包括不透光的裝置(200，204)，用于在所述光線照射到所述光收集裝置(24)上之前選擇性地遮擋該光線。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的裝置，其特征在于所述不透光的裝置(200，204)包括按角度排列的孔(202，206，208，210，212)，用于允許所述散射光線以規(guī)定的角度通過。
7.根據(jù)權(quán)利要求6的裝置，其特征在于所述的孔包括一個置于中央的截斷的環(huán)(206，212)。
8.根據(jù)權(quán)利要求6或7的裝置，其特征在于至少一個所述的孔(202，208)是位于離開所述流動單元(10)的光線軸(26)。
9.根據(jù)權(quán)利要求1的裝置，其特征在于所述光收集裝置包括結(jié)構(gòu)(220)，它響應于由所述血細胞在15°±5°的收集角內(nèi)散射的光線。
10.根據(jù)權(quán)利要求6的裝置，其特征在于至少一個所述的孔(210)是位于離開所述光束軸(26)，其相對于光線的角度為0.5°至2°。
11.根據(jù)權(quán)利要求1的裝置，其特征在于所述光收集裝置包括結(jié)構(gòu)(218)，它響應于從0.5°到2°的窄角度光散射。
12.根據(jù)權(quán)利要求1，10，或11中任何一個的裝置，其特征在于所述光收集裝置包括結(jié)構(gòu)(226)，它位于所述光束軸(26)上並響應于軸向光損失。
13.根據(jù)權(quán)利要求1的裝置，其特征在于所述光收集裝置包括單個部件(214，216)，它們被置于相對所述光束(20)的軸(26)為45°。
14.根據(jù)權(quán)利要求1的裝置，其特征在于所述流動單元(10)的截面(15)為圓形。
15.根據(jù)權(quán)利要求1的裝置，其特征在于在所述引入口(92)和引出口(99)之間的流動單元(10)的截面(199)為方形。
16.根據(jù)權(quán)利要求1，14或15當中任何一項的裝置，其特征在于所述光收集裝置包括部件(52、54，56)，它們被置于鄰近所述流動單元(10)的至少三側(cè)。
17.根據(jù)權(quán)利要求1的裝置，其特征在于所述利用裝置(30)包括顯示裝置(148，150)，用于產(chǎn)生所述數(shù)據(jù)的電子顯示以及與該顯示對應的該數(shù)據(jù)的打印付本。
18.根據(jù)權(quán)利要求1的裝置，其特征在于所述流動單元(10)包括一個檢測孔徑(12)，它位于所述引入口(92)和引出口(99)之間並與所述光束(20)的軸(26)對準;並且所述遮光裝置(28)位于鄰近所述流動單元(10)用于限制從0°到10°的角度范圍內(nèi)的光線通過。
19.根據(jù)權(quán)利要求18的裝置，其特征在于所述光收集裝置的構(gòu)造和安排(24，214，220)是對應于遮光裝置(30，200，202)的構(gòu)造和安排，以便收集和響應于由所述樣本在相對于偏離所述流動單元孔徑(12)的光軸(26)為45°±225°的角度散射的光線。
20.根據(jù)權(quán)利要求1的裝置，其特征為第一電子線路裝置(102，109，124，130，134)，用于產(chǎn)生被稱為Coulter DC體積的第一信號;該第一電路裝置的特征為用于產(chǎn)生一個第二信號的電路(104，120，132，138)，它利用來自光收集裝置(214，216)並表現(xiàn)為中角度光散射(MALS)的對數(shù)的輸出信號;以及從上述第一和第二信號中得出並表示為轉(zhuǎn)換光散射(RLS)的一個第一輸出。
21.根據(jù)權(quán)利要求20的裝置，其特征在于第二電子線路裝置(102，107，122，128，136)，用于產(chǎn)生被稱為(Coulter)RF的第三信號;和一個第二輸出，它利用上述Coulter DC體積第一信號和上述Coulter RF第二信號，被稱為Coulter混濁度。
22.根據(jù)權(quán)利要求21的裝置，其特征在于它的構(gòu)造和安排(134，136，138，172，246，248，250，252，256)如下所述RLS第一輸出產(chǎn)生專門對應于中性白細胞的白細胞子群的數(shù)據(jù)，它與嗜酸性細胞分離，並且還和一組三個子群的淋巴細胞、單核細胞和嗜堿性細胞分離;所述Coulter DC體積的第一信號產(chǎn)生的數(shù)據(jù)將單核細胞與該組的三個子群分離;而所述Coulter混濁度的第二輸出產(chǎn)生的數(shù)據(jù)將淋巴細胞和嗜堿性細胞與該組的三個子群分離;由此所述裝置鑒別出五個白細胞子群嗜酸性細胞，中性細胞，單核細胞，淋巴細胞和嗜堿性細胞。
23.根據(jù)權(quán)利要求1的裝置，其特征在于第一電子線路裝置(102，122，128，136)，它用于產(chǎn)生稱為CoulterRF的第一信號，和利用了來自上述收集裝置的上述輸出信號並稱為中角度光散射(MALS)的對數(shù)的第二信號;和第二電子線路裝置(102，104，126，132，138)，它用于比較上述Coulter RF第一信號和MALS的對數(shù)的第二信號;由此可鑒別白血細胞的五個子群。
24.一種在血液樣本中鑒別至少一種白血細胞子群的方法，所進行的鑒別是基于單個細胞的光散射，該方法包括以下步驟將光線沿著一個軸以正交方式通過一個流體通道，與此同時使上述血液樣本流過該通道;檢測由上述血液樣本中的每一細胞散射的某些光線;將該檢測步驟的結(jié)果進行電子處理以產(chǎn)生白血細胞鑒別數(shù)據(jù);其特征在于上述檢測步驟是對白血細胞進行，特別是包括未被染色的嗜酸性細胞，並且是在相對上述軸線10°到70°的收集角內(nèi)進行;並且上述處理產(chǎn)生的數(shù)據(jù)至少表明嗜酸性細胞子群。
25.權(quán)利要求24的方法，其中所述的流通步驟包括在一個Coulter體積流體流動室之內(nèi)提供所述流體通道，當上述血液樣本流過該室時將其進行流體動力聚焦，產(chǎn)生Coulter體積DC信號信息(DC)，其特征為將上述DC與從光散射檢測獲得的信號信息相比較，由此使上述處理產(chǎn)生出鑒別五個不同白細胞子群的數(shù)據(jù)。
26.權(quán)利要求25的方法，其特征在于在將上述血液樣本流過所述流動室之前，將該血液樣本與一個紅血細胞溶解劑混合。
27.權(quán)利要求24的方法，其特征在于所述檢測步驟提供中角度光散射(MALS)信號數(shù)據(jù)。
28.權(quán)利要求27的方法，其特征在于所述MALS信號數(shù)據(jù)經(jīng)所述處理步驟而求出中角度光散射信號信息的對數(shù)(log MALS)，用于將所述白血細胞劃分為不同的子群。
29.權(quán)利要求28的方法，其特征在于以下步驟產(chǎn)生Coulter體積DC信號的信息(DC)，並用該DC除MALS的對數(shù)以產(chǎn)生轉(zhuǎn)換光散射信號的信息(RLS)。
30.權(quán)利要求29的方法，其特征在于將上述RLS與上述DC相比較的步驟，由此使上述處理產(chǎn)生用于鑒別五種白血細胞子群的數(shù)據(jù)。
31.權(quán)利要求28的方法，其特征在于產(chǎn)生Coulter體積DC信號信息(DC)和將該DC與所述MALS的對數(shù)相比較的步驟，由此使上述處理產(chǎn)生用于鑒別五種白血細胞子群的數(shù)據(jù)。
32.權(quán)利要求28的方法，其特征在于產(chǎn)生Coulter RF信號信息(RF)和將該RF與所述MALS的對數(shù)相比較的步驟，由此使上述處理產(chǎn)生用于鑒別五種白血細胞子群的數(shù)據(jù)。
33.權(quán)利要求28的方法，其特征在于從所述檢測步驟獲得窄角度光散射信號信息(NALS)的步驟，然后將該NALS與MALS的對數(shù)相比較，由此使上述處理產(chǎn)生用于鑒別四種白血細胞種群的數(shù)據(jù)。
34.權(quán)利要求28的方法，其特征在于從所述檢測步驟獲得軸向光損失信號信息(ALL)並將該ALL與MALS的對數(shù)相比較的步驟，由此使上述處理產(chǎn)生用于鑒別五種白血細胞子群的數(shù)據(jù)。
35.權(quán)利要求24的方法，其特征在于從所述檢測步驟獲得15°光散射信號信息(15°LS)和軸向光損失信號信息(ALL)，並將所述15°LS與ALL相比較的步驟，由此使上述處理產(chǎn)生用于鑒別五種白血細胞子群的數(shù)據(jù)。
36.權(quán)利要求24的方法，其特征在于從所述檢測步驟獲得軸向光損失信號信息(ALL)，產(chǎn)生Coulter體積DC信號信息(DC)，以及用該DC除該ALL的步驟，由此使上述處理產(chǎn)生用于鑒別兩種白血細胞子群的數(shù)據(jù)。
37.權(quán)利要求24的方法，其特征在于同時向所述流動單元通路施加一個Coulter體積DC信號(DC)和一個Coulter RF信號(RF)，並將該DC與RF相比較的步驟，由此使上述處理產(chǎn)生用于鑒別四種白血細胞子群的數(shù)據(jù)。
38.權(quán)利要求37的方法，其特征在于以電子方式用該DC除RF以產(chǎn)生一個獨立于血細胞體積並與血細胞內(nèi)部導電性相關(guān)的混濁度信號，並將該混濁度信號與DC相比較的步驟，由此使上述處理提供用于增強所述四種白血細胞子群的鑒別的數(shù)據(jù)。
39.權(quán)利要求24，27或37中任何一項的方法，其特征在于調(diào)整所述白血細胞的狀況的步驟，以使它們在流過所述通道時近似于自然狀態(tài)。
全文摘要
在白細胞流中通過光電測量無需染色而鑒別白細胞的微粒分析方法及裝置將自然狀態(tài)下流體動力聚焦的白細胞流在流動單元中進入和通過輻射波束，使該波束由不同子群的白細胞造成獨特的散射，令散射作用在鄰近流動單元的光收集裝置上。為檢出嗜酸性細胞，在相對光軸約10°—70°的角位置收集散射光，其它白細胞子群相對嗜酸細胞以及它們相互間的鑒別是通過包括Coulter微粒分析原理的光和/或電子測量而完成。
文檔編號G01N1/38GK1031422SQ8810123
公開日1989年3月1日 申請日期1988年3月12日 優(yōu)先權(quán)日1987年3月13日
發(fā)明者卡洛斯·M·羅德里古茨, 沃拉斯·H·庫爾特 申請人:科特電子有限公司