專利名稱：免疫刺激組合物及刺激免疫反應的方法
參考相關申請本申請要求于2002年8月15日提交的美國臨時專利申請No.60/403,846的優(yōu)先權。
背景技術：
免疫反應調(diào)節(jié)劑(“IRM”)包括具有有效免疫調(diào)節(jié)活性，包括但不限于抗病毒和抗腫瘤活性的化合物。某些IRM調(diào)節(jié)細胞因子的生產(chǎn)和分泌。例如，有些IRM化合物誘導諸如I型干擾素，TNF-α，IL-1，IL-6，IL-8，IL-10，IL-12，MIP-1，和/或MCP-1的細胞因子的生產(chǎn)和分泌。作為另一例子，有些IRM化合物可抑制某些TH-2細胞因子，諸如IL-4和IL-5的生產(chǎn)和分泌。此外，有些IRM化合物據(jù)說抑制IL-1和TNF(美國專利No.6,518,265)。
有些IRM是有機小分子(例如，分子量小于約1000道爾頓，在某些情形下小于約500道爾頓，這與生物大蛋白，肽等相反)，諸如在下列美國專利中所公開的美國專利Nos.4,689,338；4,929,624；4,988,815；5,037,986；5,175,296；5,238,944；5,266,575；5,268,376；5,346,905；5,352,784；5,367,076；5,389,640；5,395,937；5,446,153；5,482,936；5,693,811；5,741,908；5,756,747；5,939,090；6,039,969；6,083,505；6,110,929；6,194,425；6,245,776；6,331,539；6,376,669；6,451,810；6,525,064；6,545,016；6,545,017；6,558,951；和6,573,273；歐洲專利0 394 026；美國專利公布No.2002/0055517；和國際專利公布Nos.WO 01/74343；WO 02/46188；WO 02/46189；WO 02/46190；WO 02/46191；WO 02/46192；WO 02/46193；WO 02/46749 WO02/102377；WO 03/020889；WO 03/043572和WO 03/045391。
小分子IRM的其他例子包括某些嘌呤衍生物(諸如公開在美國專利Nos.6,376,501和6,028,076中的那些衍生物)，某些咪唑并喹啉酰胺衍生物(諸如公開在美國專利No.6,069,149中的那些衍生物)，某些苯并咪唑衍生物(諸如描述在美國專利6,387,938中的那些衍生物)，以及某些4-氨基嘧啶與五元含氮雜環(huán)稠合的衍生物(諸如描述在美國專利Nos.6,376,501；6,028,076和6,329,381；和WO 02/08595中的腺嘌呤衍生物)。
其他IRM包括諸如寡核苷酸序列的生物大分子。有些IRM寡核苷酸序列含有胞嘧啶-鳥嘌呤二核苷酸(CpG)，并且描述在例如，美國專利Nos.6,194,388；6,207,646；6,239,116；6,339,068；和6,406,705中。有些含CpG的寡核苷酸可包括合成的免疫調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)基元，諸如在美國專利Nos.6,426,334和6,476,000中描述的那些基元。其他IRM核苷酸序列缺乏CpG，并且描述在例如國際專利公布No.WO 00/75304中。
某些IRM可用作Toll樣受體(TLR)激動劑。有些小分子IRM可通過TLRs 2，4，6，7和8中的一種或多種生效。CpG可通過TLR 9生效。
通過刺激免疫系統(tǒng)的有些方面，而抑制其他方面(參見，例如，美國專利Nos.6,039,969和6,200,592)，IRM可用于治療許多疾病。例如，小分子IRM咪喹莫特(imiquimod)用于治療由人乳頭瘤病毒導致的外生殖器和肛疣[參見，例如，Tomai等，Antiviral Research 28(3)253-64(1995)]。其他可利用IRM治療的疾病的例子包括但不限于，基底細胞癌(basal cell carcinoma)，濕疹，自發(fā)性血小板增生癥，乙型肝炎，多發(fā)性硬化癥，腫瘤病，牛皮癬，類風濕性關節(jié)炎，I型單純皰疹，以及II型單純皰疹。
IRM化合物也可通過調(diào)節(jié)B細胞的抗體生產(chǎn)而調(diào)節(jié)體液免疫。
此外，多種IRM已顯示可用作疫苗佐劑(參見，例如，美國專利Nos.6,083,505和6,406,705)。
發(fā)明概述IRM，尤其是小分子IRM和TLR 2，4，6，7和8的激動劑現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)，當其與抗原通過化學或物理配對形成免疫刺激組合物時，在刺激免疫反應方面是令人驚奇的有效。一具體組合物的免疫刺激作用大于該組合物中同樣的抗原和同樣或可比的IRM以未配對形式施用的免疫調(diào)節(jié)作用。
本發(fā)明提供免疫刺激組合物，包括與抗原部分配對的免疫反應調(diào)節(jié)劑(IRM)部分。在有些實施方案中，IRM部分可以是或衍生自Toll樣受體2，Toll樣受體4，Toll樣受體6，Toll樣受體7或Toll樣受體8的激動劑。在其他實施方案中，IRM部分可包括或衍生自咪唑并喹啉胺；四氫咪唑并喹啉胺；咪唑并吡啶胺；芳基醚取代的咪唑并吡啶胺；1，2-橋連的咪唑并喹啉胺；6，7-稠合的環(huán)烷基咪唑并吡啶胺；咪唑并二氮雜萘胺；四氫咪唑并二氮雜萘胺；唑并喹啉胺；噻唑并喹啉胺；唑并吡啶胺；噻唑并吡啶胺；唑并二氮雜萘胺；或噻唑并二氮雜萘胺。在其他實施方案中，IRM部分可包括或衍生自分子量小于約1000道爾頓的有機部分。抗原部分可包括氨基酸序列，核苷酸序列，脂多糖，朊病毒，細菌，病毒或真菌。
在另一方面，本發(fā)明提供刺激患者T細胞的方法。所述方法包括提供含有與抗原部分配對的免疫反應調(diào)節(jié)劑的免疫刺激組合物；讓免疫刺激組合物結(jié)合至抗原呈遞細胞，由此活化抗原呈遞細胞；以及使活化的抗原呈遞細胞刺激患者的T細胞?；颊叩腡細胞可以在體內(nèi)或體外進行刺激。
在另一方面，本發(fā)明提供刺激抗體生產(chǎn)的細胞的方法。所述方法包括提供含有與抗原部分配對的免疫反應調(diào)節(jié)劑部分的免疫調(diào)節(jié)組合物；以及使免疫調(diào)節(jié)組合物結(jié)合至抗體生產(chǎn)的細胞?？贵w生產(chǎn)的細胞可在體內(nèi)或體外進行刺激。
本發(fā)明的其他多種特征和優(yōu)勢參照下列詳述，實施例，權利要求書和附圖應容易變成一目了然。在說明書的若干地方，通過實施例目錄而提供指南。在每種情況下，引用目錄僅用作代表性基團，不應解釋成排他性。
附圖簡述

圖1示出了如實施例4所述的由免疫有卵清蛋白的小鼠生成的卵清蛋白特異性活化的CD8+T細胞的百分比。
圖2示出了如實施例4所述的皮下免疫有IRM-卵清蛋白共軛物的小鼠生成的卵清蛋白-特異性活化的CD8+T細胞的百分比。
圖3示出了如實施例4所述的腹膜內(nèi)免疫有IRM-卵清蛋白共軛物的小鼠生成的卵清蛋白-特異性活化的CD8+T細胞的百分比。
圖4示出了如實施例5所述的由免疫有卵清蛋白的小鼠誘導產(chǎn)生的干擾素-γ。
圖5示出了如實施例5所述的由皮下免疫有IRM-卵清蛋白共軛物的小鼠誘導產(chǎn)生的干擾素-γ。
圖6示出了如實施例5所述的由腹膜內(nèi)免疫有IRM-卵清蛋白共軛物的小鼠誘導產(chǎn)生的干擾素-γ。
圖7示出了如實施例6所述的在用IRM-卵清蛋白共軛物提供次級免疫后，抗原-特異性免疫反應的增加。
圖8示出了如實施例7所述的在用腫瘤-特異性IRM-抗原共軛物免疫后，腫瘤大小減少。
圖9示出了如實施例8所述的在用IRM-腫瘤抗原共軛物免疫后，活化的腫瘤抗原-特異性CD8+T細胞在脾臟中的擴大。
圖10示出了如實施例8所述的在用IRM-腫瘤抗原共軛物免疫后，活化的腫瘤抗原-特異性CD8+T細胞在腫瘤中的擴大。
圖11示出了如實施例9所述的在用卵清蛋白免疫后，正在呈遞Kb/SIINFEKL的抗原呈遞細胞的百分比。
圖12示出了如實施例9所述的在用卵清蛋白加上非共軛的IRM免疫后，正在呈遞Kb/SIINFEKL的抗原呈遞細胞的百分比。
圖13示出了如實施例9所述的在用IRM-卵清蛋白共軛物免疫后，正在呈遞Kb/SIINFEKL的抗原呈遞細胞的百分比。
圖14示出了如實施例10所述的在用卵清蛋白-表達的腫瘤細胞攻擊后，免疫有卵清蛋白或IRM-卵清蛋白共軛物的小鼠的生存率。
圖15示出了如實施例11所述的在用卵清蛋白免疫后，抗原-特異性CD8+T細胞的擴大。
圖16示出了如實施例11所述的在用IRM和卵清蛋白的膠狀懸浮液免疫后，抗原-特異性CD8+T細胞在一個個體中的擴大。
圖17示出了如實施例11所述的在用IRM和卵清蛋白的膠狀懸浮液免疫后，抗原-特異性CD8+T細胞在第二個體中的擴大。
圖18示出了抗原-特異性CD8+T細胞的擴大，作為利用兩個不同IRM以IRM-抗原共軛物免疫的結(jié)果。
圖19示出了免疫有多種免疫刺激組合物的小鼠在單獨用卵清蛋白免疫后的CD8+T細胞的倍增。
本發(fā)明例證性實施方案的詳述本發(fā)明提供免疫刺激組合物(ISC)，制備免疫刺激組合物的方法，利用免疫刺激組合物誘發(fā)免疫反應的方法，以及通過將IRM與另一免疫刺激組分(例如，抗原)配對而增強IRM的免疫刺激活性的方法。ISC可設計成引發(fā)細胞介導的免疫反應，體液免疫反應，或兩者皆有。
如上所述，許多IRM可用作疫苗佐劑，以增加針對同樣存在于疫苗中的一種或多種抗原而生成的免疫反應。令人驚奇的是，本發(fā)明的某些ISC比含有同樣或可比的IRM和同樣的抗原，但以未配對形式存在的疫苗可提供甚至更大的免疫反應。在一種情形下，ISC提供的免疫反應比由包括同樣抗原和可比IRM的疫苗所生成的免疫反應高大約5倍。
如本發(fā)明所用的術語“配對”及其變體是指以某個化學或物理方式相連的組分，以致組分彼此之間不是自由分開的。例如，兩個組分可以相互共價結(jié)合，以致這兩個組分不能單個分離。配對也可通過例如非共價親和結(jié)合，離子結(jié)合，親水或疏水親和，物理捕獲等而實現(xiàn)。配對特異性區(qū)分于常規(guī)疫苗中抗原和佐劑的簡單混合物。在簡單混合物中，組分可自由地分散在免疫接種的環(huán)境內(nèi)。如本發(fā)明所用，“配對”及其變體的理解是，配對的組分免疫后維持化學或物理連接。
免疫反應調(diào)節(jié)劑部分可以是或衍生自任何合適的IRM。合適的IRM包括有機小分子，即分子量小于約1000道爾頓的分子，盡管在有些實施方案中，IRM的分子量小于約700道爾頓，而在有些情形下，IRM的分子量為約500道爾頓到約700道爾頓。合適的IRM還包括TLR2，4，6，7，8和9中的一種或多種的激動劑。在有些實施方案中，合適的IRM包括但不限于上述的小分子IRM化合物及其衍生物。合適的小分子IRM具有與五元含氮雜環(huán)稠合的2-氨基吡啶，包括但不限于咪唑并喹啉胺，包括但不限于酰胺取代的咪唑并喹啉胺，磺胺取代的咪唑并喹啉胺，尿素取代的咪唑并喹啉胺，芳基醚取代的咪唑并喹啉胺，雜環(huán)醚取代的咪唑并喹啉胺，氨基醚取代的咪唑并喹啉胺，亞磺酰氨基醚取代的咪唑并喹啉胺，尿素取代的咪唑并喹啉醚，以及硫醚取代的咪唑并喹啉胺；四氫咪唑并喹啉胺，包括但不限于酰胺取代的四氫咪唑并喹啉胺，磺胺取代的四氫咪唑并喹啉胺，尿素取代的四氫咪唑并喹啉胺，芳基醚取代的四氫咪唑并喹啉胺，雜環(huán)醚取代的四氫咪唑并喹啉胺，氨基醚取代的四氫咪唑并喹啉胺，亞磺酰氨基醚取代的四氫咪唑并喹啉胺，尿素取代的四氫咪唑并喹啉醚，以及硫醚取代的四氫咪唑并喹啉胺；咪唑并吡啶胺，包括但不限于酰胺取代的咪唑并吡啶胺，亞磺酰氨基取代的咪唑并吡啶胺，尿素取代的咪唑并吡啶胺；芳基醚取代的咪唑并吡啶胺，雜環(huán)醚取代的咪唑并吡啶胺，氨基醚取代的咪唑并吡啶胺，亞磺酰氨基取代的咪唑并吡啶胺，尿素取代的咪唑并吡啶醚，以及硫醚取代的咪唑并吡啶胺；1，2-橋連的咪唑并喹啉胺；6，7-稠合的環(huán)烷基咪唑并吡啶胺；咪唑并二氮雜萘胺；四氫咪唑并二氮雜萘胺；唑并喹啉胺；噻唑并喹啉胺；唑并吡啶胺；噻唑并吡啶胺；唑并二氮雜萘胺；以及噻唑并二氮雜萘胺。
其他合適的小分子IRM包括某些嘌呤衍生物，某些咪唑并喹啉酰胺衍生物，某些苯并咪唑衍生物，以及上述4-氨基嘧啶與五元含氮雜環(huán)稠合的某些衍生物(如腺嘌呤衍生物)。
其他合適的IRM包括CpG和其他缺乏上述CpG的IRM核苷酸序列。
抗原部分可包括提升細胞介導的免疫反應，體液免疫反應或兩者的任何材料。合適的抗原材料包括但不限于肽；多肽；脂質(zhì)；糖脂；多糖；碳水化合物；多核苷酸；朊病毒s；活的或滅活的細菌，病毒或真菌；以及細菌，病毒，真菌，原生動物，腫瘤衍生或生物體衍生的免疫原，毒素或類毒素。
本發(fā)明的免疫刺激組合物可用于治療的疾病包括但不限于(a)病毒性疾病，諸如生殖器疣，流行性疣，腳底疣，乙肝，丙肝，I型和II型單純皰疹病毒，傳染性軟疣(molluscum contagiosum)，天花，HIV，CMV，VZV，鼻病毒，腺病毒，冠狀病毒，流感，副流感；(b)細菌性疾病，諸如肺結(jié)核，鳥分支桿菌(mycobacteriumavium)，麻風?。?c)其他傳染性疾病，諸如真菌疾病，衣原體，假絲酵母，曲霉菌，隱球菌性腦膜炎(cryptococcal meningitis)，卡氏肺囊蟲(pneumocystis carnii)，隱孢子蟲病(cryptosporidiosis)，組織胞漿菌病(histoplasmosis)，弓形蟲病(toxoplasmosis)，錐體蟲感染，利什曼?。?d)瘤性疾病，諸如上皮內(nèi)瘤形成，宮頸發(fā)育不良，光化性角化癥(actinic keratosis)，基底細胞癌(basal cell carcinoma)，鱗狀細胞癌，發(fā)狀細胞白血病(hairy cell leukemia)，Karposi氏肉瘤，黑素瘤，腎細胞癌，骨髓性白血病(myelogeous leukemia)，多發(fā)性骨髓瘤(multiplemyeloma)，非Hodgkin氏淋巴瘤，皮膚T-細胞淋巴瘤，以及其他癌癥；(e)TH-2介導的遺傳性過敏癥和自身免疫疾病，諸如，遺傳性過敏皮炎或濕疹，嗜曙紅細胞增多，哮喘，過敏，過敏性鼻炎，全身性紅斑狼瘡，自發(fā)性血小板增生癥，多發(fā)性硬化癥，Ommen氏綜合癥，盤狀狼瘡，斑禿(alopecia areata)，抑制瘢痕瘤形成和其他類型的疤痕，以及增加傷口愈合，包括慢性傷口；以及(f)作為疫苗佐劑，與任何提升下列體液和/或細胞介導的免疫反應的材料結(jié)合使用，諸如活病毒和細菌性免疫原，和滅活病毒，腫瘤衍生的，原生動物，生物體衍生的，真菌和細菌性免疫原，類毒素，毒素，多糖，蛋白，糖蛋白，肽，細胞疫苗，DNA疫苗，重組蛋白，糖蛋白，和肽等與下列病毒組合使用，例如BCG，霍亂，瘟疫，傷寒，甲肝，乙肝和丙肝，流感A和B，副流感，小兒麻痹，狂犬病，麻疹，腮腺炎，風疹，黃熱病，破傷風，白喉，B型流感嗜酸桿菌感染，肺結(jié)核，腦膜炎球菌疫苗和肺炎球菌疫苗，腺病毒，HIV，水痘，細胞巨化病毒，登革熱，貓科白血病，禽流感，HSV-1和HSV-2，豬霍亂，日本腦炎，呼吸道合胞病毒，輪狀病毒，乳頭瘤病毒，和黃熱病。
本發(fā)明的免疫刺激組合物包括有效量的生物活性的免疫反應調(diào)節(jié)劑部分和抗原部分。有效量的生物活性的免疫反應部分(“IRM活性”)包括一種或多種下列活性增加T細胞產(chǎn)生細胞因子，活化特異于抗原的T細胞，以及活化樹突細胞。有效量的生物活性的抗原部分(“抗原活性”)包括一種或多種下列活性B細胞生成特異于抗原的抗體以及生成呈遞抗原的抗原呈遞細胞。本發(fā)明的免疫刺激組合物可與藥用載體，一種或多種賦形劑，或前述化合物相組合從而形成藥物組合物。
盡管活性化合物用于本發(fā)明藥物組合物中的實際量會隨本領域?qū)I(yè)人員公知的因素而發(fā)生變化，這些因素諸如免疫刺激組合物的物理和化學性質(zhì)，載體的性質(zhì)，個體免疫系統(tǒng)的性質(zhì)(例如，抑制，受損，刺激)，以及想要的服藥方案，可以預期本發(fā)明的藥物組合物會含有足夠的免疫反應調(diào)節(jié)劑部分以給個體提供劑量為約100ng/kg-約50mg/kg，優(yōu)選約10μg/kg-約5mg/kg的IRM。
可采用多種不同的劑型，諸如片劑，錠劑，膠囊，腸胃外制劑，糖漿，乳劑，藥膏，氣溶膠，經(jīng)皮貼片，經(jīng)粘膜貼片等。
本發(fā)明的藥物組合物在治療方案中可以單一治療劑施用，或藥物組合物可與另一藥物組合物或與其他活性劑，包括其他的免疫反應調(diào)節(jié)劑，抗病毒素，抗生素，抗體，蛋白，肽，寡核苷酸等組合施用。
在有些實施方案中，免疫刺激免疫反應調(diào)節(jié)劑部分可共價結(jié)合至抗原部分而形成免疫刺激共軛物。如本發(fā)明所用，“共價結(jié)合”是指專門通過共價鍵直接或間接偶聯(lián)兩個組分。直接共價偶聯(lián)可包括免疫反應調(diào)節(jié)劑部分的原子和抗原部分的原子之間的直接共價結(jié)合。此外，共價偶聯(lián)的發(fā)生可通過共價連接至IRM部分，抗原部分或兩者的連接基團進行，這促進了IRM部分和抗原部分的共價偶聯(lián)。非直接共價偶聯(lián)可包括第三組分，諸如，免疫反應調(diào)節(jié)劑部分和抗原部分被分開與之共價連接的固相支持物。同樣，“共價偶聯(lián)”與“共價連接”交互使用。
免疫刺激共軛物可包括免疫反應調(diào)節(jié)劑部分作為IRM部分和含抗原的部分作為抗原部分。當合成免疫刺激共軛物時，免疫反應調(diào)節(jié)劑部分，連接基團，以及含抗原部分可分別加以選擇，從而所得的免疫刺激共軛物具有有效量的IRM活性和有效量的抗原活性。
連接基團可以是任何合適的有機連接基團，只要其能使含抗原部分與免疫反應調(diào)節(jié)劑部分共價偶聯(lián)，同時保留有效量的IRM活性和抗原活性。在有些實施方案中，連接基團的選擇要考慮到在免疫反應調(diào)節(jié)劑部分的活性核心與含抗原部分之間有足夠的空間，使得含抗原部分不會干擾活性核心和T細胞之間的生物有效相互作用，從而導致IRM活性，諸如細胞因子產(chǎn)生。
連接基團包括能夠與抗原反應形成共價鍵的反應基。合適的反應基包括在下列文獻中所述的那些基團Hermanson，G.(1996)，Bioconjugate Techniques，Academic Press，第2章，“反應性官能團的化學(The Chemistry of Reactive Functional Groups)”，137-166。例如，連接基可以與伯胺(例如，N-羥基琥珀酰亞胺基酯(N-hydroxysuccinimidylester)或N-羥基硫代琥珀酰亞胺基酯(N-hydroxysulfosuccinimidyl ester))反應；其可與巰基(例如，馬來酰亞胺或碘代乙酰基)反應，或者其可以是光反應基(例如，苯基疊氮化物，包括4-疊氮基苯基，2-羥基-4-疊氮基苯基，2-硝基-4-疊氮基苯基，以及2-硝基-3-疊氮基苯基)。
易與連接基團接近進行共價偶聯(lián)的化學反應基包括可直接用于共價偶聯(lián)至連接基團的基團，或者被改性后可用于共價偶聯(lián)至連接基團的基團。例如，合適的化學反應基包括但不限于伯胺和巰基。由于某些含抗原部分，例如蛋白和其他肽，可包括多個化學反應基，因此本發(fā)明的某些ISC可包括多個與特定的含抗原部分共軛的IRM部分。
制備免疫刺激共軛物的方法本發(fā)明的免疫刺激共軛物的通用制備方法如下將免疫反應調(diào)節(jié)劑與交聯(lián)劑反應，然后使所得中間體與抗原反應。許多適于制備生物共軛物的交聯(lián)劑是公知的，并且許多可商購。參見例如，Hermanson，G.(1996)Bioconjugate Techniques，Academic Press。
本發(fā)明的免疫刺激共軛物也可例如，根據(jù)反應路線I中所示的方法進行制備，在反應路線I中，含抗原部分通過R1連接至IRM部分。在反應路線I的步驟(1)中，式III化合物與式IV雜雙官能交聯(lián)劑反應生成式II化合物。RA和RB分別含有被選擇與其他官能團反應的官能團。例如，如果RA含有伯胺，則可選擇雜雙官能交聯(lián)劑，其中RB含有胺反應性官能團，諸如，N-羥基硫代琥珀酰亞胺基酯?？蛇x擇RA和RB，它們反應后可在共軛物中提供所需的連接基團。
制備其中RA含有官能團的式III化合物的方法是公知的。參見，例如，U.S.專利Nos.4,689,338；4,929,624；U.S.專利No.5,268,376；5,389,640；5,352,784；5,494,916；4,988,815；5,367,076；5,175,296；5,395,937；5,741,908；5,693,811；6,069,149；6,194,425；和U.S.專利6,331,539以及國際公布WO 00/76505；WO 00/76518；WO 02/46188，WO 02/46189；WO 02/46190；WO 02/46191；WO 02/46192；WO02/46193；和WO 02/46194。
許多雜雙官能交聯(lián)劑是公知的，并且許多是可商購的。參見例如，Hermanson，G.(1996)，Bioconjugate Techniques，Academic Press，第5章，“雜雙官能交聯(lián)劑(Heterobifunctional Cross-Linkers)”，229-285。反應的實施通常是將式III化合物的合適溶劑，諸如N，N-二甲基甲酰胺的溶液與式IV雜雙官能交聯(lián)劑的合適溶劑，諸如N，N-二甲基甲酰胺的溶液混合。反應可在室溫下進行。接著采用常規(guī)技術可對式II產(chǎn)物加以分離。
在反應路線I的步驟(2)中，將含有反應基ZA的式II化合物與抗原發(fā)應，以提供式I的免疫刺激共軛物。反應的實施一般是將式II化合物的合適溶劑，諸如二甲基亞砜的溶液與抗原的合適緩沖液，諸如PBS的溶液混合。反應可在室溫或低溫(約4℃)下進行。如果ZA是光反應基，諸如苯基疊氮化物，則反應混合物將暴露于長波UV光足夠長的時間以實現(xiàn)交聯(lián)(例如，10-20分鐘)。每個抗原部分的免疫反應調(diào)節(jié)劑部分的平均數(shù)可通過調(diào)節(jié)反應中所用的式II化合物的量來進行控制。采用常規(guī)技術，式I免疫反應共軛物可加以分離和純化。
反應路線I 此外，無需利用雜雙官能交聯(lián)劑，可合成式II化合物。只要式II化合物含有反應基ZA，利用上述步驟(2)中的方法，其就可與抗原反應從而提供免疫刺激共軛物。
如本發(fā)明所用的術語“烷基”，“烯基”和前綴“烷(烯)”包括直鏈，支鏈和環(huán)基，即環(huán)烷基和環(huán)烯基。除非另有說明，這些基團含有1-20個碳原子，而烯基含有2-20個碳原子。優(yōu)選的基團總共多達10個碳原子。環(huán)基可以是單環(huán)或多環(huán)，以及優(yōu)選的是具有3-10個環(huán)碳原子。示例性環(huán)基團包括環(huán)丙基，環(huán)戊基，環(huán)己基，環(huán)丙基甲基，以及金剛基(adamantyl)。
術語“鹵代烷基”包括被一種或多種鹵原子取代的基團，包括全氟化基團。這還適合于包括前綴“鹵代”的基團。合適的鹵代烷基的例子是氯代甲基，三氟代甲基等。
如本發(fā)明所用的術語“芳基”包括碳環(huán)形芳香環(huán)或環(huán)系統(tǒng)。芳基的例子包括苯基，萘基，聯(lián)苯基，芴基和茚基。術語“雜芳基”包括含有至少一個環(huán)雜原子(例如，O，S，N)的芳香環(huán)或環(huán)系統(tǒng)。合適的雜芳基包括呋喃基，噻吩基，吡啶基，喹啉基，異喹啉基，吲哚基，異吲哚基，三唑基，吡咯基，四唑基，咪唑基，吡唑基，唑基，噻唑基，苯并呋喃基，苯并苯硫基，咔唑基，苯并唑基，嘧啶基，苯并咪唑基，喹喔啉基，苯并噻唑基，二氮雜萘基，異唑基，異噻唑基，嘌呤基，喹唑啉基等。
“雜環(huán)基”包括含有至少一個雜原子(例如，O，S，N)的非芳香環(huán)或環(huán)系統(tǒng)，并且包括上述雜芳基的全部飽和和部分不飽和的衍生物。示例性雜環(huán)基包括吡咯烷基，四氫呋喃基，嗎啉基，嗎啉硫基，哌啶基，哌嗪基，噻唑烷基，異噻唑烷基，以及咪唑烷基。
芳基，雜芳基和雜環(huán)基可被一種或多種取代基取代或未取代，所述取代基獨立地選自烷基，烷氧基，亞甲基二氧基，亞乙基二氧基，硫烷基，鹵代烷基，鹵代烷氧基，鹵代硫烷基，鹵素，硝基，羥基，巰基，氰基，羧基，甲?；蓟?，芳基氧基，硫芳基，芳基烷氧基，芳基硫烷基，雜芳基，雜芳氧基，雜硫芳基，雜芳基烷氧基，雜芳基硫烷基，氨基，烷基氨基，二烷基氨基，雜環(huán)基，雜環(huán)烷基，烷基羰基，烯基羰基，烷氧基羰基，鹵代烷基羰基，鹵代烷氧基羰基，硫烷基羰基，芳基羰基，雜芳基羰基，芳基氧基羰基，雜芳基氧基羰基，硫芳基羰基，雜硫芳基羰基，烷酰氧基，硫烷?；?，烷?；被?，芳基羰基氧基，芳基硫羰基，烷基氨基磺?；?，烷基磺?；蓟酋；?，雜芳基磺?；?，芳基二嗪基，烷基磺?；被?，芳基磺酰基氨基，芳基烷基磺?；被?，烷基羰基氨基，烯基羰基氨基，芳基羰基氨基，芳基烷基羰基氨基，雜芳基羰基氨基，雜芳基烷基羰基氨基，烷基磺?；被?，烯基磺?；被?，芳基磺?；被?，芳基烷基磺?；被?，雜芳基磺酰基氨基，雜芳基烷基磺?；被?，烷基氨基羰基氨基，烯基氨基羰基氨基，芳基氨基羰基氨基，芳基烷基氨基羰基氨基，雜芳基氨基羰基氨基，雜芳基烷基氨基羰基氨基，以及在雜環(huán)基的情形下，為氧代。如果其他基團被描述為“取代的”或“任選取代的”，則這些基團也可以被一種或多種上文列舉的取代基取代。
某些取代基一般是優(yōu)選的。例如，優(yōu)選的R2基團包括氫，1-4個碳原子的烷基(即，甲基，乙基，丙基，異丙基，正丁基，仲丁基，異丁基，叔丁基以及環(huán)丙基甲基)，以及烷氧基烷基(例如，甲氧基乙基和乙氧基甲基)。優(yōu)選地，R3和R4獨立的是氫或甲基，或者R3和R4合起來形成苯環(huán)，吡啶環(huán)，6-元飽和環(huán)或含有氮原子的6-元飽和環(huán)。如果需要，一種或多種這樣優(yōu)選的取代基可以任何組合方式存在于本發(fā)明的化合物中。
在有些實施方案中，免疫刺激共軛物可包括固相支持物結(jié)構(gòu)，抗原部分和IRM部分皆可與之連接。在有些實施方案中，利用諸如上述的連接基團，IRM部分，抗原部分或兩者可共價連接至固相支持物上。固相支持物可包括例如，瓊脂糖珠，金顆粒等。然后，固相支持物可用于將連接的IRM部分和抗原部分共遞送到合適的靶細胞群。用于連接生物分子至固相支持物的方法是本領域公知的，而將生物分子固定在固相支持物上的方案也是眾所周知的，并且合適的試劑可從商業(yè)來源獲得。
本發(fā)明的免疫刺激組合物除了共價偶聯(lián)外，還可含有IRM部分和抗原部分之間的化學連接。例如，ISC可包括抗原部分和IRM部分之間的親和相互作用。親和素-生物素親和性代表了非共價相互作用的一個例子，該作用可用于使抗原部分與IRM部分配對。經(jīng)眾多存在于例如，蛋白抗原的氨基酸上的官能團之一(例如，伯胺或巰基)，生物素分子可化學連接到抗原。利用相似化學途徑，IRM部分可共軛至親和素分子上。然后，IRM部分與抗原部分由于親和素-生物素相互作用而配對。用于使蛋白生物素?；褪够瘜W基團連接到親和素上的方法是本領域技術人員眾所周知的。替代的可用于制備ISC的親和相互作用包括例如，抗原/抗體相互作用，糖蛋白/凝集素相互作用。
免疫刺激組合物也可通過IRM部分與抗原部分之間的離子相互作用形成。例如，IRM部分，抗原部分或兩者可被改性以含有相反的帶電組分。相反帶電的IRM部分和抗原部分可溫育在一起使得兩個部分之間發(fā)生離子相互作用。接著，所得ISC可施用給個體或細胞群，從而將IRM和抗原共遞送到靶細胞上。
如同在共價連接的ISC中的情形一樣，其中IRM部分和抗原部分被非共價配對的ISC可包括固相支持物。
利用免疫刺激共軛物引發(fā)免疫反應的方法本發(fā)明的免疫刺激組合物可用于在體外或體內(nèi)引發(fā)免疫系統(tǒng)細胞的免疫反應。因此，本發(fā)明的ISC作為疫苗的組分或作為T細胞或B細胞的體外細胞培養(yǎng)物中所用的免疫刺激因子可能是有用的。實際上，當IRM作為本發(fā)明ISC的部分遞送與作為未配對疫苗佐劑遞送相比時，其是更有效的免疫刺激因子。當用于體外引發(fā)免疫反應時，體外活化的免疫細胞可重新導入患者中。此外，由活化的免疫細胞分泌的因子，例如，抗體，細胞因子等，可加以采集用于研究，診斷和/或治療應用。
除非另有說明，宿主可以被皮下或腹膜內(nèi)免疫。在經(jīng)過足夠的時間讓宿主對ISC生成免疫反應后，采集合乎免疫部位的免疫細胞。例如，可從已被皮下免疫的宿主中采集淋巴結(jié)。從腹膜免疫的宿主采集脾細胞。對于一些宿主而言，細胞采集包括處死宿主。在其他情形下，細胞采集包括對適當組織進行活檢或手術分離。
在一個實施方案中，ISC可用于誘導抗原特異的T細胞的增殖。宿主(例如，小鼠)可用包括特定抗原的ISC免疫。在宿主中有足夠的溫育之后，響應于免疫，某些T細胞(例如，CD8+T細胞)將變成成熟的抗原特異性T細胞。與僅用抗原免疫的宿主相比，用ISC免疫的宿主有更高百分比的T細胞是抗原特異的(圖1-3)。通過使IRM部分和抗原部分共價偶聯(lián)(圖1-3)，或通過非共價配對，諸如膠狀懸浮液(圖15-17)，ISC可被配對。
如果抗原是蛋白(例如，卵清蛋白)，則ISC無需包括整個蛋白。例如，蛋白的免疫顯性(immunodominant)肽就是誘導特異于全蛋白抗原的T細胞發(fā)育所需的一切。此外，加強免疫，例如初次免疫后15天，可增大誘導抗原特異T細胞(圖7)。
以ISC免疫宿主可用于在CD8+胞毒T淋巴細胞(CTL)中引發(fā)抗原特異反應。這種反應可針對許多狀況，包括但不限于，腫瘤和病毒感染的細胞群。ISC也可預防性施用，以提供帶有針對未來腫瘤或病毒感染的保護性CTL免疫的宿主。
在另一實施方案中，ISC可用于誘導抗原特異T細胞體外產(chǎn)生細胞因子。免疫宿主的合適組織可加以采集，并與抗原體外培養(yǎng)，由此誘導產(chǎn)生一種或多種細胞因子(例如，IFN-γ，參見圖4-6)。再者，在抗原為蛋白的情形下，抗原蛋白的免疫顯性肽就是誘導細胞培養(yǎng)物中的抗原特異T細胞生產(chǎn)和分泌細胞因子所需的一切。
在另一實施方案中，ISC可用于抑制體內(nèi)腫瘤生長。有腫瘤細胞表達特定抗原的宿主可用含有抗原的ISC免疫。在有些實施方案中，初次免疫可用二次免疫加強。從免疫有含有抗原的ISC宿主中采集的腫瘤一般小于從僅免疫有抗原的宿主中采集的腫瘤(圖8)。此外，腫瘤分析表明，從免疫有ISC的宿主中采集的腫瘤比從僅免疫有抗原的宿主中采集的腫瘤含有更高百分比的抗原特異T細胞(圖10)。
在另一實施方案中，ISC可用于誘導抗原呈遞細胞(APC，例如，樹突細胞)以在其細胞表面呈遞I型MHC復合物內(nèi)的抗原肽。宿主可被靜脈內(nèi)免疫以誘導這種類型的反應。通過收集和分析APC呈遞抗原/I型MHC復合物的脾細胞，可證實所述反應(圖11-13)。
在替代的實施方案中，ISC可用于體外生成抗原特異性T細胞。例如，可從患有表達特定抗原的腫瘤的患者中采集骨髓細胞。采集的細胞可利用含有由腫瘤表達的抗原的ISC體外進行培養(yǎng)。再一次，如果抗原是蛋白，ISC僅需要包括蛋白的免疫顯性肽。在與ISC溫育的反應中，體外生成的抗原特異T細胞可重新導入患者。
在另一替代的實施方案中，ISC可施用給腫瘤個體以增加存活的可能性，持續(xù)時間或兩者。給用黑素瘤細胞攻擊的小鼠施用包括腫瘤特異性抗原部分的ISC，與僅用腫瘤抗原免疫的小鼠比較，增加了存活率(圖14)。
實施例下列實施例的選擇僅為了進一步說明本發(fā)明的特征，優(yōu)點和其他細節(jié)。然而應特別理解的是，盡管實施例用作此目的，但所用的具體材料和量以及其他條件和細節(jié)不應解釋在過分限制本發(fā)明范圍的內(nèi)容中。
IRM化合物的制備IRM化合物1(IRM1)N-[6-({2-[4-氨基-2-(乙氧基甲基)-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-1-基]-1，1-二甲基乙基}氨基)-6-氧代己基]-4-疊氮基-2-羥基苯甲酰胺 A部分4-氯-3-硝基喹啉(17.3g，83.2mmol)的200ml無水CH2Cl2在N2下的攪拌溶液，用三乙基胺(23.2ml，166.4mmol)和1，2-二氨基-2-甲基丙烷(9.57ml，91.5mmol)處理。攪拌過夜后，反應混合物用800ml CHCl3稀釋，并用水(3×300ml)和鹽水(300ml)洗滌。有機部分對Na2SO4干燥，并濃縮得到金黃色固體2-甲基-N1-(3-硝基喹啉-4-基)丙烷-1，2-二胺(21.0g)。
B部分2-甲基-N1-(3-硝基喹啉-4-基)丙烷-1，2-二胺(2.60g，10.0mmol)的50ml四氫呋喃(THF)的溶液在N2下冷卻至0℃，并用10ml 1N NaOH溶液處理。然后，將二-叔-丁基二碳酸酯(2.18g，10.0mmol)加入到快速攪拌的溶液中。讓反應混合物溫熱至室溫，并攪拌過夜。另加入400mg二-叔-丁基二碳酸酯，繼續(xù)攪拌3天。用乙酸乙酯(200ml)處理反應液，并用水(2×)和鹽水洗滌。有機部分對Na2SO4干燥，濃縮得到黃色固體，并用10％EtOAc/己烷研磨。過濾分離固體，并在真空下干燥過夜，得到黃色粉末叔-丁基1，1-二甲基-2-[(3-硝基喹啉-4-基)氨基]乙基氨基甲酸酯(2.80g)。
C部分叔-丁基1，1-二甲基-2-[(3-硝基喹啉-4-基)氨基]乙基氨基甲酸酯(3.50g，9.72mmol)的150ml甲苯的溶液用0.3g 5％鉑碳處理，氫氣(3atm，3Kg/cm2)下振蕩6小時。溶液通過C鹽墊過濾，并濃縮得到3.04g淺橙色泡沫粗叔-丁基2-[(3-氨基喹啉-4-基)-1，1-二甲基乙基氨基甲酸酯。
D部分叔-丁基2-[(3-氨基喹啉-4-基)-1，1-二甲基乙基氨基甲酸酯(3.04g，9.21mmol)的50ml CH2Cl2的溶液冷卻至0℃，并用三乙基胺(1.41ml，10.13mmol)和乙氧基乙?；?1.02ml，10.17mmol)處理。2小時后，反應混合物在減壓下濃縮。所得漿液被100ml EtOH吸收，并用4.5ml三乙基胺處理。溶液加熱回流過夜。反應混合物濃縮，吸收在100mlCH2Cl2中，并用水(2×)和鹽水洗滌。有機部分對Na2SO4干燥且濃縮。所得漿液經(jīng)柱色譜(SiO2，80％EtOAc/己烷)純化，得到桃色泡沫叔-丁基2-[2-(乙氧基甲基)-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-1-基]-1，1-二甲基乙基氨基甲酸酯(1.57g)。
E部分叔-丁基2-[2-(乙氧基甲基)-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-1-基]-1，1-二甲基乙基氨基甲酸酯(1.57g，3.94mmol)的30ml CH2Cl2的溶液用3-氯代過氧苯甲酸(77％，1.01g，4.57mmol)處理。攪拌2小時后，反應混合物另用30ml CH2Cl2處理，并用1％Na2CO3溶液(2×30ml)，水和鹽水洗滌。有機部分對Na2SO4干燥，濃縮得到淺棕色泡沫叔-丁基2-[2-(2-(乙氧基甲基)-5-氧橋-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-1-基)-1，1-二甲基乙基氨基甲酸酯(1.58g)。
F部分叔-丁基2-[2-(2-(乙氧基甲基)-5-氧橋-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-1-基)-1，1-二甲基乙基氨基甲酸酯(1.57g，3.79mmol)的20ml 1，2-二氯代乙烷的溶液加熱至70℃，并用2ml濃氨水溶液處理。向快速攪拌的溶液中加入固體p-甲苯磺酰基氯(795mg，4.17mmol)。然后，將反應混合物密封在壓力容器中，并繼續(xù)加熱2小時。反應混合物冷卻，并用50mlCHCl3處理。反應混合物用水，1％Na2CO3溶液(3×)和鹽水洗滌。有機部分對Na2SO4干燥，并濃縮得到淺棕色油產(chǎn)物。所得油通過柱色譜(SiO2，2-5％MeOH/CHCl3)純化，得到淺黃色泡沫叔-丁基2-[4-氨基-2-(乙氧基甲基)-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-1-基]-1，1-二甲基乙基氨基甲酸酯(1.26g)。
G部分將叔-丁基2-[4-氨基-2-(乙氧基甲基)-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-1-基]-1，1-二甲基乙基氨基甲酸酯(1.26g，3.05mmol)溶解在10ml EtOH中，并用10ml 2M HCl的EtOH處理。加熱回流2小時后，反應混合物冷卻，并在減壓下濃縮。所得黃色固體溶解在50ml水中，并用CHCl3(20ml)萃取。丟棄有機層，加入濃氨水溶液使水相部分變成堿性(pH約12)。然后，用CHCl3(4×20ml)萃取，合并有機部分，用Na2SO4干燥，并濃縮得到淺棕色粉末1-(2-氨基-2-甲基丙基)-2-(乙氧基甲基)-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-4-胺(808mg)。m.p.161.0-162.0℃；MS m/z 314(M+H)；1H NMR(300MHz，d6-DMSO)δ8.30(d，J＝7.7Hz，1H)，7.59(dd，J＝1.2，8.3Hz，1H)，7.40(ddd，J＝1.0，7.2，8.1Hz，1H)，7.21(ddd，J＝1.2，7.0，8.2Hz，1H)，6.57(s，2H)，4.94(br s，2H)，4.61(br s，2H)，3.52(q，J＝7.0Hz，2H)，1.61(s，2H)，1.31(t，J＝7.0Hz，3H)，1.07(s，6H)；13C NMR(75MHz，d6-DMSO)δ152.4，151.1，145.7，134.3，126.8，126.7，121.7，120.8，115.7，65.6，65.2，55.8，52.5，29.2，15.4。
C17H23N5O分析計算值％C，65.15；％H，7.40；％N，22.35。實測值％C，65.04；％H，7.52；％N，22.07。
H部分在氮氣氣氛下，N-羥基硫代琥珀酰基(疊氮基水楊基氨基)己酸酯(100mg，0.204mmol的磺基-LC-NHS-ASA，來自Pierce Biotechnology，Inc，Rockford，IL，USA)的N，N-二甲基甲酰胺DMF(2-4ml)的溶液加入1-(2-氨基-2-甲基丙基)-2-(乙氧基甲基)-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-4-胺(63mg，0.201mmol)的DMF(5ml)的溶液中。反應混合物在箔包裹的容器中氮氣下攪拌。2天后，另加入50mg N-羥基硫代琥珀?；?疊氮基水楊基氨基)己酸酯。約1周后，反應混合物在55℃下減壓濃縮。殘留物分配在含有少量甲醇的二氯甲烷和水之間。分離有機層，并在減壓下濃縮。殘留物通過閃爍色譜(2×15cm SiO2，用6％甲醇的氯仿洗脫)純化，得到53mg無色玻璃狀產(chǎn)物。利用二氯甲烷將玻璃狀產(chǎn)物轉(zhuǎn)移到錐形瓶中，濃縮得到泡沫。泡沫在高真空下干燥過夜，得到48mg白色結(jié)晶固體。NMR分析表明存在二氯甲烷，因此此材料先在高真空下干燥過夜，再在真空箱中50℃下干燥5小時。HPLC分析表明純度＞93％。
IRM化合物2(IRM2)N-{6-[(2-{2-[4-氨基-2-(2-甲氧基乙基)-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-1-基]乙氧基}乙基)氨基]-6-氧代己基}-4-疊氮-2-羥基苯甲酰胺 A部分2-(2-氨基乙氧基)乙醇(29.0g，0.276mol)的180ml四氫呋喃(THF)的溶液在氮氣下冷卻至0℃，并用140ml 2N NaOH溶液處理。然后，向快速攪拌的溶液中滴加二-叔-丁基二碳酸酯(60.2g，0.276mol)的180ml THF的溶液，歷時1小時以上。反應混合物溫熱至室溫，另攪拌18小時。減壓下去除THF，并且加入150ml 1M H2SO4溶液使剩余水漿調(diào)整至pH3。用乙酸乙酯(300ml，100ml)萃取，合并有機層，并經(jīng)水(2×)和鹽水洗滌。有機部分對Na2SO4干燥，并濃縮得到無色油叔-丁基2-(2-羥基乙氧基)乙基氨基甲酸酯(47.1g)。
B部分叔-丁基2-(2-羥基乙氧基)乙基氨基甲酸酯(47.1g，0.230mol)的1L無水CH2Cl2的快速攪拌溶液氮氣下冷卻至0℃，并用三乙基胺(48.0ml，0.345mol)處理。然后，滴加甲烷磺酰氯(19.6ml，0.253mol)，歷時30分鐘以上。反應混合物溫熱至室溫，另攪拌22小時。加入500ml飽和NaHCO3溶液猝滅反應，并且分離有機層。接著，用水(3×500ml)和鹽水洗滌有機相。有機部分對Na2SO4干燥，并濃縮得到棕色油2-{2-[(叔-丁氧基羰基}氨基]乙氧基}乙基甲烷磺酸酯(63.5g)。
C部分
2-{2-[(叔-丁氧基羰基)氨基]乙氧基}乙基甲烷磺酸酯(63.5g，0.224mol)的400ml N，N-二甲基甲酰胺(DMF)的攪拌溶液用NaN3(16.1g，0.247mol)處理，反應混合物在氮氣下加熱至90℃。5小時后，溶液冷卻至室溫，并且用500ml冷水處理。然后，反應混合物用Et2O(3×300ml)萃取，合并有機萃取物，用水(4×100ml)和鹽水(2×100ml)洗滌。有機部分對MgSO4干燥，并濃縮得到52.0g淺棕色油叔-丁基2-(2-疊氮基乙氧基)乙基氨基甲酸酯。
D部分叔-丁基2-(2-疊氮基乙氧基)乙基氨基甲酸酯(47.0g，0.204mol)的MeOH溶液用4g 10％鉑碳處理，并且在H2(3Kg/cm2)下振蕩24小時。然后，通過C鹽墊過濾溶液，并且濃縮得到35.3g無色液體粗叔-丁基2-(2-氨基乙氧基)乙基氨基甲酸酯，無需進一步純化即可使用。
E部分4-氯-3-硝基喹啉(31.4g，0.151mol)的500ml無水CH2Cl2的攪拌溶液在氮氣下用三乙基胺(43ml，0.308mol)和叔-丁基2-(2-氨基乙氧基)乙基氨基甲酸酯(0.151mol)處理。攪拌過夜后，反應混合物用水(2×300ml)和鹽水(300ml)洗滌。有機部分對Na2SO4干燥，并濃縮得到金黃色固體。用乙酸乙酯/己烷重結(jié)晶得到43.6g金黃色晶體叔-丁基2-{2-[(3-硝基喹啉-4基)氨基]乙氧基}乙基氨基甲酸酯。
F部分叔-丁基2-{2-[(3-硝基喹啉-4基)氨基]乙氧基}乙基氨基甲酸酯(7.52g，20.0mmol)的甲苯的溶液用1.5g 5％鉑碳處理，并且在H2(3Kg/cm2)下振蕩24小時。然后，通過C鹽墊過濾溶液，并且濃縮得到6.92g黃漿粗叔-丁基2-{2-[(3-氨基喹啉-4-基)氨基]乙氧基}乙基氨基甲酸酯。
G部分叔-丁基2-{2-[(3-氨基喹啉-4-基)氨基]乙氧基}乙基氨基甲酸酯(10.2g，29.5mmol)的250ml無水CH2Cl2的溶液冷卻至0℃，并且用三乙基胺(4.18ml，30.0mmol)處理。然后，滴加甲氧基丙?；?3.30ml，30.3mmol)，歷時5分鐘以上。反應混合物溫熱至室溫，并且繼續(xù)攪拌1小時。反應混合物減壓下濃縮得到橙色固體。將該固體溶解在250ml EtOH中，加入12.5ml三乙基胺?；旌衔锛訜嶂粱亓鳎⑶以诘獨庀聰嚢柽^夜。反應液減壓下濃縮至干燥，并且用300ml Et2O處理。混合物過濾，過濾液減壓下濃縮得到棕色固體。固體溶解在200ml熱甲醇中，并且用活性碳處理。過濾熱溶液，經(jīng)濃縮得到11.1g黃漿叔-丁基2-{2-[2-(2-甲氧基乙基)-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-1-基]乙氧基}乙基氨基甲酸酯。
H部分叔-丁基2-{2-[2-(2-甲氧基乙基)-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-1-基]乙氧基}乙基氨基甲酸酯(10.22g，24.7mmol)的250ml CHCl3的溶液用3-氯過苯甲酸(77％，9.12g，40.8mmol)處理。攪拌30分鐘后，反應混合物用1％Na2CO3溶液(2×75ml)和鹽水洗滌。有機層對Na2SO4干燥，并濃縮得到10.6g橙色泡沫叔-丁基2-{2-[2-(2-甲氧基乙基)-5-氧橋-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-1-基]乙氧基}乙基氨基甲酸酯，無需進一步純化即可使用。
I部分叔-丁基2-{2-[2-(2-甲氧基乙基)-5-氧橋-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-1-基]乙氧基}乙基氨基甲酸酯(10.6g，24.6mmol)的100ml 1，2-二氯乙烷的溶液加熱至60℃，并且用10ml濃氨水溶液處理。向快速攪拌的溶液中加入固體p-甲苯磺酰基氯(7.05g，37.0mmol)，歷時10分鐘以上。反應混合物另用1ml濃氨水溶液處理，然后密封在壓力容器中，繼續(xù)加熱2小時。接著，反應混合物冷卻，并且用100ml CHCl3處理。反應混合物用水，1％Na2CO3溶液(2×)和鹽水處理。有機部分對Na2SO4干燥，并且濃縮得到10.6g棕色泡沫叔-丁基2-{2-[4-氨基-2-(2-甲氧基乙基)-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-1-基]乙氧基}乙基氨基甲酸酯。
J部分叔-丁基2-{2-[2-(2-甲氧基乙基)-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-1-基]乙氧基}乙基氨基甲酸酯(10.6g，24.6mmol)用75ml 2M HCl的乙醇處理，并且混合物攪拌下加熱至回流。1.5小時后，反應混合物冷卻，過濾后得到粘性固體。固體用乙醇和Et2O洗滌后，真空干燥，得到淺棕色固體，該產(chǎn)物的鹽酸鹽。將該鹽水鹽溶解在50ml水中，并且用10％NaOH溶液處理，從而制成游離堿。然后，水懸浮液濃縮至干燥，殘留物用CHCl3處理。通過過濾去除所得鹽，過濾液濃縮得到3.82g茶色粉末1-[2-(2-氨基乙氧基)乙基]-2-(2-甲氧基乙基)-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-4-胺。
MS 330(M+H)+；1H NMR(300MHz，DMSO-d6)δ8.10(d，J＝8.1Hz，1H)；7.66(d，J＝8.2Hz，1H)；7.40(m，1H)；7.25(m，1H)；6.88(brs，2H)；4.78(t，J＝5.4Hz，2H)；3.89(t，J＝4.8Hz，2H)；3.84(t，J＝6.9Hz，2H)；3.54(t，J＝5.4Hz，2H)；3.31(s，3H)；3.23(t，J＝6.6Hz，2H)；2.88(t，J＝5.3Hz，2H)。
部分K在氮氣氣氛下，向1-[2-(2-氨基乙氧基)乙基]-2-(2-甲氧基乙基)-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-4-胺(66mg，0.201mmol)的DMF(5ml)溶液中加入N-羥基硫代?；牾；?疊氮基水楊基氨基)己酸酯(100mg，0.204mmol磺基-LC-NHS-ASA，來自Pierce Biotechnology，Inc，Rockford，IL，USA)的DMF(2-4ml)的溶液。3.5小時后，HPLC分析顯示沒有初始材料存在。反應混合物攪拌過夜，并且減壓下濃縮。殘留物經(jīng)閃爍色譜(2×15cm SiO2，用8％甲醇的氯仿洗脫)純化，得到55mg無色玻璃狀產(chǎn)物。利用二氯甲烷將玻璃狀產(chǎn)物轉(zhuǎn)移至錐形瓶中，濃縮后得到泡沫。泡沫先在高真空下干燥過夜，再在真空箱中50℃下干燥5小時，得到45mg白色蓬松固體產(chǎn)物。HPLC分析顯示純度＞95％。
IRM化合物3(IRM3)N-(2-{2-[4-氨基-2-(2-甲氧基乙基)-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-1-基]乙氧基}乙基)十六烷酰胺 在氮氣氣氛下，1-[2-(2-氨基乙氧基)乙基]-2-(2-甲氧基乙基)-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-4-胺(140.5mg，0.428mmol)在二氯甲烷(3.5ml)和三乙基胺(150μl，1.07mmol)的混合物中的懸浮液冷卻至0℃。緩慢加入棕櫚酰氯(130μl，0.428mmol)。使反應混合物在0℃下攪拌2小時，此時，薄層色譜分析顯示，原料沒有留下。反應混合物用二氯甲烷(30ml)稀釋，用飽和碳酸氫鈉溶液(2×5ml)洗滌，對硫酸鎂干燥，然后減壓濃縮。所得殘留物通過柱色譜(12g硅膠，用2％甲醇的二氯甲烷洗脫)純化，得到183mg白色粉末N-(2-{2-[4-氨基-2-(2-甲氧基乙基)-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-1-基]乙氧基}乙基)十六烷酰胺。
C33H53N5O3分析計算值％C，69.80；％H，9.41；％N，12.33；實測值％C，69.60；％H，9.28；％N，11.99。
實施例1免疫反應調(diào)節(jié)劑與卵清蛋白的交聯(lián)IRM1懸浮在二甲基亞砜(DMSO)中，至10mg/ml。卵清蛋白懸浮在磷酸鹽緩沖液(PBS)中，至10mg/ml，以及加入NaOH調(diào)節(jié)pH＞10.0。在12孔組織培養(yǎng)板的單個孔中，500μl卵清蛋白溶液(5mg卵清蛋白)與100μl IRM1溶液(1mg IRM1)混合。將培養(yǎng)板置于冰上，并且將長波長UV光源直接置于板的上方，盡可能靠近含有IRM1/卵清蛋白混合物的孔。照射混合物15分鐘。所得共軛物從孔中取出，重新懸浮于PBS中，至終濃度5mg/mL卵清蛋白，0.5mg/ml IRM1，并且對PBS透析以去除任何未共軛的IRM。
實施例2免疫C57BL/6小鼠用共軛物(1mg卵清蛋白和200μg IRM1，如實施例1所制備)的200μl PBS或皮下或腹膜內(nèi)免疫。對照小鼠用1mg卵清蛋白的200μl PBS免疫。對于初級反應分析而言，免疫后5-7天處死小鼠。對次級反應分析而言，小鼠在初始免疫后7-15天加強免疫，并且加強免疫后5-7天被處死。除非另有說明，從皮下免疫小鼠中采集淋巴結(jié)用于分析，而從腹膜內(nèi)免疫小鼠中采集脾細胞用于分析。
實施例3試劑熒光染料標記的抗體特異于小鼠CD8，CD11c，和CD44，獲自Pharmingen(San Diego，CA)。單克隆抗體25D1.16(Ron Germain博士，NIH)特異于結(jié)合至I型MHC分子H-2Kb的卵清蛋白顯性肽(SIINFEKL)。Porgador等，Immunity 6715-26。卵清蛋白獲自SigmaChemical Company(St.Louis，MO)。I型MHC分子H-2Kb的四聚體結(jié)合至卵清蛋白顯性肽SIINFEKL，其制備如Kedl等，J Exp Med，1921105-13(2000)所述。表達卵清蛋白的黑色瘤細胞系B16ova的制備方法是用編碼全長卵清蛋白的質(zhì)粒脂轉(zhuǎn)染B16-F10細胞系(ATCC#CRL-6475)。參見Kedl等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，9810811-6。細胞因子捕獲和檢測試劑來自Miltyeni Biotech(Auburn，CA)。
實施例4實驗小鼠如實施例2所述用如實施例1制備的共軛物皮下或腹膜內(nèi)免疫。對照小鼠如實施例2所述用卵清蛋白免疫。7天后，取出淋巴結(jié)或脾臟，細胞用特異于CD8，CD44，和H-2Kb/SIINFEKL四聚體的抗體染色，并且通過流式細胞計數(shù)儀進行分析。結(jié)果示于圖1-3。對全部三種標記為陽性染色的細胞鑒定為活化的卵清蛋白特異的CD8+T細胞，其作為免疫的結(jié)果而發(fā)生。
圖1-3分別包括所有受檢的CD8+T細胞被鑒定為活化的卵清蛋白特異的CD8+T細胞的百分比。在對照小鼠中，0.07％的CD8+T細胞是活化的卵清蛋白特異的CD8+T細胞。用共軛物皮下免疫生成0.52％活化的卵清蛋白特異的CD8+T細胞。用共軛物腹膜內(nèi)免疫生成0.92％活化的卵清蛋白特異的CD8+T細胞。
用與IRM1共軛的卵清蛋白優(yōu)勢肽(SIINFEKL)(與200μg IRM1交聯(lián)的100μg肽)免疫也誘導卵清蛋白-特異的CD8+T細胞的活化。
實施例5對照小鼠如實施例2所述，用卵清蛋白免疫。實驗小鼠如實施例2所述用如實施例1中制備的共軛物或皮下或腹膜內(nèi)免疫。免疫7天后采集適當?shù)拿庖咝∈?，并且與SIINFEKL肽體外溫育4小時。利用與流式細胞計數(shù)儀偶聯(lián)的IFN-γ捕獲和檢測分析，鑒定干擾素γ(IFN-γ)-生產(chǎn)的CD8+T細胞。通過用IRM1-卵清蛋白共軛物免疫所生成的CD8+T細胞響應于隨后的抗原刺激而產(chǎn)生IFN-γ(圖4-6)。
實施例6如實施例2所述，小鼠用如實施例1中制備的共軛物免疫，然后用等量的共軛物在第15天時加強。加強后7天，對來自加強動物的脾臟和淋巴結(jié)細胞進行分析。分析顯示，與僅接受初級免疫的小鼠比較，活化的卵清蛋白特異的CD8+T細胞的百分比增加(圖7)。
實施例7小鼠用卵清蛋白表達的黑色瘤細胞系B16ova(1×105細胞)皮內(nèi)注射。在第7天，小鼠或用1mg卵清蛋白(對照)或用如實施例1制備的共軛物皮下注射。在第14天，小鼠如第7天用卵清蛋白或共軛物皮下加強。在第20天，腫瘤大小用卡尺在兩維方向進行測量。與對照比較，用共軛物免疫導致腫瘤大小減小(圖8)。
實施例8小鼠用卵清蛋白表達的黑素瘤細胞系B16ova(1×105細胞)皮內(nèi)注射。7天和14天后，小鼠或用1mg卵清蛋白(對照)或用如實施例1制備的共軛物腹膜內(nèi)注射。用黑素瘤細胞系攻擊后20天，取出脾臟和腫瘤，并且用特異于CD8和CD44以及H-2Kb/SIINFEKL四聚體的抗體染色各個來源的細胞。流式細胞計數(shù)儀分析顯示，活化的卵清蛋白特異的CD8+T細胞在脾臟(圖9)和腫瘤(圖10)內(nèi)的顯著擴大。
實施例9小鼠用卵清蛋白，卵清蛋白和未配對的IRM11-(2-氨基-2-甲基丙基)-2-(乙氧基甲基)-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-4-胺(在與連接基團連接之前的IRM1-合成IRM1的G部分產(chǎn)物)或用如實施例1制備的共軛物靜脈內(nèi)免疫。14小時后，取出脾臟，用膠原酶處理，并且細胞用特異于CD8，CD11c和抗體25D1.16的抗體染色，抗體25D1.16特異于復合有I型MHC H-2Kb分子的卵清蛋白肽SIINFEKL。流式細胞計數(shù)儀分析顯示，用IRM1-卵清蛋白共軛物免疫小鼠(圖13)比僅用卵清蛋白免疫小鼠或用未配對的卵清蛋白和IRM1的混合物(圖12)免疫小鼠生成了更高百分比的呈遞Kb/SIINFEKL的CD11c+，CD8+樹突細胞。
實施例10在第0天，如實施例2所述，小鼠用卵清蛋白(對照)或用如實施例1制備的IRM1共軛物皮下免疫。小鼠在第14天接受加強免疫。然后，小鼠在第28天用卵清蛋白表達的黑素瘤細胞系B16ova(1×105細胞)皮內(nèi)攻擊，并且對腫瘤生長進行監(jiān)控。在第75天，有80％的免疫有共軛物的小鼠存活并且顯示出健康，而僅用卵清蛋白免疫的小鼠全部死亡(圖14)。
實施例11將IRM3溶解于DMSO中至濃度10mg/ml而制備IRM3的儲液。卵清蛋白溶解于PBS中至濃度50mg/ml。50μl IRM3儲液加入到150μl PBS中，然后通過旋渦振蕩混合。50μl卵清蛋白加入到IRM3溶液中，并且通過旋渦振蕩混合。結(jié)果產(chǎn)生IRM3和卵清蛋白的渾濁膠狀懸浮液。
在第0天，如實施例2所述，小鼠或用(a)單獨卵清蛋白，或(b)50μl卵清蛋白和IRM3的膠狀懸浮液皮下免疫。在第6天，取出引流淋巴結(jié)(draining lymph nodes)，均質(zhì)，并且用H-2Kb/SIINFEKL四聚體染色以鑒定卵清蛋白特異的T細胞。圖15示出單獨用卵清蛋白免疫的對照小鼠的流式細胞儀數(shù)據(jù)；圖16和17示出免疫有膠狀懸浮液的兩種不同小鼠的數(shù)據(jù)。
實施例12如實施例1所述制備IRM2和卵清蛋白的共軛物，除了用IRM2代替IRM1之外。
24只小鼠分成8組，每組3只。其中4組在第0天如實施例2所述皮下免疫，每組接受增量的IRM1-卵清蛋白共軛物。剩余4組在第0天用IRM2-卵清蛋白共軛物進行同樣的免疫。在第6天，處死小鼠，取出引流淋巴結(jié)，并且用H-2Kb/SIINFEKL四聚體染色以鑒定卵清蛋白特異的T細胞。對每只小鼠計算卵清蛋白特異的T細胞的百分比。圖18總結(jié)了結(jié)果。
實施例13小鼠用約2×106OT1卵清蛋白-特異的轉(zhuǎn)基因T細胞(The JacksonLaboratory，Bar Harbor，Maine)過繼性轉(zhuǎn)移。小鼠在第0天，如實施例2所述，用(a)100μg卵清蛋白，(b)100μg卵清蛋白+50μgCpG(Ova+CpG)，(c)100μg卵清蛋白+50μg未配對的IRM1(Ova+IRM)，或者(d)100μg與50μg IRM1共軛的卵清蛋白(Ova×IRM)皮下免疫。在第5天，取出引流淋巴結(jié)，并且細胞用H-2Kb/SIINFEKL四聚體染色以鑒定卵清蛋白特異的T細胞。圖19示出卵清蛋白-特異的T細胞在Ova+CpG，Ova+IRM，和Ova×IRM組比單獨用卵清蛋白免疫的小鼠中的倍增。
在此引用的專利，專利文獻和公布的全部內(nèi)容以其全文引作參考，就如同分別單個引入一樣。在存在沖突的情況下，以本說明書，包括定義為準。
在無需背離本發(fā)明的范圍和實質(zhì)的情況下，本領域技術人員可對本發(fā)明有多種修飾和改變是一目了然的。例證性實施方案和實施例僅僅以例子提供，并非旨在限制本發(fā)明的范圍。本發(fā)明的保護范圍僅受隨附的權利要求限制。
權利要求
1.一種免疫刺激組合物，包括與抗原部分配對的免疫反應調(diào)節(jié)劑部分。
2.權利要求1的免疫刺激組合物，其中免疫反應調(diào)節(jié)劑部分是Toll樣受體2，Toll樣受體4，Toll樣受體6，Toll樣受體7，或Toll樣受體8的激動劑。
3.權利要求1的免疫刺激組合物，其中免疫反應調(diào)節(jié)劑部分包括咪唑并喹啉胺；四氫咪唑并喹啉胺；咪唑并吡啶胺；芳基醚取代的咪唑并吡啶胺；1，2-橋連的咪唑并喹啉胺；6，7-稠合的環(huán)烷基咪唑并吡啶胺；咪唑并二氮雜萘胺；四氫咪唑并二氮雜萘胺；唑并喹啉胺；噻唑并喹啉胺；唑并吡啶胺；噻唑并吡啶胺；唑并二氮雜萘胺；或噻唑并二氮雜萘胺。
4.權利要求1的免疫刺激組合物，其中免疫反應調(diào)節(jié)劑部分包括分子量小于約1000道爾頓的有機部分。
5.權利要求1的免疫刺激組合物，其中免疫反應調(diào)節(jié)劑部分和抗原部分是共價偶聯(lián)的。
6.權利要求1的免疫刺激組合物，其中免疫反應調(diào)節(jié)劑部分和抗原部分除了共價偶聯(lián)外，是通過物理或化學結(jié)合而配對的，所述共價偶聯(lián)限制了免疫反應調(diào)節(jié)劑部分相對于抗原部分的獨立擴散。
7.權利要求1的免疫刺激組合物，其中所述組合物包括膠狀懸浮液。
8.權利要求1的免疫刺激組合物，其中抗原部分包括氨基酸序列，核苷酸序列，脂多糖，朊病毒，細菌，病毒或真菌。
9.權利要求8的免疫刺激組合物，其中氨基酸序列為多肽。
10.權利要求9的免疫刺激組合物，其中多肽為蛋白。
11.權利要求1的免疫刺激組合物，其中免疫反應調(diào)節(jié)劑部分為下式的化合物 其中R1為連接基團；R2選自-氫；-烷基；-烯基；-芳基；-取代的芳基；-雜芳基；-取代的雜芳基；-烷基-O-烷基；-烷基-S-烷基；-烷基-O-芳基；-烷基-S-芳基；-烷基-O-烯基；-烷基-S-烯基；以及-被一種或多種選自下列基團的取代基取代的烷基或烯基-OH；-鹵素；-N(R5)2；-CO-N(R5)2；-CS-N(R5)2；-SO2-N(R5)2；-NR5-CO-C1-10烷基；-NR5-CS-C1-10烷基；-NR5-SO2-C1-10烷基；-CO-C1-10烷基；-CO-O-C1-10烷基；-N3；-芳基；-取代的芳基；-雜芳基；-取代的雜芳基；-雜環(huán)基；-取代的雜環(huán)基；-CO-芳基；-CO-(取代的芳基)；-CO-雜芳基；以及-CO-(取代的雜芳基)；R3和R4各自獨立是-氫；-鹵素；-烷基；-烯基；-O-烷基；-S-烷基；以及-N(R5)2；或者當合起來時，R3和R4形成任選被一種或多種選自下列基團的取代基取代的稠合的芳基或雜芳基-鹵素；-烷基；-烯基；-O-烷基；-S-烷基；以及-N(R5)2；或者當合起來時，R3和R4形成稠合的5-7元飽和環(huán)，任選含有一種或多種雜原子，以及任選被一種或多種選自下列基團的取代基取代-鹵素；-烷基；-烯基；-O-烷基；-S-烷基；以及-N(R5)2；以及各個R5獨立地為氫或C1-10烷基。
12.下式的免疫刺激共軛物或其可藥用鹽 其中R1為連接基團；R2選自-氫；-烷基；-烯基；-芳基；-取代的芳基；-雜芳基；-取代的雜芳基；-烷基-O-烷基；-烷基-S-烷基；-烷基-O-芳基；-烷基-S-芳基；-烷基-O-烯基；-烷基-S-烯基；以及-被一種或多種選自下列基團的取代基取代的烷基或烯基-OH；-鹵素；-N(R5)2；-CO-N(R5)2；-CS-N(R5)2；-SO2-N(R5)2；-NR5-CO-C1-10烷基；-NR5-CS-C1-10烷基；-NR5-SO2-C1-10烷基；-CO-C1-10烷基；-CO-O-C1-10烷基；-N3；-芳基；-取代的芳基；-雜芳基；-取代的雜芳基；-雜環(huán)基；-取代的雜環(huán)基；-CO-芳基；-CO-(取代的芳基)；-CO-雜芳基；以及-CO-(取代的雜芳基)；R3和R4各自獨立是-氫；-鹵素；-烷基；-烯基；-O-烷基；-S-烷基；以及-N(R5)2；或者當合起來時，R3和R4形成任選被一種或多種選自下列基團的取代基取代的稠合的芳基或雜芳基-鹵素；-烷基；-烯基；-O-烷基；-S-烷基；以及-N(R5)2；或者當合起來時，R3和R4形成稠合的5-7元飽和環(huán)，任選含有一種或多種雜原子，以及任選被一種或多種選自下列基團的取代基取代-鹵素；-烷基；-烯基；-O-烷基；-S-烷基；以及-N(R5)2；以及各個R5獨立地為氫或C1-10烷基；以及n為1-10。
13.權利要求12的免疫刺激共軛物，其中R2選自氫，烷基和烷基-O-烷基。
14.權利要求13的免疫刺激共軛物，其中R2選自氫，甲基，乙基，丙基，丁基，環(huán)丙基甲基，乙氧基甲基和甲氧基乙基。
15.權利要求12的免疫刺激共軛物，其中R3和R4合起來形成苯環(huán)。
16.權利要求12的免疫刺激共軛物，其中R3和R4合起來形成吡啶環(huán)。
17.權利要求12的免疫刺激共軛物，其中R3和R4合起來形成6元飽和環(huán)。
18.權利要求12的免疫刺激共軛物，其中R3和R4合起來形成含有N原子的6元飽和環(huán)。
19.權利要求12的免疫刺激共軛物，其中R3和R4獨立地選自氫和烷基。
20.權利要求12的免疫刺激共軛物，其中R1具有下式-X-Y-Z-其中X為任選被一種或多種下列基團阻斷的亞烷基基團-O-；-S(O)0-2-；-N(R5)-；-N(R5)-C(O)-；-N(R5)-S(O2)-；-N(R5)-C(O)-N(R5)-；-N(R5)-C(S)-N(R5)-；以及-C(O)-N(R5)-；Y為鍵，或選自-N(R5)-；-N(R5)-C(O)-；-N(R5)-C(O)-環(huán)己基-；-N(R5)-C(O)-亞苯基-；以及-亞苯基-；Z為反應基ZA與抗原共價偶聯(lián)時形成的二價連接基團；ZA為與抗原反應形成共價鍵的反應基；以及各個R5獨立地為氫或C1-10烷基。
21.權利要求20的免疫刺激共軛物，其中ZA為與伯胺反應的基團。
22.權利要求21的免疫刺激共軛物，其中ZA為N-羥基琥珀酰亞胺酯或N-羥基硫代琥珀酰亞胺酯。
23.權利要求20的免疫刺激共軛物，其中ZA為與巰基反應的基團。
24.權利要求23的免疫刺激共軛物，其中ZA為馬來酰亞胺或碘代乙酰基。
25.權利要求20的免疫刺激共軛物，其中ZA為光反應基。
26.權利要求25的免疫刺激共軛物，其中ZA為苯基疊氮化物。
27.權利要求26的免疫刺激共軛物，其中ZA選自4-疊氮基苯基，2-羥基-4-疊氮基苯基，2-硝基-4-疊氮基苯基，以及2-硝基-3-疊氮基苯基。
28.權利要求20的免疫刺激共軛物，其中Z選自-C(O)-；-C(O)-CH2-； 和 其中R’為氫，羥基或硝基。
29.權利要求12的免疫刺激共軛物，其中抗原包括氨基酸序列，核苷酸序列或脂多糖。
30.權利要求29的免疫刺激共軛物，其中氨基酸序列為多肽。
31.權利要求30的免疫刺激共軛物，其中多肽為蛋白。
32.下式的化合物或其可藥用鹽 其中X為任選被一種或多種下列基團阻斷的亞烷基基團-O-；-S(O)0-2-；-N(R5)-；-N(R5)-C(O)-；-N(R5)-S(O2)-；-N(R5)-C(O)-N(R5)-；-N(R5)-C(S)-N(R5)-；以及-C(O)-N(R5)-；Y為鍵，或選自-N(R5)-；-N(R5)-C(O)-；-N(R5)-C(O)-環(huán)己基-；-N(R5)-C(O)-亞苯基-；以及-亞苯基-；ZA為與抗原反應形成共價鍵的反應基；R2選自-氫；-烷基；-烯基；-芳基；-取代的芳基；-雜芳基；-取代的雜芳基；-烷基-O-烷基；-烷基-S-烷基；-烷基-O-芳基；-烷基-S-芳基；-烷基-O-烯基；-烷基-S-烯基；以及-被一種或多種選自下列基團的取代基取代的烷基或烯基-OH；-鹵素；-N(R5)2；-CO-N(R5)2；-CS-N(R5)2；-SO2-N(R5)2；-NR5-CO-C1-10烷基；-NR5-CS-C1-10烷基；-NR5-SO2-C1-10烷基；-CO-C1-10烷基；-CO-O-C1-10烷基；-N3；-芳基；-取代的芳基；-雜芳基；-取代的雜芳基；-雜環(huán)基；-取代的雜環(huán)基；-CO-芳基；-CO-(取代的芳基)；-CO-雜芳基；以及-CO-(取代的雜芳基)；R3和R4各自獨立是-氫；-鹵素；-烷基；-烯基；-O-烷基；-S-烷基；以及-N(R5)2；或者當合起來時，R3和R4形成任選被一種或多種選自下列基團的取代基取代的稠合的芳基或雜芳基-鹵素；-烷基；-烯基；-O-烷基；-S-烷基；以及-N(R5)2；或者當合起來時，R3和R4形成稠合的5-7元飽和環(huán)，任選含有一種或多種雜原子，以及任選被一種或多種選自下列基團的取代基取代-鹵素；-烷基；-烯基；-O-烷基；-S-烷基；以及-N(R5)2；各個R5獨立地為氫或C1-10烷基。
33.一種刺激患者T細胞的方法，所述方法包括a)提供包含與抗原部分配對的免疫反應調(diào)節(jié)劑部分的免疫刺激組合物；b)讓免疫刺激組合物與抗原呈遞細胞結(jié)合，從而活化抗原呈遞細胞；以及c)使活化的抗原呈遞細胞刺激患者T細胞。
34.權利要求33的方法，其中免疫反應調(diào)節(jié)劑部分是Toll樣受體2，Toll樣受體4，Toll樣受體6，Toll樣受體7，或Toll樣受體8的激動劑。
35.權利要求33的方法，其中免疫反應調(diào)節(jié)劑部分包括咪唑并喹啉胺；四氫咪唑并喹啉胺；咪唑并吡啶胺；芳基醚取代的咪唑并吡啶胺；1，2-橋連的咪唑并喹啉胺；6，7-稠合的環(huán)烷基咪唑并吡啶胺；咪唑并二氮雜萘胺；四氫咪唑并二氮雜萘胺；唑并喹啉胺；噻唑并喹啉胺；唑并吡啶胺；噻唑并吡啶胺；唑并二氮雜萘胺；或噻唑并二氮雜萘胺。
36.權利要求33的方法，其中免疫反應調(diào)節(jié)劑部分和抗原部分是共價偶聯(lián)的。
37.權利要求33的方法，其中免疫反應調(diào)節(jié)劑部分和抗原部分除了共價偶聯(lián)外，是通過物理或化學結(jié)合而配對的，所述共價偶聯(lián)限制了免疫反應調(diào)節(jié)劑部分相對于抗原部分的獨立擴散。
38.權利要求37的方法，其中免疫刺激組合物包括膠狀懸浮液。
39.權利要求33的方法，其中讓免疫刺激組合物與抗原呈遞細胞體外結(jié)合。
40.權利要求39的方法，其中讓免疫刺激組合物與抗原呈遞細胞結(jié)合的步驟包括a)提供包含抗原呈遞細胞的細胞培養(yǎng)物；以及b)使抗原呈遞細胞有效刺激量的免疫刺激組合物與細胞培養(yǎng)物接觸。
41.權利要求39的方法，其中讓活化的抗原呈遞細胞刺激患者T細胞的步驟包括將活化的抗原呈遞細胞注射到患者內(nèi)。
42.權利要求33的方法，其中讓免疫刺激組合物與抗原呈遞細胞體內(nèi)結(jié)合。
43.權利要求42的方法，其中讓免疫刺激組合物與抗原呈遞細胞結(jié)合的步驟包括a)提供免疫刺激組合物作為疫苗的組分；以及b)用該疫苗免疫接種患者。
44.權利要求42的方法，其中免疫刺激組合物包括腫瘤-特異的抗原部分。
45.一種刺激產(chǎn)生抗體的細胞的方法，所述方法包括a)提供包含與抗原部分配對的免疫反應調(diào)節(jié)劑部分的免疫刺激組合物；以及b)讓免疫刺激組合物與產(chǎn)生抗體的細胞結(jié)合。
46.權利要求45的方法，其中免疫反應調(diào)節(jié)劑部分是Toll樣受體2，Toll樣受體4，Toll樣受體6，Toll樣受體7，或Toll樣受體8的激動劑。
47.權利要求45的方法，其中免疫反應調(diào)節(jié)劑部分包括咪唑并喹啉胺；四氫咪唑并喹啉胺；咪唑并吡啶胺；芳基醚取代的咪唑并吡啶胺；1，2-橋連的咪唑并喹啉胺；6，7-稠合的環(huán)烷基咪唑并吡啶胺；咪唑并二氮雜萘胺；四氫咪唑并二氮雜萘胺；唑并喹啉胺；噻唑并喹啉胺；唑并吡啶胺；噻唑并吡啶胺；唑并二氮雜萘胺；或噻唑并二氮雜萘胺。
48.權利要求45的方法，其中免疫反應調(diào)節(jié)劑部分和抗原部分是共價偶聯(lián)的。
49.權利要求45的方法，其中免疫反應調(diào)節(jié)劑部分和抗原部分除了共價偶聯(lián)外，是通過物理或化學結(jié)合而配對的，所述共價偶聯(lián)限制了免疫反應調(diào)節(jié)劑部分相對于抗原部分的獨立擴散。
50.權利要求49的方法，其中免疫刺激組合物包括膠狀懸浮液。
51.權利要求45的方法，其中讓免疫刺激組合物與產(chǎn)生抗體的細胞體內(nèi)結(jié)合。
52.權利要求51的方法，其中讓免疫刺激組合物與產(chǎn)生抗體的細胞結(jié)合的步驟包括a)提供免疫刺激組合物作為疫苗的組分；以及b)將該疫苗導入具有產(chǎn)生抗體的細胞的患者。
53.權利要求51的方法，其中免疫刺激組合物包括腫瘤-特異的抗原部分。
54.權利要求45的方法，其中讓免疫刺激組合物與產(chǎn)生抗體的細胞體外結(jié)合。
55.權利要求54的方法，其中讓免疫刺激組合物與刺激抗體的細胞結(jié)合的步驟包括a)提供包含生產(chǎn)抗體的細胞的細胞培養(yǎng)物；b)使細胞培養(yǎng)物與產(chǎn)生抗體的細胞有效刺激量的免疫刺激組合物接觸。
56.權利要求45的方法，進一步包含收集由刺激的產(chǎn)生抗體的細胞所生產(chǎn)的抗體。
全文摘要
本發(fā)明提供包括與抗原部分配對的免疫反應調(diào)節(jié)劑部分的免疫刺激組合物。
文檔編號C07K16/46GK1671412SQ03818470
公開日2005年9月21日 申請日期2003年8月14日 優(yōu)先權日2002年8月15日
發(fā)明者羅斯·M·克德爾, 喬治·W·格里斯格拉貝, 伊西德羅·安杰洛·E·薩拉加 申請人:3M創(chuàng)新有限公司