專利名稱:免疫復合物的檢測方法和步驟的制作方法
在抗感染物方面，免疫系統(tǒng)代表著機體的主要防御機制。脊椎動物的免疫系統(tǒng)具有兩種功能性的分化體液免疫和細胞免疫。體液免疫是指免疫系統(tǒng)中的循環(huán)成分，它們由細胞產(chǎn)生或分泌，并且存在于免疫血清之中。細胞免疫是指不同類型白細胞對外來靶標物質的直接作用。這兩種相互關聯(lián)的系統(tǒng)之協(xié)同作用擔負起機體對千變萬化的感染性疾病的抵御。
在通常情況下，感染物對機體的侵染刺激了細胞之應答反應，這些細胞產(chǎn)生體液免疫的有效成分。特別是B淋巴細胞合成特殊的蛋白質、即抗體，抗體選擇性地結合在外來感染物的一些作用點上，這種結合完成以后，機體就通過細胞免疫或體液免疫;甚至直接由抗體分子本身所起的失活作用使感染物遭到破壞。
正常情況下，抗體分子不對宿主本身或者說“自身”物進行作用。然而，在某些個體中，免疫系統(tǒng)錯誤地將自身成分當成外來侵染物。一旦這種情況發(fā)生，機體就會以對待外來物同樣的方式向機體自身發(fā)起免疫攻擊。這種自身免疫反應的后果是可悲的。這類疾病的癥狀包括不能利用糖(Ⅰ-型糖尿病)、關節(jié)損傷(類風濕性關節(jié)炎)、腎臟損傷(內吸性紅斑狼瘡、腎小球性腎炎及類似疾病)和血管系統(tǒng)的損傷(脈管炎)。自身免疫系統(tǒng)紊亂，導致患者經(jīng)受巨大的痛苦，并有相當高的死亡率。
自身免疫病持續(xù)伴有高濃度的(Blood-borne)自身免疫復合物在血液中出現(xiàn)。許多由自身免疫病所形成的損害可以追溯至細胞免疫系統(tǒng)的作用，不管在機體那個部位出現(xiàn)自身免疫復合物，均由該系統(tǒng)負責清除。過去的事實證明對這類疾病的控制是困難的，部分是由于檢測方法方面的原因，其不能妥當?shù)罔b別開正常人和患病者之間所反映出來的免疫復合物的水平差。
在研究準確、快速和經(jīng)濟的對免疫復合物檢測方法方面，已經(jīng)嘗試了許多不同的技術手段，以此來為包括自身免疫病在內的;許多以產(chǎn)生免疫復合物為特征的疾病診治服務。雖然常有天才的發(fā)明家出現(xiàn)，但還沒有被認為是完好的方法。以下是先有技術方法中所受限制的例子。
首先，鰩魚(Raji)細胞測定法，它取決于細胞膜表面上的免疫復合物受體的存在，而這些受體僅僅出現(xiàn)于細胞培養(yǎng)過程中細胞生長的某些特定時期。
其次，作用于免疫復合物的補體部分或抗體，常用于進行放射免疫測定或酶聯(lián)免疫吸附測定。不幸的是，用于起固定作用的補體和抗體都是不穩(wěn)定蛋白。這種不穩(wěn)定性導致敏感性、專一性和再現(xiàn)性的喪失。因此那些依賴于補體固定作用的測定方法，無論測定中的固定作用是直接的還是通過抗體吸附介導的，都由于這種不穩(wěn)定性，而使之不具備臨床檢驗的可依賴性。
另外，免疫球蛋白的種類和大小限制了補體依賴測定法(Complement-based assays)的使用。鰩魚細胞測定法和補體依賴測定法一般均不能將免疫復合物中的抗體種類和亞種詳細測出來;只限于這樣幾種IgM、IgG1，IgG2，和IgG3。鰩魚細胞測定和其它的補體依賴測定法一般僅能檢測出分子量大于1，000，000道爾頓的復合物。正是這兩條主要限制了鰩魚細胞試驗和補體試驗。
最后一點，目前，使用如聚乙二醇、葡聚糖、金黃葡萄球菌(Staph ylocuccus aureas)蛋白A等物質進行沉淀的液體物理化學技術效果不佳，原因是在處理那些微小的不斷出現(xiàn)的絮狀物沉淀物方面仍有一些無法克服的困難。還有，與免疫無關的免疫球蛋白同沉淀物的偶然連結會更進一步降低這類實驗的結果。這些困難大大地妨礙了這類免疫復合物測量方法的應用。克服這些限制需作大量的實驗，因此而提高了對患者的收費。結果是，許多實驗沒有按要求進行，也沒有及時地、嚴格地監(jiān)視患者疾病醫(yī)治方面取得的進展。開發(fā)出一種能將免疫復合物粘附在一個固體支持物上的，既經(jīng)濟又有效的方法，對解決這些問題是重要的。
本發(fā)明的目的在于提供能夠選擇性地吸附或附著免疫復合物的組合物方法及材料，從而可有效地用于檢測眾多類或亞類的免疫復合物。本發(fā)明的目的之二即在于克服如前所述的將免疫復合物吸附在固相表面上用于檢測，從血清中去除免疫復合物等所有方法中的，在選擇性、穩(wěn)定性和處理等方面的不足之處。本發(fā)明的目的之三在于提供新穎的、高度適用的和易于掌握的應用手段，對經(jīng)過附著作用而附著在支持物上的復合物之成分進行檢測;并且進而將其用于臨床對免疫復合物進行檢測、分離和濃縮，或用于任何其它與人類或脊椎動物醫(yī)學有關的目的。
本發(fā)明所包括的是對免疫血清中或其它體液中存在的免疫復合物進行直接的不論什么機制的選擇性吸收，吸附或附著的新組合物、新方法和新材料，用于鑒別、數(shù)量化或分離的目的。
在極廣的意義上，本發(fā)明利用免疫學非專一性的氨基酸肽鏈，這種肽在吸附免疫復合物方面具有某種特別的親和性。正如在此所述，這種免疫學非專一性的氨基酸肽鏈以及與之相似的經(jīng)修飾的氨基酸肽鏈用來對血清及其它體液中的免疫復合物進行直接地有選擇地吸附。
有效地應用在本發(fā)明中的這類氨基酸肽鏈包括一些寡肽，多肽和蛋白質以及一些經(jīng)修飾或取代的寡肽、多肽和蛋白質。尤其那些經(jīng)過糖基化或經(jīng)過功能性等同取代物修飾或取代的多肽和蛋白質，取代物如硫代糖、羥基或硫代氨基酸、羥基或硫代脂類，以及被發(fā)現(xiàn)可以同免疫復合物直接結合的在化學性質上有關聯(lián)或相似的一些物質。糖基化蛋白(以下稱作糖蛋白)則更好，但本發(fā)明所應用的最有效的是某些球蛋白的片斷如免疫學非專一性的γ-球蛋白(gama-globulins)。
不管免疫復合物是包括任何單組的還是亞組的抗體，也不論液體所含的免疫復合物的來源是體內還是體外，這些都不會給本發(fā)明的應用造成限制，這是因為抗體在選擇性地同抗原結合以后，其物理化學性質的改變使得抗體分子的穩(wěn)定性增加了。
本發(fā)明所選用的糖蛋白，來源于對某種特定的γ-球蛋白片段的提取(Cohn E.J.(1946)，J.American Chemical Society 68，459)。這些糖蛋白來自未受人蛋白或免疫復合物免疫的動物，因此這些試劑同免疫復合物在能與抗原決定簇結合的Fab分段上不發(fā)生任何吸附作用。根據(jù)觀察結果，發(fā)現(xiàn)抗體通過糖基的相互作用將復合物主要吸附在“Fc”的糖分子。這樣本發(fā)明就同從前所述的許多對免疫復合物進行蛋白質固定的方法有相當?shù)膮^(qū)別。
這樣的糖蛋白制劑，長期以來被用于阻止游離的抗體隨機地同固態(tài)支持物的結合，但唯獨地，又是十分令人驚奇地發(fā)現(xiàn)的是，在固態(tài)支持物上形成一個糖蛋白外膜，可以選擇性的吸附抗體，而被吸附的抗體是可以抗原發(fā)生免疫結合的抗體。這樣免疫復合物就將被吸附在γ球蛋白外膜上而游離的抗體則不被吸附。為檢測存在于血清、血液及其它體液中的免疫復合物，本發(fā)明提供出了一種本質上得到了改進的檢測方法。也為那些遭受自身免疫病和以形成免疫復合物為特征疾病之苦的患者提供了一種特別有用的，選擇性地從血清中去除這類復合物的方法。
根據(jù)本發(fā)明優(yōu)先選用的實例，首先將選自所述組中的糖蛋白的薄膜粘著在一種固態(tài)支持物介質上，以作為一種選擇性的吸附劑、它可以吸附液體中的能和薄膜相接觸的各種免疫復合物。這種糖蛋白外膜是具備如前所述的能吸附免疫復合物的性質的任何一種，優(yōu)先選用的是按如前所提及的方法得到的免疫學非專一性牛γ-球蛋白片段。
當這種外膜吸附在固態(tài)介質上以后，這種具有糖蛋白外膜的支持物可以從任何含有免疫復合物的液體中將可以與外膜接觸的免疫復合物選擇性地吸附上來。然后，被吸附的免疫復合物可以用來1)進行成分測定，可使用各種已知的免疫學方法，優(yōu)選酶聯(lián)免疫吸收劑測定;2)濃縮并提純，或3)如果需要的話，可將已去除了免疫復合物的體液回注給患者，為臨床治療服務。
在下面的例子中，這種薄膜是這樣形成的。即將選出的丙種球蛋白部分置于PH依賴的蛋白質變性環(huán)境中，然而，任何形式的吸附，只要能正好讓那些能與免疫復合物特異性結合的糖蛋白保存固定下來，就都可使用。固定方法非限制性例子包括有熱聚集、離液序列高的伸展(chaotropic unfolding)、使用像戊二醛這樣的化學試劑進行聚合交聯(lián)、干燥、冷凍以及其它類型的方法。
接下來的對復合物定性和定量的測定就變得容易了，對各種免疫球蛋白專一的酶連抗體均可得到。對附著在支持物上的免疫復合物的定量測定，這種即方便又易行的測定法已首先由Engvall和Perlman應用酶聯(lián)免疫吸附(劑測定)法(ELISA)技術完成了，(1971)Immun-Chemistry8871-874和(1972)J.Immunology 109，129-235)，以及酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)，Voller，A.，Bidwell，D.E.和Bartlett，A.，(1979)Dynatech實驗室，Inc.，亞里山大里亞，弗吉尼亞，上述方法通過引述被完全并到本發(fā)明中。還可以通過使用抗原的直接酶連抗體來檢測專一性復合物結合的抗原。
圖1線條所示，按本發(fā)明步驟，用專一性免疫檢定法測得的正常與患病條件下的消光值情況。
圖2線條圖所示利用專一性免疫檢定法對正常血清和含有免疫復合物的血清，在非包被聚苯乙烯板上進行測定得到的消光值。
圖3線條圖所示對不同來源的免疫學的非專一性糖蛋白進行特異性免疫測定所得到的消光值。
圖4線條圖所示免疫檢定法得到的血清上柱前及上柱后的消光值，該柱是經(jīng)過免疫學的非專一性糖蛋白預處理過的。
圖5線條圖所示本發(fā)明的又一具體實施方案的結果。
圖6線條圖所示本發(fā)明對全血成分的檢測時所得到的結果。
圖7線條圖示本發(fā)明用于去除體液中的相關免疫復合物的相對百分比情況。
圖8圖示人血清經(jīng)過凝膠過濾，和對其中的免疫復合物的溶解和測定。
圖9圖示經(jīng)過圖8凝膠過濾后得到的組分用瓊脂糖測分子量后得到的結果。
圖10圖示一個微滴板的正面觀，該板適用于形成本發(fā)明的材料，特別適用于免疫分析。
圖11圖示選自圖10中11-11兩孔間橫斷面的局部放大圖，顯示了制備出的實用的微滴板。
以下所述定義用于對本發(fā)明進行詳細說明免疫學的非專一性氨基酸肽鏈在此所指的是各種寡肽、多肽和蛋白質以及它們的變異體。它們均由那些未受過抗原決定簇或免疫復合物作用的生物體內衍生得到;這些抗原決定簇來自用于實驗的種類或至少與這些種類有關，免疫復合物同樣也來源于這些種類，各種附著，粘著，吸附這些種類中的免疫復合物的功能，或著使免疫復合物固定在原來位置上的功能。除了前面提到的這些天然物質以外，該定義還包括合成的氨基酸肽鏈。這類合成可以在肽鏈合成器中進行，也可通過類似的化學過程，或是通過遺傳性改變已有的或新產(chǎn)生病毒、細菌、真菌、酵母或其它重組體、雜交細胞載體或者宿主來實現(xiàn)。然而，設想的是這些寡肽、多肽和蛋白質以及其變異體，如果它們是從沒有經(jīng)它種免疫的種類中得到，并且又具有對受試種的免疫復合物進行附著，吸附或使其固定于原來位置的能力的話，那么，它們將可用于本發(fā)明。
糖蛋白在此所指的是由多糖與蛋白或來自首次免疫或免疫學非一性的氨基酸肽鏈的任何形式的組合，其中的兩種成份是由共價鍵在多糖和蛋白(或)多肽之間連接。
丙種球蛋白在進行電泳時，在血清蛋白的γ區(qū)具有運動性的任何球形糖蛋白。
免疫球蛋白任何擁有結合其它試劑的化學能力的丙種球蛋白，這些試劑包括蛋白質、碳水化合物、核酸、脂質復合體，簡單的有機化合物以及任何能與丙種球蛋白通過在“Fab”抗原結合分段上相互以特異性相聯(lián)結的化合物。
抗體蛋白質的免疫球蛋白中的一種。哺乳動物的抗體分子的結構至少包括兩個Fab和一個FC區(qū)域。
抗原抗體直接同這類化合物進行作用并為其提供結合位點，可以在抗體分子的Fab抗原結合分段上發(fā)現(xiàn)這類化合物。
免疫球蛋白的分類免疫球蛋白是根據(jù)電泳移動率來劃分的。已經(jīng)認識到的分為五種，但不一定就局限為這五種，它們分別是免疫球蛋白A、D、E、G和M、也可將這種分類簡化用IgA、IgD、IgE、IgG和IgM來代表。
免疫復合物抗體和抗原的結合，這種結合是通過抗體分子的Fab結合位置和抗原分子的形態(tài)特征之間的相互作用而實現(xiàn)。
免疫應答當特異性抗原引起機體產(chǎn)生相應這種抗原之抗體的作用，或引起細胞防御機制的特異性作用而將抗原吞噬和細胞毒作用，或其他細胞的介質系統(tǒng)作用的一系列反應。
首次免疫(immunologically Naive)動物個體和群體包括人類的免疫系統(tǒng)的條件即從未以體液的或細胞介質的產(chǎn)生免疫應答產(chǎn)物的方式暴露于抗原。
非特異性免疫活性的(immunologically non-Specific)出于本專利申請的目的，術語“非特異性免疫活性的”指一些抗體或抗原物質，這些物質對免疫復合物的組分不是選擇性的，也不是直接作用的，這在實驗中經(jīng)過了詳細研究。這類非特異性抗體確實存在于對免疫復合物組分是首次免疫的動物的血清中，相反，免疫學特異的抗體則可發(fā)現(xiàn)于被免疫的并對包括整個復合物或其任一成分在內的免疫復合物成分有抗性的動物中。
非特異性的即非特異性免疫活性的(見上)。
補體一種熱不穩(wěn)定物質、通常存在于血清中，對某些細菌和被補體連接的特異性抗體所敏化的其他細胞是毀壞性的。
血清指體液中除去細胞和可凝性纖維蛋白后的液體部分，可凝蛋白如纖維蛋白，去除方法可采用通常的物理、化學或物理化學的手段。狹義地講，該術語指血液凝固后去除血凝塊的殘留水液，但廣義的講，則包括有腦炎液、尿液、胞間組織液、細胞質等一類的液體。
堿性碳酸鹽緩沖液除非有特殊情況，則是指使用按如下方法制成的緩沖溶液，0.1摩爾的碳酸鈉溶于用900ml脫礦質水，然后用氫氧化鈉將緩沖液PH值調至9.6，再加脫礦質水至1000ml。
牛的丙種球蛋白溶液將純化的牛丙種球蛋白(Cohn，E.J.(1946)J.American Chemical Soc.68，459美國化學會雜志)按每毫升溶液含1.0毫克的比例溶在堿性碳酸鹽緩沖溶液中。
磷酸鹽緩沖液先配制濃度為每升9克的氯化鈉溶液。然后在溶液中加入0.01摩爾的磷酸二氫鉀、調節(jié)溶液PH為7.4，再加脫礦質水至1000ml。
吐溫20，(Tween-20)先將該化合物用磷酸鹽緩沖液處理一段時間。當需要時，按吐溫-20濃度為0.05%v/v使用。非離子形去垢劑吐溫-20常用來限制蛋白質間的非特異性結合。
結合抗體用于酶免疫法檢測待測物，可獲得抗人免疫球蛋白部分的抗體。這些抗體再同辣根過氧化酶以化學方式相結合，以此作為一種檢測用試劑。制得的抗體用500～2000倍的含有吐溫的磷酸鹽緩沖鹽水稀釋，備用。
底物溶液為了使辣根過氧化酶便于定量，在鄰苯二胺(400μg/ml)溶液中再加入含有10微摩爾過氧化氫的磷酸鹽緩沖液。該溶液現(xiàn)用現(xiàn)配，并置于暗處保存防止光的降解作用。
標記抗體為了選擇性地識別不同類的抗體，將抗體分子以共價鍵或離子鍵的形式同某一分子或離子結合在一起。這類加合上去的分子或離子中包括有酶分子，熒光性物質，放射性核素等。
標記抗原同樣為了選擇性地識別不同類的抗原，將某種分子或離子以共價鍵或非共價形式同抗原分子結合。這些結合分子或離子包括酶、熒光物質、放射性核素等。
光密度值(OD)或消光值該數(shù)值說明樣品對顏色的吸收。光密度值(OD)與樣品的透光率，有如下關系式OD＝2-log透光率通過在預先確定的PH值環(huán)境中發(fā)生的變性作用，或借助共價化合物，或通過熱聚集作用，或在有或無化學交聯(lián)劑參與下進行的紫外介導交聯(lián)作用;或通過其它物理的或化學的方法，或它們的結合，蛋白質和多肽，包括糖蛋白和糖肽，能夠附著在許多固體載體上，這些載體物質是塑料、玻璃、聚合體和樹脂等。此外，固態(tài)載體還包括糖蛋白、糖肽和各種蛋白質類物質，以及經(jīng)過各種物理的或化學的變異或同時經(jīng)過物理和化學變異形成的蛋白質物質，形成不溶解的蛋白纖維，帶有或不帶有另外的支持性或作為成分的材料，諸如多聚性、硅性、樹脂性的或無機纖維狀的物質，或處理后就使用，但不形成纖維，即形成含有所需糖蛋白，糖肽等的固相物。
正如以下所述，這類糖蛋白形成的膜或不溶解的制品具有非凡和意想不到的特性，它們能夠選擇性地吸附體液樣品中的免疫復合物，其中包括但不限于與膜包被的支持物和與糖蛋白制品相接觸的生物液。下文是對本發(fā)明優(yōu)先選用的關于膜制備的說明;還包括優(yōu)選的膜對體液中存在的免疫復合物吸附的方法及對固著于載體上的復合物進行檢測的方法。來源于預先未用人血清蛋白處理過的某種動物群體的丙種球蛋白，是本發(fā)明的優(yōu)先選用的實施方案。
步驟1糖蛋白膜的固著將純化的牛丙種球蛋白與PH9.6含0.1摩爾碳酸氫鈉緩沖液相混溶。最后使丙種球蛋白在該溶液中的濃度為1.0mg/ml(w/v)。這種溶液用于制備糖蛋白膜。
為使牛丙種球蛋白的薄膜固著在一個受體表面，將200微升預先制備好的牛丙種球蛋白溶液，分別加在微滴板P上的96個孔中。這類Dynatech ImmulonⅡ型平板具有許多20號孔位。如圖10和11所示平板P的20個孔(wells 20)位于不同的橫行和豎行上，并帶有適當?shù)臉擞浵狄员愦_認其位置。由附圖10所示的標記系可看出，豎行的小孔以數(shù)字1-12來確認，同時橫行用字母A到H來表示，這樣在進行樣品試驗時，就可以保證提供一個準確相互聯(lián)系的結果。正如可證明的那樣附圖10的平板上有96個小孔，雖然每孔的具體數(shù)字可用所需方式來標明。將平板置于一個37℃恒溫的潮濕容器中，4個小時后取出來。雖然在下文中敘述的實施方案是在微滴板上進行的，但是在塑料管中進行的測定同樣是有效的，其中包括將管的內側成型，以增加塑料管的接觸面積。當用塑料管進行測定時，管與小孔對成膜時間的差異，和丙種球蛋白濃度對二者的敏感程度的要求之差異均是很微小的、其結果相當;管子內緣成型與否對結果無影響。
沒有固著上的丙種球蛋白通過倒去平板中的溶液將其去除，然后用PH7.4濃度0.9%的鹽溶液(其中含0.01摩爾磷酸二氫鉀)洗滌平板三次，得到21位置上的一層丙種球蛋白薄膜。如附圖11所示，在22位置優(yōu)選但并不是必須的將一層帶有保護作用的由多聚體物質形成的膜附蓋在開孔2D上。
步驟2用步驟1制得的膜對免疫復合物吸附用磷酸鹽緩沖液按血清等分稀釋法將體液分級稀釋后，分別與平板上的不同孔進行混合。稀釋作用對產(chǎn)生適于步驟3(酶聯(lián)測定)產(chǎn)生合適的顏色是必不可少的。在后述的大多數(shù)實施例中，優(yōu)先選用的最適稀釋度為1∶15(血清體積∶稀釋劑體積);雖然還可選用更寬比例的稀釋度，但這取決于體液自身的性質和所包括采用的檢測方法和技術。體液制劑中還包括要加入免疫學的非特異性的氨基酸肽鏈(如此所定義)。
然后將稀釋好的體液樣品加入稀釋平板中合適的小孔中。樣品中的免疫復合物對固態(tài)載體的粘著度，經(jīng)過至少10分鐘37℃的溫育而得到強化。在以下的檢測實施例中，在此段所述的粘著度溫育時間為30分鐘。
通過溫育獲得復合物粘著后，從小孔中傾去樣品，樣品中含有的非復合抗體物質也被傾去。這樣做是由于，游離態(tài)的抗體比吸附到復合物上去的抗體要多、而且殘留的游離抗體會增大背景吸收值。然后將平板用步驟1所述的磷酸緩沖液洗滌三次。在緩沖液中也另外加入0.05%(v/v)濃度的吐溫20溶液，以進一步地減少游離抗體的隨機吸附作用。
步驟3對固著在平板上的免疫復合物的測定盡管可以使用許多合適的檢測方法和手段，如放射性標記、熒光標記等等，但是還是采用了如前所述的標準酶聯(lián)測定技術對免疫復合物進行測定。在如下敘述的實施例中，使用由誘導山羊產(chǎn)生的抗人IgG抗體來檢測在復合物中是否含有人IgG成分。將這些抗血清物質與辣根過氧化物酶相連接，該酶的底物在有過氧化氫存在的條件下產(chǎn)生一種具有顏色的產(chǎn)物。選用的底物應同酶在聯(lián)接在抗體上以后的活性相對應。下面的實施例中選用的底物是鄰苯二胺。在這種條件下辣根過氧化酶催化反應的產(chǎn)物是在酸性溶液中呈栗褐色的乙腈。有許多底物即適合這種酶的催化又適合其它種類酶的催化。例如四甲基聯(lián)苯胺能在過氧化酶的催化作用下生成一種用肉眼易見的深蘭色產(chǎn)物。還有許多種化合物能在堿性磷酸酶的催化作用下脫去磷酸基，其中包括對一磷酸硝基苯。對一磷酸硝基苯的催化反應生成的產(chǎn)物是深黃色對一硝基苯酚。另外許多化合物受磷酸酶的催化可產(chǎn)生顏色變化，其中包括磷酸百里香酚(thymol-phosphate)。本實施方案的描述，并不限于使用某一種單一的檢測手段，可以是通過直接的酶聯(lián)測定，使用辣根過氧化酶、堿性磷酸酶、β-半乳糖苷酶等;也可以使用化學反應物手段測定，不論所選用的檢測方式任何，本測定法同樣有效。這類檢測方法可以是，但又不限于是酶聯(lián)免疫測定法和熒光抗體法，其中酶聯(lián)免疫測定法是通過將用于檢測復合物的酶同抗體或抗原或其它選來檢測附著在膜上的免疫復合物的組份相結合;熒光抗體法是通過熒光物質與抗體，或抗原，或其它物質結合，這些物質是借助各種物理的、化學的、物理化學的手段和其它能對這種免疫復合物進行直接檢測的方法，對附著在膜上的免疫復合物進行檢測的物質。除此之外，在用這一檢測過程對免疫復合物進行測定時，同樣還可應用一些間接的檢測方法。這類間接方法包括但不僅限于第二抗體技術，生物素一抗生物素蛋白復合物或生物素-鏈霉抗生物素蛋白復合物法及類似的修飾放大作用法和能夠對附著在膜上的免疫復合物進行間接檢測的其它方法。此外，還使用其它對附著在膜上的免疫復合物進行檢驗的生物學方法。這類方法包括應用一些活的或是死亡的細胞，它們可來自細胞培養(yǎng)或取自活的或死的生物體，不論是原核的或是真核的，也不論是單細胞的或是多細胞的。對這些細胞進行生物學處理后得到的成分能用于對附著在膜上的免疫復合物進行的測定，這些成分是但又不限于是核酸、核成份、細胞成分、細胞膜成分及外源凝集素、受體、調理素等，條件是得到的外源集素、受體、調理素等物質具有和免疫復合物及其各組分發(fā)生相互作用的能力。最后，還有一類不同于前面所述的并且同樣有效的方法，這種方法是通過各種物理的和化學的手段對附著在膜上的免疫復合物進行檢測。這方法中包括但不限于改變溶液的PH值、利用光極化作用、改變溶液的折射度，改變其電性質如導電性和pizeoelectric行為以及電容電介常數(shù)，改變表面物質的比熱等一系列手段，以及所有能用于對附著在膜上的免疫復合物進行檢測的其他物理手段。
按前文所述制備方法，將聯(lián)接有山羊抗體的辣根過氧化酶溶液分別加在稀釋平板上的每個小孔中。這種試探抗體同人IgG復合物中某一部分的結合至少要經(jīng)過15分鐘時間、并且要求在37℃下進行。然后將板從溫育箱中取出、倒棄板中溶液，按步驟2方法洗滌。最后一次洗滌最好使用不含吐溫緩沖劑，以防止對辣根過氧化酶連接的抑制作用。
如前文所述，在進行反應的板中于室溫暗處加入含有鄰苯二胺(濃度400μg/ml)和3-10微摩爾的過氧化氫磷酸鹽緩沖液而進行溫育決定的標記酶的數(shù)量。將反應繼續(xù)10分鐘或直到產(chǎn)生一定的顏色并能用分光光度儀進行分析為止。然后另外加入等體積2.5摩爾硫酸溶液中止反應、并用分光光度儀(型號Dynatech MR600或其它型)測出溶液的光密度值(或消光值OD)。
用酶聯(lián)免疫吸附劑測定法進行測定時，反應物的合成顏色與結合在免疫復合物上的抗體之間存在一定的比例關系。在大多數(shù)情況下，結合上的抗體同免疫復合物中的人IgG蛋白之間具有線性關系。因此可得出這樣的結論，酶聯(lián)反應的消光值增加或光密度值增加，就意味著附著在膜上的免疫復合物量的增大，即有更多數(shù)量的免疫復合物附著在膜上。
實施例實施例1糖蛋白膜對血清中免疫復合物的吸附選擇性按下列步驟在聚苯乙烯平板上包被牛丙種球蛋白膜1).從科恩組分Ⅱ制劑中純化來的牛丙種球蛋白溶解在堿性緩沖液中(0.1摩爾碳酸鈉，PH9.6)。
2)將含有牛丙種球蛋白的堿性緩沖液加到平板上，并將其置于37℃條件下4小時。
3)經(jīng)過培育從平板中去除膜溶液。用爾NaCl的磷酸二氫鉀緩沖液(0.01摩爾、PH值7.4)緩沖的NaCl溶液(0.15M)洗滌平板三次，以洗去沒結合的丙種球蛋白。
然后用這種牛丙種球蛋白膜包被的平板測定人血清樣品中的免疫復合物，這些樣品分別來自1).無明顯病理的正常個體;
2).緩解型的系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者(REMSLE);
3).中晚期的系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者(SVRSLE);
4).中期類風濕性關節(jié)炎患者。
這些樣品血清都預先經(jīng)過放射免疫擴散法和酶聯(lián)免疫測定法(CLgELISA)檢驗過、證實其中含有與各自病理狀態(tài)相應的免疫復合物。
如下在表一中所給出的是利用按前述制備的牛丙種球蛋白膜包被的平板進行的具有代表性的免疫復合物測定，結果如附圖1所示。獲得這些數(shù)據(jù)的處理過程總結如下1).試驗前，用含0.15MNaCl的濃度為0.01MPH值為7.4的磷酸鹽緩沖液(以下用PBS代表)按一定比例稀釋血清。本實施例所用血清與PBS的體積比為1∶15(v/v)。
2)然后再按0.1ml等分稀釋將血清加入板上預先選定的孔中。本實施例對每一個樣品進行7次重復測定，然后取平均值。
3)將載有樣品的板置于37℃的潮濕培育箱中30分鐘。取出經(jīng)過培養(yǎng)后的平板、倒去液體，然后用每溶液含有0.5毫升吐溫20(Tween-20)的PBS洗滌板三次。
4)將平板置于含有特異性抗人免疫球蛋白G(IgG)丙鏈的抗體混合液中，該抗體聯(lián)有辣根過氧化酶，然后在37℃下培養(yǎng)15分鐘，使該抗體和IgG形成抗體-抗原復合物(Anti-IgG)。培養(yǎng)后的平板用PBS洗滌三次以去除沒有結合的酶聯(lián)抗體。
5)在平板上的小孔中加入含有鄰苯二胺和過氧化氫的PBS，并測定辣根過氧化酶的活性。用加硫酸溶液中止反應后出現(xiàn)的栗褐色檢定復合物的存在。用Dynatech MR600平板讀數(shù)分光光度儀在490納米波長下對這種顏色進行定量。用平板上不加入人血清液的小孔作空白劑進行分光光度的校準。
表1糖蛋白膜對免疫復合物的吸附血清來源 平均光密度(平均消光值) 標準誤(差)正常人 0.133 0.004緩解型系統(tǒng)性紅0.269 0.006斑狼瘡(REMSLE)患者晚期系統(tǒng)性紅斑 0.617 0.008狼瘡(SVR SLE)患者中期類風濕性關節(jié)炎患者 0.869 0.013表注(附注)平均光密度(平均消光值)一欄所列數(shù)據(jù)、是按前文所述方法在490nM光波條件下得到的光密度值列出的數(shù)據(jù)是每個受檢樣品7次測定的平均值。
標準誤差一欄所列出的數(shù)據(jù)是指平均值的標準差。
略語SLE系統(tǒng)性紅斑狼瘡。
RA類風濕性關節(jié)炎。
牛丙種球蛋白處理過的載體介質對免疫復合物的吸附性用孔內出現(xiàn)的血清被吸附物質的增加表示，這種血清取自免疫復合物疾病的患者。進而在樣品顏色的深度和疾病嚴重程度之間觀察到好的相關性。正常人血清在測定時不會被誘導出深顏色來，這一事實剛好又成了這種膜板對免疫復合物具有特殊性的一個旁證。這種測定方法對血液和抗凝血血漿同樣適用。
實施例2用非膜包被聚苯乙烯平板對血清中免疫復合物的吸附。
為證實糖蛋白膜所具有的優(yōu)越性，將一塊沒有糖蛋白膜包被的聚苯乙烯平板加上實施例1所用各種血清并在相同條件下培育。然后用過氧化酶聯(lián)抗IgG抗體處理平板并按前面所述方法進行酶聯(lián)免疫測定。正如所預期那樣、這種沒有用糖蛋白處理的平板僅出現(xiàn)很微弱的選擇性。另外還觀察到這種平板背景吸收值很高，這同經(jīng)過牛丙種球蛋白預處理過的具有選擇性的平板對背景物的吸附有差異。按這種方法得到的結果記錄在表2中并用附圖2表示。附圖2中條形圖所示為7個重復測定的平均吸附值。
表2用非膜包被的聚苯乙烯對免疫復合物的吸附血清來源 平均光密度 標準誤差(平均消光值)正常人 0.431 0.020緩解型系統(tǒng)性紅斑狼瘡 0.682 0.021系統(tǒng)性紅斑狼瘡晚期患者 0.599 0.041類風濕性關節(jié)炎中期患者 0.781 0.031附注同表1類似，列在平均光密度欄下的數(shù)值表示按前面所述方法在490鈉米光波時測得的平均光密度值(平均吸附值)。
給出的數(shù)值是對每個樣品7次測定結果的平均值。
標準誤差欄下所列的數(shù)值是平均值的標準差。
用該非膜包被板上未加人血清的孔作為分光光度值的標準空白液。這種空白液的小孔經(jīng)過除加人血清以外的所有實驗過程?？瞻滓簺]有顏色。
實施例3
將純化的來源于許多不同動物種的丙種球蛋白按實施例1所述方法處理平板。然后在平均板上添加實施例1所述的免疫復合物豐富或貧乏的血清。經(jīng)過添加和洗滌，按實施例1所述對平板吸附的免疫復合物用辣根過氧化酶聯(lián)抗IgG抗體免疫測定。經(jīng)過上述處理后得到的結果記錄在表3中并用附圖3表示。
表3用來自不同動物種的丙種球蛋白包被過的聚苯乙烯平板對血清中免疫復合物的吸附膜來源 正常血清 緩解型系統(tǒng)性狼瘡 RA(類風濕性關節(jié)炎)山羊 0.102 0.108 0.831狗 0.052 0.136 0.483馬 0.001 0.001 1.040兔 0.068 0.178 1.045綿羊 0.131 0.154 1.024附注表3中所列數(shù)據(jù)均是按前文所述方法在490nM時測得的平均光密度值(平均消光值)。所用平板用不同的丙種球蛋白包被，其來源如表左側所列。
表上部所列為血清來源。
通過對表3和表1的比較可清楚地看出丙種球蛋白包被的載體具有特異性吸附免疫復合物的性質。而且表中所列的每種膜都能吸附存在于特定的人血清中的免疫復合物，特別適用于處理來源于病理狀況下人血清中的免疫復合物。盡管可能會發(fā)現(xiàn)各種不同的膜具有不同的性質，但所使用每一種丙種球蛋白的膜對免疫復合物都具有選擇性吸附作用。血液和抗凝血血漿同樣也可用這種方法進行測定。
實施例4
用丙種球蛋白包被的聚苯乙烯小顆粒去除免疫復合物。
為使免疫復合物吸附在聚苯乙烯小顆粒(BioBeads，SM4，20-50目，BioRad Laboratories，Richmond，Califonia)上，選用一種含有丙種球蛋白(濃度為每毫升PH9.6的碳酸緩沖液中含1毫克牛丙種球蛋白，與實施例1相同)的堿性制劑處理聚苯乙烯顆粒。將含有免疫復合物的血清在37℃下通過充有處理過小顆粒的柱，血清中免疫復合物的含量先按與實施例1相同的方式測定，對上柱過濾前與過柱后血清免疫復合物的量定量測定。實驗結果如表4所列并在附圖4中予以表示。
表4用膜包被的聚苯乙烯顆粒去除血清中免疫復合物血清來源上柱前OD值 過柱后OD值正常人 0.155 0.033系統(tǒng)性紅斑狼瘡晚期患者 0.601 0.035表附注表中所列各部分分別為來自正常人和患有系統(tǒng)性紅斑狼瘡病患者的血清樣品，血清按前文所述方法過堿性牛丙種球蛋白處理的柱。
上柱前(pre-column)和過柱后(post-column)對血清中的免疫復合物進行測定。
表中所列的數(shù)值就是血清在上柱前和過柱后的光密度值。
用牛丙種球蛋白包被的聚苯乙烯顆粒以這種方式選擇性地快速地吸附免疫復合物。一次過柱就有90%的免疫復合物被去除。因此可看出，這種經(jīng)過堿性球蛋白處理過的聚苯乙烯顆粒在相對迅速地去除血清樣品中的免疫復合物方面是有效的。用與前面所用相似的糖蛋白進一步處理大型的分離柱，使柱能以最大容許量去除血液中某些具有特殊作用的免疫復合物，可以使本發(fā)明能夠用于實際治療。以此種方法處理血清將有助于選擇性地將血液循環(huán)中的免疫復合物除去。通過柱對血液中大量免疫復合物的分離作用，使所述復合物得以濃縮，并使得對血液中各種微量成分的測定成為可能，這些成份是個體遺傳型免疫球蛋，各種稀有的抗體亞種和各種存在于該免疫復合物中稀有的和不常見的抗原。以上方法對抗凝血血漿測定同樣適用。
實施例5本實施例的目的是要說明在固定化糖蛋白膜上用液態(tài)牛丙種球蛋白對免疫復合物測定的優(yōu)越效應。液相的加入被證明對降低含低水平免疫復合物的正常血清的基底值是非常有效的。
為此目的選用兩種血清樣品進行實驗。第一種樣品取自無臨床病理特征的，但用前面所述方法測定其免疫復合物的結果仍為陽性的患者。第二種血清樣品取自系統(tǒng)性紅斑狼瘡晚期患者。用含0.15摩爾NaCl.0.01M濃度。PH值為7.4的磷酸鹽緩沖液稀釋這兩種血清樣品，或用含有牛丙種球蛋白的磷酸鹽緩沖液(濃度為每毫升緩沖液中含牛丙種球蛋白1毫克)稀釋。
稀釋樣品后，分別對這四種制劑按實施例1至3所述的特殊方法進行固相法測定、檢測其中免疫復合物的量。加入酶聯(lián)物形成栗褐色后用Dynatech MR600平板讀數(shù)分光光度儀在490納米下測定，結果記錄在下表中并將數(shù)據(jù)繪制成圖。
表5稀釋血清液來源 無BGG 有BGG正常人 0.739 0.020系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者 0.390 0.323附注上表中所列實驗用血清是由血液凝固后獲得的。表中“正?！钡臉酥颈硎狙鍋碓从谠趯嵤╈o脈切開放血術實施期間無明顯臨床病癥的人。“SLE”則表示血清來源于具有系統(tǒng)性紅斑狼瘡臨床癥狀的患者。測定前，血清用稀釋劑按1∶15稀釋。用含有0.15摩爾NaCl PH.7.4的磷酸鉀緩沖液(濃度為0.01M)稀釋劑處理“無BGG”柱。用溶有牛丙種球蛋白的按如前所述的磷酸鹽緩沖處理含“有BGG”的柱，其中牛丙種球蛋白的濃度為每毫升磷酸鹽緩沖液含2.5毫克牛丙種球蛋白。
這些稀釋后的血清按實施例1至3所述免疫復合物測定法測定。表中的數(shù)據(jù)是四次重復測定的平均光密度值。
附圖5所示血清樣品經(jīng)過磷酸緩沖液和含有0.1mg/ml牛丙種球蛋白的緩沖溶液稀釋后得到的結果。稀釋后的樣品用實施例1、2和3中所述的固態(tài)測定法對其中免疫復合物進行測定。附圖5中線條的高度表示經(jīng)過四次重復測定后得到的平均光密度值。附圖5中正常表示血清來源于無明顯臨床病理特征的人。SLE表示血清來源于系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者。一BGG表示血清僅用磷酸緩沖液稀釋而十BGG則表示血清用每毫升含1毫克丙種球蛋白的磷酸鹽緩沖液稀釋。
加入牛丙種球蛋白可使正常血清稀釋液的消光值差不多降低40倍。當對經(jīng)過牛丙種球蛋白稀釋過的正常血清進行測定時，確實觀察不到什么顏色。相反，用含有牛丙種球蛋白的緩沖液稀釋正患自身免疫紊亂病人的血清就不會產(chǎn)生多少顏色的變化無論用肉眼或是使用分光光度儀都難以檢測這種變化。由此可見，經(jīng)過牛丙種球蛋白的稀釋作用，在正常血清和具有自身免疫癥狀之間出現(xiàn)了16倍的差異，不加入牛丙種球蛋白則不會有這種差異。此外，利用本方法進行類似的測定檢驗可有實效地排除自身免疫的假陽性患者，同時又可評價真正的患者。這些結果清楚地表明包含類蛋白牛丙種球蛋白的稀釋劑的優(yōu)越效果，這種效果可以有效的降低假陽性率而又不實質性地改變真陽性率。前述各實施例具體說明所述的對免疫復合物吸附法的應用。本實施例中數(shù)據(jù)表明不管是否使用常規(guī)抗凝血劑，在此以前所述的固定技術都同樣可以用于血液和血漿。
本實施例所用血樣分別取自健康供血者和類風濕性關節(jié)炎患者。兩種血液各用四管。第一對管中均不加抗凝血劑;其余的管中均加入抗凝血劑;第二對管均加入足夠量的乙二胺四乙酸(EDTA)形成最后濃度為1.5mg EDTA/ml血的樣品;第三對管均加入足夠量的肝素形成最終濃度為28美國藥品單位(USP)肝素/ml血的樣品;第四對管均加入檸檬酸鈉形成最終濃度為3.5mg檸檬酸鈉/ml的樣品。
按如下方法處理和測定上述幾種樣品將第一對管中樣品(其中分別含有正常血和具高濃度免疫復合物的血樣)進行正常凝血并收集血清。制成的血清用實施例1至5所述的免疫復合物測定法進行測定。
從第二對管中的樣品取出等分全血試樣，用EDTA抗聚血，并且用實施例1至5所述的免疫復合測定法進行測定。通過離心作用將每種等分樣品的血漿成份分開，然后按實施例1至5所述步驟對血漿樣品中免疫復合物進行測定。
從第三對管中的樣品中取出全血等分試樣，用肝素抗凝血并按上述測定通過離心作用將等分樣品的血漿分開并用上文所述方法進行測定。
從第四對管中的樣品中取出等分試樣，用檸檬酸鈉抗凝血并用前法進行測定。通過離心作用將等分樣的血漿成份分開，并用上文所述方法進行測定。
以上實驗的結果列在表6中并用附圖6加以圖解。
由表6可明顯地看出，出于防止凝血的目的而在血液中加入抗凝血劑，對正常的和含有高濃度免疫復合物樣品的測定均無不良影響，一般來說，各種抗凝血物質只對測定結果起微小的改變影響，但它卻能對血清，血液和血漿的測定帶來高倍的高效值結果。根據(jù)這一結果基本上可以排除免疫復合物在本方法中的吸附作用是由于血清中某種成分如補體和團集素決定的假想。因為這些成分的活性需要有鈣(Ca)離子的存在，而EDTA和檸檬酸可清除血液中的鈣離子。本實施例的結果具體地說明了利用這種糖蛋白薄膜測定附著的免疫復合物的方法并顯示了這種在測定時使用的糖蛋白薄膜之驚人性質。
無論抗凝血物質使用與否，也無論是使用不經(jīng)凝集的血液還是經(jīng)過凝集后血液，來自表現(xiàn)有免疫復合物紊亂癥患者的血清測定值明顯比來自正常人的要高?；谏鲜鼋Y果，完全可以利用這種免疫復合物的附著性按上文所述方法對血漿和血液中存在的免疫復合物進行檢測和清除。根據(jù)前述試驗，可以清楚地看出，沒有理由將在此所述的去除免疫復合物的方法僅限于用在血漿和血液。此外很明顯，本方法所用的這種糖蛋白薄膜還將能吸附許多存在于其它液體中的免疫復合物，這些液體包括尿液，腹水液，腦脊液或其它盛在實驗室使用的玻璃杯中的液體，從而極大地提高了本發(fā)明的應用性。正如實例7所示的這種方法，即借助含有糖蛋白包被顆粒的柱，在含有抗凝血劑的血液和(或)血漿中進行免疫復合物清除作用，也可應用于患有自身免疫紊亂癥的病人身上，達到部分或全部去除免疫復合物的目的。
表6血液樣品中免疫復合物的測定狀況及條件 消光值 效正值 最終消光值 高出倍數(shù)正常血清 0.128 1.00 0.128 1血漿(含肝素) 0.107 1.00 0.107 1血漿(含EDTA) 0.118 1.00 0.118 1血漿(含檸檬酸鹽) 0.099 1.11 0.110 1血液(含肝素) 0.107 1.49 0.159 1血液(含EDTA) 0.095 1.49 0.142 1血液(含檸檬酸鹽) 0.075 1.66 0.124 1含高濃度免疫復合物
RA血漿 0.765 1.00 0.765 6血漿(含肝素) 0.864 1.00 0.864 8血漿(含EDTA) 1.031 1.00 1.031 9血將(含檸檬酸鹽) 0.830 1.11 0.921 8血液(含肝素) 0.637 1.80 1.145 7血液(含EDTA) 0.733 1.80 1.318 9血液(含檸檬酸鹽) 0.579 2.12 1.227 10附注樣品來源于無明顯臨床病理特癥的人(正常)及來源于類風濕性關節(jié)炎和脈管炎患者。血清指凝血后離心得到的血清。血漿指含有抗凝血劑的血液離心后得到的上清液?？鼓獎┮叶匪囊宜岬暮喡詷酥緸镋DTA，肝素簡寫為hep，檸檬酸鹽為cit。表中所列的均經(jīng)過抗凝血試驗。由于血液中血細胞和附加物質(如檸檬酸)的體積，故需考慮體積修正值。檸檬酸鹽溶液占總體積的10%。正常人血細胞比容占總血液體積的34%而高含量免疫復合物樣品的血細胞比容為44%。高出倍數(shù)表示用測得的高含量免疫復合物樣品的消光值比上正常樣品的消光值得到的比值。4種來自不同人的血樣，其中一種不含抗凝血物質，另外三個分別含有不同的抗凝血劑。其中含量分別為肝素28國際單位(IU)/ml;EDTA1.5mg/ml;檸檬酸鈉3.5mg/ml。血液，血漿或血清樣品全都用實施例1至5中所述的測定法進行測定。圖中線的高度代表按本測定過程得到的消光值。本表中的數(shù)據(jù)形象地表現(xiàn)在附圖6中。
實施例7正如實施例3中所述，用糖蛋白膜包被的固態(tài)載體填充的柱具有吸附血清樣品中免疫復合物的能力。本實施例中所出現(xiàn)的數(shù)據(jù)表示出這種柱進一步的利用性。通過加入抗凝血試劑如肝素、乙二胺四乙酸或檸檬酸鹽，可以阻止諸如血液這樣的體液樣品發(fā)生凝結。這些化合物阻止凝結作用方式，是通過對導致活化血纖維蛋白的蛋白水解的干擾作用(如肝素)，或是通過對鈣離子的螯合作用(如EDTA和檸檬酸)。在本實施例中可以看到，這類試劑如肝素、EDTA或檸檬酸對糖蛋白包被的固態(tài)載體吸附或附著免疫復合物的能力沒有影響，而且不論使用血液樣品還是使用由血液處理后得到的血漿樣品，過柱吸附結果都不受影響。進一步講，該柱在有抗凝血劑存在條件下對免疫復合物固著作用至少同沒有這種試劑存在時對血清樣品中免疫復合物的作用相當。本實施例所使用的抗凝血劑濃度比通常用于人類臨床治療所使用的濃度高。因為抗凝血劑的這種高濃度對免疫復合物的吸附作用無不良影響，所以可明顯看出用于治療的這種中等抗凝血劑的濃度同樣對復合物的免疫吸附作用無不良影響。
為達到本實施例的目的，將取自類風濕性關節(jié)炎患者的血液樣品分別盛在含有肝素、EDTA和檸檬酸鈉的試管中。將對照樣品盛在一支不含抗凝血劑的試管中，將對照樣品凝結后保留血清部分。按實施1所述方法，免疫復合物進行測定，但在為了檢測免疫復合物而進行的培育作用時(第二次的培育作用)，區(qū)別于實施例1中只加抗IgG特異性抗體，本實施例加入直接抗IgM及抗IgA的，辣根過氧化酶聯(lián)結的山羊抗血清。對多種抗體的使用(如特異性抗IgG，抗IgM和抗IgA抗體)可以進一步提高試驗的化學敏感度，以此來改進本吸附方法的一般適用性。
進行免疫復合物測定過程后，先將0.25毫升非稀釋樣品等分試樣加在按實施例3所述方法用BGG(牛丙種球蛋白)包被聚苯乙烯顆粒制備的柱上。該柱，同前一樣，在37℃下培養(yǎng)30分鐘。然后對起過作用的樣品進行洗提;并不相當于對樣品進行稀釋。另外用磷酸鹽緩沖液洗柱使最后稀釋度為1∶16，并且使結合松散的免疫復合物從柱上洗脫下來。稀釋的提取物就可直接進行免疫復合物測定而無需進行稀釋。此外還要配制血清的對照液，其中血清同不經(jīng)處理的聚苯乙烯顆粒進行接觸作用，按上述的方法對柱的提取液進行測定。
經(jīng)過該過程免疫復合物的清除百分比按下式計算清除率%＝ (OD(光密度，消光值)初始-OD過柱后)/(OD初始) ×100本過程的結果列于表7中并形象地用附圖7表示。
從表7和附圖7中可明顯地看出，抗凝血劑的存在對糖蛋白處理過的載體去除血液和血漿中免疫復合物的能力無不良影響。這正是所預料的，因為如實施例所表明的那樣，將免疫復合物固著在支持物上的糖蛋白-免疫復合物的相互作用無需鈣的參加。非包被的聚苯乙烯載體物質不能非常大量地吸附免疫復合物，這又同在實例1至3中所指出的原則相符。
正如本實施例所表明，糖蛋白膜結合上述適當?shù)妮d體物質將對清除血液和血漿中的免疫復合物起很大的作用，而且這種作用不受抗凝血劑存在與否的影響。本方法使得吸附血液中的免疫復合物成為可能，并為醫(yī)治各種與免疫復合物有關系的疾病和紊亂癥作出貢獻。另外本方法還有其它用途，這種柱可用來濃縮免疫復合物中稀有的某種抗體或抗原。對經(jīng)這類柱濃縮后的復合物提取液，用在實施例1和實施例5中所指出的方法對該復合物中的稀有抗原和抗體進行檢測就容易多了。
表7柱中載有 復合物清除率%血清 28%血清＊ 8%肝素處理過的血液 34%肝素處理過的血漿 31%檸檬酸鹽處理過的血液 40%檸檬酸鹽處理過的血漿 37%EDTA處理過的血液 48%
EDTA處理過的血漿 64%血清＊經(jīng)過無包被的聚苯乙烯柱。
附注使用糖蛋白包被的聚苯乙烯顆粒柱去清除血清、血漿和血液中的免疫復合物。
將血樣分別盛在含有不同抗凝血劑的真空試管中。管中各成分如下肝素，加血樣后濃度為28USP單位/毫升，檸檬酸鹽加血樣后濃度為3.5mg檸檬酸鈉/ml血樣，EDTA，加血后濃度為1.5mg EDTA/毫升血樣，制備好后，取每種血樣的等分試樣進行離心，取出血漿。表中所列即這些血漿樣品。血液表示離心作用前的含有抗血劑的樣品。血清則表示管中血液經(jīng)過凝結后但沒有分開可流動液體成分的血液樣品。
為了用柱吸附免疫復合物，分別在表中所列的8個柱上加入每種樣品的等分液0.25ml并將其置于37℃培育30分鐘。然后用3.75ml的磷酸鹽緩沖鹽液將血清成分洗脫，所得洗脫液進行免疫復合物測定。復合物清除百分率按前面正文提到的方法計算。
為了進行比較，將血清對照樣品也上糖蛋白包被的聚苯乙烯載體的柱。血清表示試管中血液樣品經(jīng)凝結后但沒有分開液體部分的血液樣品。這種血清對照中不含抗凝血劑。這種血清對照樣品的目的就是證明無論抗凝血劑的濃度是高還是低，所述抗凝血劑對糖蛋白包被底物的去除液體中免疫復合物的能力均無不良影響，且不論是用于分析還是從用于診治的血液或血漿中免疫吸附免疫復合物。
為了柱提取免疫復合物，將表中所列各樣品各取0.25毫升等分試樣加到8個柱中，并在37℃溫育30分鐘。用3.75毫升PBS將血清成分洗脫，并檢測洗脫液的免疫復合物，復合物去除百分率按正文所述計算。
在附圖7中，過柱樣品的種類名稱列在每一組條形圖下面。條形圖的高度代表每一個樣品的免疫復合物清除率(百分值)。
簡寫符號如下SER血清N/C過未包被聚苯乙烯柱的血清H/WB肝素處理的全血H/P肝素處理過的全血衍生出的血漿C/WB檸檬酸鹽處理的全血C/P檸檬酸鹽處理過的全血衍生出的血漿E/WBEDTA處理過的全血E/PEDTA處理過的全血衍生出的血漿實施例8糖基化多肽膜對多種大小和組分的免疫復合物分子具有吸附能力。為說明這種能力，選用取自系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者的血漿進行柱層析試驗。其中園柱內含有瓊脂糖A-15M(BioRad)，柱體積為1.6×35cm，這種柱層析法具有將大小形狀不同，分子量在40，000至15，000，000道爾頓(Dolton)范圍的蛋白質分離的能力。用磷酸鹽緩沖鹽水洗脫。用Isco紫外儀在280納米光波監(jiān)測蛋白質的含量。對由柱中流出的洗脫液按2.8ml進行等分，根據(jù)檢測的需要，選用過氧化酶標記的抗人IgG，IgM或IgA，按對含有它們的復合物所述的實施例來分析各等分的免疫復合物含量。從圖8中可明顯看出，正如免疫復合物檢測所揭示，免疫復合物結合的峰與其它蛋白的洗脫峰顯著不同(280納米時測到的消光值)。此外，這些含某種免疫球蛋白優(yōu)勢的復合物，在進行瓊脂糖校正實驗時顯現(xiàn)出特殊的性質(如圖9)。通過校正結果所示，系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者的免疫復合物分子量在200，000至超過5，000，000道爾頓范圍。在進行這類特殊的研究方面，可對本發(fā)明所述的測定方法作出最好的評價。在免疫復合物的檢測方面，象本發(fā)明這樣具有如此廣泛可應用性的測定方法是非常少有的。
附注圖8血清中人免疫復合物的瓊脂糖A15M凝膠過濾用瓊脂糖A15M柱(直徑1.6cm、長度35cm)，根據(jù)分子的大小，對免疫復合物進行分離。橫坐標和縱坐標分別表示分餾值和消光值。1個柱的體積近似等于25個分餾值。在分餾值為0時，將1.0毫升系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者的血清樣品加到柱上。用磷酸緩沖液(濃度＝0.01摩爾磷酸鉀緩沖液，其中含有0.15摩爾NaCl，pH值為7.4)對柱進行洗脫。
在圖8中，P表示用Isco柱檢測儀在280納米時測得的消光值。柱的空白體積值用標記有V0的箭頭表示。經(jīng)過免疫復合物測定法分別對IgG、IgM和IgA的特異性作用后得到的消光值分別用標記有G、M、A的線表示。IgM探針試劑對樣品中IgM組成的免疫復合物的作用具有高的敏感性所測到的消光值用曲線M表示。在本試驗條件下，抗IgG和抗IgA特異性抗體(對免疫合物)的敏感度幾乎相同。
附注圖9瓊脂糖A15M柱的校正圖9的附注中所述的柱層析法用免疫復合物中各種分子量范圍的蛋白質進行校正，以測其分子量，其中免疫復合物是經(jīng)過免疫復合物測定法檢驗的。使用五種不同的柱洗脫液，每一種分別含有純化的二磷酸果糖酶(分子量158，000)，IgG(分子量170，000)，過氧化氫酶(分子量232，000)、鐵蛋白(分子量440，000)和甲狀腺球蛋白(分子量670，000)。含有聚合蛋白(分子量大于20，000)和蘭色葡聚糖(分子量在1，000，000和50，000，000之間)第六種洗脫液確定V0(the void volume)值。通過核糖核酸酶(分子量13，000)的層析作用確定Vc(Colume Volume)值。縱坐標所示的洗脫常數(shù)(elution Kav)按如下公式算出Kva＝ ((Ve-Vo))/((Vc-Vo))圖9中橫坐標上所列的是分子量的對數(shù)值(log分子量)。外推形成的交叉得到的排除限度為10000000道爾頓，完全在制造者估計的15000000道爾頓范圍之內。如果想測定經(jīng)過這種層析介質的分餾液中蛋白質的分子量，可先經(jīng)過計算測得這種蛋白質的洗脫率Kav，然后參照圖9得到其分子量。
實施例9本實施例的目的是要進一步說明對如前所述的這種免疫復合物測定法的使用。盡管會有含抗原的復合物或小型抗原系列的物質產(chǎn)生，但醫(yī)生還是很難對許多處于早期的自身免疫紊亂癥患者作出診斷，其中包括對系統(tǒng)性紅斑狼瘡的診斷。如果可測定這些免疫復合物的抗原性成分，那這將極大地簡化對這些疾病的診斷和識別。
如果使用實施1中所述膜包被平板，將其與血清或血漿或血液進行接觸，則可使包括有抗原組分和裸露Fab結合位點的免疫吸附在膜上，并因此而使復合物聯(lián)到固態(tài)載體上。如果加入對抗原或某種自身免疫病為特有的抗原系為特異性的酶標記的抗體，或者加入可與免疫復合物中裸露的Fab部分相結合的并可見于復合物中的抗原酶標記物，則可以通過加入底物而產(chǎn)生的特征性顏色來展示有復合的疾病特異的抗原存在。另一方面，如果免疫復合物不含有對某種疾病為特異性和選擇性的這類抗原和Fab區(qū)，那么加入這些酶標記的抗體和抗原在經(jīng)過底物輔助作用后，不能形成顏色進行檢驗。這樣的話，免疫復合物中抗原特殊性實驗將促進對自身免疫病的診斷并對病情發(fā)展的監(jiān)測起到很好的輔助作用從而更好地予以治療。在治療方面具有熟練技能的人很快就會對本方法進行使用。
前述實施例是說明了糖蛋白膜將免疫復合物吸附到固體支撐物上的有效性和有用性。通過該實施例可以看出對于復合物中的抗體分子可以很容易地進行檢測，因而就沒有理由將該檢測方法限定在測定其中所含的同級或亞級抗體的范圍內。特異性檢驗手段的進一步使用，即通過將其用于對病理狀況進行檢測而獲得。下文即是對所用的檢驗方法的描述和說明。
免疫復合物中的抗原和抗體具有尚未被占據(jù)的可通過與標記的或結合的材料之間的特異作用而檢測的結合點。因此，按實施例1，3和4實施方法對免疫復合物進行吸附，并在加入某種酶聯(lián)抗原的條件下進行溫育，結果將產(chǎn)生結合抗原的附著。如果在復合物中有對這種抗原起作用的抗體的話，這一性質就會導致特異性抗原酶催化的反應發(fā)生。因此，如果免疫復合物中含有直接同抗原物質進行作用的抗體的話，則酶免疫測定法的反應為陽性，反之如果缺乏這些組分，酶免疫測定法的結果為陰性。本方法的另外一個應用、即可將其作為復合物的準確抗體組合物來進行對疾病的專一性調查。聯(lián)結作用不僅限于使用酶。還可用熒光化學制品如熒光素等一類熒光物質，如果免疫復合物中存在相應的抗體，那么免疫復合物上將能聯(lián)有熒光劑;同樣地，如果將抗原聯(lián)結上放射性核素，那么先已發(fā)生了吸附作用的含有相對應抗體存在的復合物也將帶有放射性。還有許多其它檢測方法，而且每種方法都產(chǎn)生陽性指示結果，假如復合物中的抗體成分按此所述的方法已固著了的話。
同樣，復合物中存在有適當?shù)目乖?，可按在此所述方法并利用?lián)結直接與該抗原作用的抗體檢測這類抗原物質。如果將酶聯(lián)抗體同按在此所述的方法制備的固定化的免疫復合物一道進行溫育，酶催反應的結果將顯示在復合物中存在有前面提到的抗原物質。聯(lián)結作用同樣不僅限于酶。加入熒光劑等類似的熒光化學制劑到抗體上，如果有所述抗原性物質存在，則抗體就會結合有熒光物質。同樣如果在免疫復合物中存在抗原物質，經(jīng)過放射核素聯(lián)結作用的相應抗體就會將其放射性帶給先已發(fā)生了吸附作用的復合物、使其也間接具有放射性。同所述抗體檢測方法一樣，也存在著許多其它檢測抗原的方法，并且，假設在按此所述方法附著的復合物中含有抗原性物質，則每種方法都將得到陽性指示。
在此所述技術即通過吸附作用和其它接觸機制的作用，這種由非特異性免疫活性氨基酸肽鏈包被的載體具有選擇性地直接地吸附免疫復合物的能力，因此這種膜可廣泛地使用在對各種體液中的循環(huán)性免疫復合物(circulating immuno complex)進行測定和清除方面。其中的肽鏈成分包括寡肽、變異寡肽、多肽、變異多肽、蛋白和變異蛋白等。另外，這類肽鏈分子的糖基化產(chǎn)物(糖肽和糖蛋白)將產(chǎn)生對測定和除去體液中免疫復合物非常有用的組合物。本專業(yè)領域的技術人員在對本技術全面了解和熟煉掌握以后，可以對其自如使用。在本方法處理固態(tài)載體的過程中，同時還對自身免疫疾病檢驗和治療提供了許多重要的有益的方法，提供了許多新的程序。這類程序包括(但不僅限于)對免疫復合物組成成分中抗體種類和亞種進行檢驗;確定免疫復合物中抗原的性質，和對出現(xiàn)在血清和其它體液及各種體內或體外來源的液體中的復合物進行去除。因此，在考慮對循環(huán)系統(tǒng)血清中存在的免疫復合物直接地進行檢測和消除方面，本技術具有廣泛的實用性和廣闊的可實用前景。
無需與特殊理論相結合，可以預期對所述寡肽、多肽和蛋白首次免疫種類的不同程度的糖基化，或用同功物的取代，將產(chǎn)生一類能直接與血清中免疫復合物相結合的物質，用于其檢測或去除。
可以預期即在本發(fā)明中所述的各種發(fā)明性的概念將得到各種實施方案，后附的權利要求
是要包括除先有技術以外的各種改型的實施方案。
附圖中所用字母縮寫的含意如下EDTA乙二胺四乙酸CIT檸檬酸鹽HEP肝素RA類風濕關節(jié)炎VASC脈管炎SER血清N/C過未包被的聚苯乙烯柱后的血清H/WB肝素處理過的全血H/P從肝素處理過的全血得到的血漿C/WB檸檬酸鹽處理過的全血C/P從檸檬酸鹽處理過的全血得到的血漿E/WBEDTA處理過的全血E/P從EDTA處理的全血得到的血漿
權利要求
1.一種進行確定體液樣品中免疫復合物的組分和(或)其濃度的免疫檢測方法，其特征在于，將被測樣品和免疫學非特異性的氨基酸肽鏈加到受體上，所述氨基酸肽鏈粘著到所述受體上而且具有將所述樣品中存在的免疫復合物附著到所述受體上的能力；讓所述氨基酸肽鏈將所述樣品中的免疫復合物附著到所述受體上；以產(chǎn)生所述樣品中存在的免疫復合物組分和(或)濃度的指示標記和抗體和抗原成分的指示標記的方式處理所述的附著免疫復合物。
2.根據(jù)權項1所述的方法，其特征在于，包括用含有免疫學非特異性的氨基酸肽鏈的溶液處理所述受體，使在所述受體上形成所述氨基酸肽鏈層，所述受體最好包括在其上能接納受試樣品的固相基質，然后使受試樣品放置到所述受體上。
3.根據(jù)權項1或2所述的方法，其特征在于，所述的免疫學非特異性氨基酸肽鏈選自以下分子寡肽，變異寡肽、多肽、變異多肽、蛋白和變異蛋白;優(yōu)先選用糖基化的多肽和蛋白，這些分子的進一步特征在于它們對免疫復合物的親和性。
4.根據(jù)權項3所述的方法，其特征在于所述的糖基化蛋白選自球蛋白的分餾段，優(yōu)先選用脊椎動物的球蛋白類，更優(yōu)先選用哺乳動物的，最優(yōu)先選用牛丙種球蛋白、馬丙種球蛋白、兔丙種球蛋白、狗丙種球蛋白、人丙種球蛋白、羊丙種球蛋白、鼠丙種球蛋白、豬丙種球蛋白、貓丙種球蛋白，或前述各種丙種球蛋白的Cohn分餾段;或糖基化肽選自化學合成的，或那些利用細胞雜交和重組技術而改變了遺傳結構的生物體和利用各種修飾和改變技術形成的變異細胞所產(chǎn)生的所需的糖基化蛋白。
5.根據(jù)權項4所述的方法，其特征在于所述的糖基化蛋白包括牛丙種球蛋白，優(yōu)先選用Cohn分餾所獲得的牛丙種球蛋白。
6.一種從體液中清除免疫復合物的方法，其特征在于以下步驟(1)在預先選擇的對固著作用有促進的條件下，將含有免疫學非特異性的氨基酸肽鏈分子的組合物固著在底物上，使其在底物表面形成一個膜;(2)在對體液中免疫復合物附著到所述膜上有促進的條件下，將所述的膜與含有免疫復合物的血清進行接觸反應;借此，血清中的免疫復合物就吸附在上述膜包被的底物上。
7.根據(jù)權項6所述的方法，其特征在于，所述含有免疫學非特異性氨基酸肽鏈的組合物含有氨基酸肽分子，肽分子選自寡肽，變異寡肽、多肽、變異多肽、蛋白、變異蛋白，優(yōu)先選用糖基化肽類和蛋白，這類分子的進一步特征在于它們對免疫復合物的親和性。
8.根據(jù)權項7所述的方法，其特征在于所述糖基化蛋白選自球蛋白的分餾段，優(yōu)先選用脊椎動物的，更優(yōu)先選用哺乳動物的分餾段，最優(yōu)先選用牛丙種球蛋白、馬丙種球蛋白、兔丙種球蛋白、狗丙種球蛋白、人丙種球蛋白、羊丙種球蛋白、鼠丙種球蛋白、豬丙種球蛋白、貓丙種球蛋白或含有任何前述丙種球蛋白的Cohn分餾段;或者其中所述的糖基化肽選自化學合成的，或經(jīng)過細胞雜交和重組技術而改變了遺傳結構的生物體或經(jīng)過其他修飾和改變技術而形成的變異細胞所產(chǎn)生的所需要的糖基化蛋白。
9.根據(jù)權項8所述的方法，其特征在于所述的糖基化蛋白包括牛丙種球蛋白，優(yōu)選Cohn分餾所獲得的牛丙種球蛋白。
10.一種從體液中清除免疫復合物的方法，其特征在于以下步驟(1)在預先選定的溫度和相對固著作用為足夠的時間條件下，經(jīng)過溫育，將含有免疫學非特異性氨基酸肽鏈分子的組合物固著在所述的底物上;(2)將固著有膜的該底物與含有免疫復合物和磷酸鹽緩沖鹽水的溶液進行接觸反應;(3)在預先選定的溫度和相對免疫復和物與膜充分結合為足夠的時間條件下經(jīng)過溫育，促使溶液中的免疫復合物結合在所述的膜上。
11.根據(jù)權項10所述的方法，其特征在于，所述的含有免疫學非特異性的組合物是呈堿性的;并含有氨基酸肽鏈分子，該分子選自由寡肽，變異寡肽、多肽、變異多肽、蛋白及變異蛋白組成的組中，優(yōu)先選用糖基化蛋白和糖基化肽類，這類分子的進一步特征在于它們對免疫復合物的親和性。
12.根據(jù)權項11所述的方法，其特征在于所述糖基化蛋白選自球蛋白的分餾段，優(yōu)先選用脊椎動物的分餾段，更優(yōu)先選用哺乳動物的分餾段，最優(yōu)先選用牛丙種球蛋白、馬丙種球蛋白、兔丙種球蛋白、狗丙種球蛋白、人丙種球蛋白、羊丙種球蛋白、鼠丙種球蛋白、豬丙種球蛋白、貓丙種球蛋白或含有如前所述的丙種球蛋白的Cohn分餾段;或其中所述的糖基化肽選自化學合成的，或由細胞雜交和重組技術而改變了遺傳結構的生物體或經(jīng)過其他修飾和改變技術形成的變異細胞所產(chǎn)生的所需的糖基化蛋白。
13.根據(jù)權項12所述的方法，其特征在于所述的糖基化蛋白包括牛丙種球蛋白，優(yōu)選經(jīng)Cohn分餾法得到的牛丙種球蛋白。
14.選擇性地從體液中去除免疫復合物的材料，其特征在于使載體媒介(P)適合于同含有免疫復合物的溶液進行接觸反應，膜介質(21)包括含有免疫學非特異性氨基酸肽鏈(含有附著在所述載體媒介上的化合物)的組合物，在與特定體液相接觸時粘著其中免疫復合物的能力，從而這種體液中的免疫復合物可被選擇性地附著在所述的載體媒介上。
15.根據(jù)權項14所述的材料，其特征在于，所述的含有免疫學非特異性氨基酸肽鏈組合物含有的氨基酸肽鏈選自以下分子寡肽，變異寡肽、多肽、變異多肽、蛋白、變異蛋白，優(yōu)先選用糖基化蛋白和糖基化肽類，這類分子的進一步特征在于它們對免疫復合物的親和性。
16.根據(jù)權項15所述的材料，其特征在于所述的糖基化蛋白選自球蛋白的分餾段，優(yōu)先選用脊椎動物的分餾段，更優(yōu)先選用哺乳動物的分餾段，最優(yōu)先選用牛丙種球蛋白、馬丙種球蛋白、兔丙種球蛋白、狗丙種球蛋白、人丙種球蛋白、羊丙種球蛋白、鼠丙種球蛋白、豬丙種球蛋白、貓丙種球蛋白或含有如前所述的球蛋白的Cohn分餾段;或者其中所述的糖基化肽選自化學合成的，或由細胞雜交和重組技術而改變了遺傳結構的生物體或經(jīng)過各種修飾和改變技術形成的變異細胞所產(chǎn)生的所需的糖基化蛋白。
17.根據(jù)權項16所述的材料，其特征在于所述的糖基化蛋白包括牛丙種球蛋白，優(yōu)選經(jīng)Cohn分餾法得到的牛丙種球蛋白。
18.一種生產(chǎn)能將免疫復合物直接地選擇性地吸附在如此制備的基底物上之材料的方法，其特征在于，提供一種具有可受性表面的基底物;用該基底物與一種組合物接觸反應，該組合物包括的成分選自下列分子寡肽，變異寡肽、多肽、變異多肽、蛋白、變異蛋白，這些分子能夠與基底物相結合形成膜，而且通過該膜能與其相接觸的組合物中免疫復合物粘著，其方式是能夠接下來確定所述免疫復合物的存在的方式。
19.根據(jù)權項18所述的方法，其特征在于用于進行這種接觸反應的組合物存在于堿性PH溶液中，在預先確定的溫度和相對于該組合物和基底物相結合為足夠的時間條件下，將該組合物與上述的基底物進行溫育。
20.根據(jù)權項18或19所述的方法，其特征在于所述的成分選自球蛋白的分餾段，優(yōu)先選用脊椎動物得到的，更優(yōu)先選用哺乳動物的，最優(yōu)先選用牛丙種球蛋白、馬丙種球蛋白、兔丙種球蛋白、狗丙種球蛋白、人丙種球蛋白、羊丙種球蛋白、鼠丙種球蛋白、豬丙種球蛋白、貓丙種球蛋白或含有前述丙種球蛋白的Cohn分餾段;或者其中所述的糖基化肽選自化學合成的，或由經(jīng)過細胞雜交和重組技術作用而改變了遺傳結構的個體或經(jīng)過其他修飾和改變技術而形成的變異細胞所產(chǎn)生的所需的糖基化蛋白。
21.根據(jù)權項20所述的方法，其特征在于，所述的糖基化蛋白包括牛丙種球蛋白，優(yōu)選經(jīng)Cohn分餾法所獲的牛丙種球蛋白。
專利摘要
將含有能固著循環(huán)免疫復合物的化合物的免疫學非特異性氨基酸肽鏈用來檢測或去除體液，如血清或血液中的免疫復合物。這種化合物包括寡肽、多肽、變異多肽、蛋白、變異蛋白，特別是糖基化的多肽和蛋白。
文檔編號G01N33/564GK86103610SQ86103610
公開日1987年1月21日 申請日期1986年5月30日
發(fā)明者邁克爾·D·羅普 申請人:白奧斯塔醫(yī)藥產(chǎn)品公司導出引文BiBTeX, EndNote, RefMan