本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種快速、定量檢測(cè)試劑，采用熒光微球、量子點(diǎn)等為標(biāo)記物，以免疫層析方法，配合使用熒光免疫分析儀，實(shí)現(xiàn)同時(shí)檢測(cè)人血清、血漿和全血樣本中的saa、pct、crp的含量，具體是定量檢測(cè)saa、crp、pct的免疫熒光層析試劑盒及其制備方法。

背景技術(shù)：

血清淀粉樣蛋白a(saa)是一種急性時(shí)限反應(yīng)蛋白，血清淀粉樣蛋白a的含量濃度是反映感染性疾病早期炎癥的敏感指標(biāo)，有助于診斷炎癥、評(píng)估其活性、監(jiān)控其活動(dòng)及治療。

c反應(yīng)蛋白(crp)是指在機(jī)體受到感染或組織損傷時(shí)血漿中含量急劇上升的一種急性相蛋白。傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為crp是一種非特異的炎癥標(biāo)志物，但近十年的研究揭示了crp直接參與了炎癥與動(dòng)脈粥樣硬化等心血管疾病，并且是心血管疾病最強(qiáng)有力的預(yù)示因子。

降鈣素原(pct)是診斷和監(jiān)測(cè)細(xì)菌炎性疾病感染的一個(gè)參數(shù)。pct是嚴(yán)重細(xì)菌性炎癥和真菌感染的特異性指標(biāo)，而且也是膿毒癥和炎癥活動(dòng)有關(guān)的多臟器衰竭的可靠指標(biāo)。

研究表明在診斷炎癥、感染及相關(guān)疾病中，單一的saa、pct及crp項(xiàng)目的檢測(cè)并不能有效準(zhǔn)確的診斷疾病，診斷過程中如果將saa、crp及pct等項(xiàng)目檢測(cè)結(jié)果與臨床資料結(jié)合，在感染性疾病的診斷上有重要的意義。

然而，目前已上市產(chǎn)品中，絕大部分是saa、crp及pct等3個(gè)項(xiàng)目的單獨(dú)檢測(cè)試劑盒，或者pct和crp同時(shí)檢測(cè)試劑盒，還沒有saa、crp及pct3個(gè)項(xiàng)目同時(shí)聯(lián)檢的試劑盒，如果需要同時(shí)檢測(cè)3個(gè)項(xiàng)目的結(jié)果，需要2-3次的加樣及檢測(cè)操作，如果檢測(cè)試劑盒要求的標(biāo)本類型不一樣，還需要對(duì)患者重復(fù)取樣，操作上較為繁瑣，試劑及耗材的成本上有所浪費(fèi)，對(duì)患者也造成了額外的負(fù)擔(dān)。

通過對(duì)現(xiàn)有文獻(xiàn)的檢索發(fā)現(xiàn)，天津中新科炬生物制藥有限公司申請(qǐng)了3個(gè)相關(guān)發(fā)明專利：《一種同時(shí)定量檢測(cè)saa/pct/crp的方法》(申請(qǐng)?zhí)枮?01511018503.2)、《一種同時(shí)定量檢測(cè)saa/pct/crp的檢測(cè)裝置的制備方法》(申請(qǐng)?zhí)枮?01511018504.7)、《一種同時(shí)定量檢測(cè)saa/pct/crp的檢測(cè)裝置》(申請(qǐng)?zhí)枮?01511030398.4)。以上3個(gè)專利申請(qǐng)為相似技術(shù)，利用互相獨(dú)立的人血清淀粉樣蛋白a(saa)、人降鈣素原(pct)和c反應(yīng)蛋白(crp)檢測(cè)試紙，三聯(lián)卡殼和附帶了相應(yīng)判定方法和標(biāo)準(zhǔn)曲線的免疫層析判讀結(jié)果記錄儀，同時(shí)快速定量檢測(cè)saa/pct/crp。但其檢測(cè)方法為三聯(lián)卡，需要分別加3次樣品，加樣量和方法也各不一樣，并不能減少試劑及耗材的成本，不能實(shí)現(xiàn)真正意義上的聯(lián)檢。且其使用的是膠體金免疫層析法，其saa、pct、crp定量的檢測(cè)范圍分別為5-100mg/l，0.5-20mg/l和1-200mg/l，靈敏度較差，難以滿足臨床需求。

另外，現(xiàn)有技術(shù)中還公開了一種定量聯(lián)合檢測(cè)pct/crp/saa膠體金試紙條及其應(yīng)用的檢測(cè)裝置(申請(qǐng)?zhí)枮?01420797771.3)，本發(fā)明提供的試紙條，其為在底板上依次相互交錯(cuò)地粘貼的樣品墊、涂覆有金標(biāo)抗體的聚酯膜、包被膜及吸水紙，包被膜上設(shè)有一條包被兔抗鼠igg抗體的控制線，包被膜上還設(shè)有與所述控制線平行的三條檢測(cè)線，分別包被能與待檢抗原pct特異性結(jié)合的抗體、與待檢抗原crp特異結(jié)合的抗體以及與待檢抗原saa特異結(jié)合的抗體；所述金標(biāo)抗體有三種，分別為膠體金標(biāo)記的能與待檢抗原pct特異性結(jié)合的抗體、與待檢抗原crp特異結(jié)合的抗體以及與待檢抗原saa特異結(jié)合的抗體。該技術(shù)在一條試紙條上同時(shí)設(shè)置三條檢測(cè)線和一條檢測(cè)線，同步檢測(cè)三個(gè)指標(biāo)，經(jīng)配套免疫熒光分析儀判斷結(jié)果，靈敏度較差，準(zhǔn)確度較低，難以達(dá)到臨床要求的定量檢測(cè)要求。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提供定量檢測(cè)saa、crp、pct的免疫熒光層析試劑盒及其制備方法。該試劑盒通過熒光免疫層析法，配合使用熒光免疫分析儀，可以方便、準(zhǔn)確且高靈敏度地同時(shí)檢測(cè)saa、crp、pct的含量。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，在本發(fā)明中采取了以下技術(shù)方案：一種定量檢測(cè)saa、crp、pct的免疫熒光層析試劑盒，其特征在于，包括熒光免疫層析試紙條、熒光物質(zhì)，所述熒光免疫層析試紙條，底襯上設(shè)有硝酸纖維素膜，硝酸纖維素膜的一端銜接有樣品墊，硝酸纖維素膜的另一端銜接有吸收墊；所述硝酸纖維素膜上平行設(shè)有包被了羊抗兔igg多克隆抗體的質(zhì)控線、包被了saa單克隆抗體的檢測(cè)線、包被了crp單克隆抗體的檢測(cè)線和包被了pct單克隆抗體的檢測(cè)線；所述熒光物質(zhì)包括偶聯(lián)了兔igg多克隆抗體的熒光物質(zhì)、偶聯(lián)了配對(duì)saa單克隆抗體的熒光物質(zhì)、偶聯(lián)了配對(duì)crp單克隆抗體的熒光物質(zhì)和偶聯(lián)了配對(duì)pct單克隆抗體的熒光物質(zhì)。

進(jìn)一步的，本發(fā)明提供一種定量檢測(cè)saa、crp、pct的免疫熒光層析試劑盒的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：

1)熒光免疫層析試紙條的制備：在硝酸纖維素膜的靠近吸收墊的一端劃上包被了羊抗兔igg多克隆抗體的質(zhì)控線、包被了saa單克隆抗體的檢測(cè)線、包被了crp單克隆抗體的檢測(cè)線和包被了pct單克隆抗體的檢測(cè)線，在試紙底襯上粘貼硝酸纖維素膜，在硝酸纖維素膜一端貼上吸收墊，在另一端貼上樣品墊，制備成試紙板，然后用切條機(jī)將試紙板縱向切成4mm寬的試紙條；

2)熒光物質(zhì)應(yīng)用溶液的制備：分別將兔igg多克隆抗體、配對(duì)saa單克隆抗體的熒光物質(zhì)、配對(duì)crp單克隆抗體和配對(duì)pct單克隆抗體偶聯(lián)熒光物質(zhì)得到抗體修飾的熒光物質(zhì)，再將上述抗體修飾的熒光物質(zhì)一起稀釋至穩(wěn)定緩沖液中得到熒光物質(zhì)應(yīng)用溶液。

進(jìn)一步的，本發(fā)明提供另一種定量檢測(cè)saa、crp、pct的免疫熒光層析試劑盒的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：

1)固相結(jié)合熒光物質(zhì)的樣品墊的制備：分別將兔igg多克隆抗體、配對(duì)saa單克隆抗體的熒光物質(zhì)、配對(duì)crp單克隆抗體和配對(duì)pct單克隆抗體偶聯(lián)熒光物質(zhì)得到抗體修飾的熒光物質(zhì)，再將上述抗體修飾的熒光物質(zhì)一起固相結(jié)合至樣品墊中得到熒光物質(zhì)樣品墊。

2)熒光免疫層析試紙條的制備：在硝酸纖維素膜的靠近吸收墊的一端劃上包被了羊抗兔igg多克隆抗體的質(zhì)控線、包被了saa單克隆抗體的檢測(cè)線、包被了crp單克隆抗體的檢測(cè)線和包被了pct單克隆抗體的檢測(cè)線，在試紙底襯上粘貼硝酸纖維素膜，在硝酸纖維素膜一端貼上吸收墊，然后組合上固相結(jié)合熒光物質(zhì)的樣品墊，制備成試紙板，最后用切條機(jī)將試紙板縱向切成4mm寬的試紙條。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果在于：

1、本發(fā)明的定量檢測(cè)saa、crp、pct的免疫熒光層析試劑盒在試紙條上設(shè)有saa、crp跟pct的檢測(cè)線，能夠通過一次加樣同步檢測(cè)saa、crp和pct3個(gè)指標(biāo)，操作簡(jiǎn)單，能減少試劑及耗材的成本。

2、本發(fā)明的定量檢測(cè)saa、crp、pct的免疫熒光層析試劑盒基于熒光免疫層析技術(shù)，熒光物質(zhì)上偶聯(lián)的抗體與樣本中的抗原相結(jié)合然后再與試紙條上面的抗體相互作用，然后通過熒光分析儀將熒光物質(zhì)的不同光信號(hào)轉(zhuǎn)化為電信號(hào)得到不同的樣本檢測(cè)濃度，結(jié)果精準(zhǔn)，能明顯改善傳統(tǒng)膠體金法肉眼判讀結(jié)果導(dǎo)致的準(zhǔn)確性差、重復(fù)性差和效率低的問題。

3、本發(fā)明的定量檢測(cè)saa、crp、pct的免疫熒光層析試劑盒采用的熒光免疫法比傳統(tǒng)膠體金法靈敏度更高；saa的檢測(cè)范圍達(dá)到0.5～200mg/l，crp的檢測(cè)范圍達(dá)到0.2～200mg/l，pct的檢測(cè)范圍達(dá)到0.1～100ug/l。saa、crp和pct的靈敏度分別達(dá)到0.5mg/l、0.2mg/l和0.1ug/l。

附圖說明

圖1為本發(fā)明定量檢測(cè)saa、crp、pct的免疫熒光層析試劑盒的試紙條結(jié)構(gòu)示意圖圖；圖中，1-吸收墊；2-控制線；3-saa包被線；4-crp包被線；5-pct包被線；6-樣品墊。

圖2為設(shè)置有本發(fā)明定量檢測(cè)saa、crp、pct的免疫熒光層析試劑盒的試紙條的試劑卡結(jié)構(gòu)示意圖；圖中，1-觀察槽；2-控制線；3-saa包被線；4-crp包被線；5-pct包被線；6-加樣槽。

圖3為實(shí)施例1所制得的試劑盒測(cè)試結(jié)果與西門子saa的相關(guān)線性圖。

圖4為實(shí)施例1所制得的試劑盒測(cè)試結(jié)果與西門子crp的相關(guān)線性圖。

圖5為實(shí)施例1所制得的試劑盒測(cè)試結(jié)果與梅里埃pct的相關(guān)線性圖。

圖6為實(shí)施例1所制得的試劑盒與實(shí)施例2所制得的試劑盒saa測(cè)試結(jié)果的相關(guān)線性圖。

圖7為實(shí)施例1所制得的試劑盒與實(shí)施例2所制得的試劑盒crp測(cè)試結(jié)果的相關(guān)線性圖。

圖8為實(shí)施例1所制得的試劑盒與實(shí)施例2所制得的試劑盒pct測(cè)試結(jié)果的相關(guān)線性圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)的闡述。

本發(fā)明提供一種定量檢測(cè)saa、crp、pct的免疫熒光層析試劑盒，包括熒光免疫層析試紙條、熒光物質(zhì)，所述熒光免疫層析試紙條，底襯上設(shè)有硝酸纖維素膜，硝酸纖維素膜的一端銜接有樣品墊，硝酸纖維素膜的另一端銜接有吸收墊；所述硝酸纖維素膜上平行設(shè)有包被了羊抗兔igg多克隆抗體的質(zhì)控線、包被了saa單克隆抗體的檢測(cè)線、包被了crp單克隆抗體的檢測(cè)線和包被了pct單克隆抗體的檢測(cè)線；所述熒光微球應(yīng)用溶液包括偶聯(lián)了兔igg多克隆抗體的熒光物質(zhì)、偶聯(lián)了配對(duì)saa單克隆抗體的熒光物質(zhì)、偶聯(lián)了配對(duì)crp單克隆抗體的熒光物質(zhì)和偶聯(lián)了配對(duì)pct單克隆抗體的熒光物質(zhì)。

進(jìn)一步的，上述的定量檢測(cè)saa、crp、pct的免疫熒光層析試劑盒，是基于側(cè)向流層析及雙抗體夾心法檢測(cè)的免疫反應(yīng)。

進(jìn)一步的，上述的定量檢測(cè)saa、crp、pct的免疫熒光層析試劑盒，所述的熒光物質(zhì)為普通熒光微球、時(shí)間分辨熒光微球、量子點(diǎn)等標(biāo)記物。

進(jìn)一步的，上述的定量檢測(cè)saa、crp、pct的免疫熒光層析試劑盒，所述硝酸纖維素膜的爬速為95s～180s/4cm。

進(jìn)一步的，上述的定量檢測(cè)saa、crp、pct的免疫熒光層析試劑盒，所述樣品墊為全血過濾膜、聚酯膜、玻璃纖維中的一種。

進(jìn)一步的，上述的定量檢測(cè)saa、crp、pct的免疫熒光層析試劑盒，配合使用內(nèi)置了saa、crp和pct反應(yīng)曲線的熒光儀來完成saa、crp、pct的定量檢測(cè)。

進(jìn)一步的，上述的定量檢測(cè)saa、crp、pct的免疫熒光層析試劑盒，所述熒光物質(zhì)為熒光物質(zhì)應(yīng)用溶液或者為固相結(jié)合到所述樣品墊上的熒光物質(zhì)。

進(jìn)一步的，本發(fā)明還提供一種上述定量檢測(cè)saa、crp、pct的免疫熒光層析試劑盒的制備方法，包括以下步驟：

1)熒光免疫層析試紙條的制備：在試紙底襯上粘貼硝酸纖維素膜，在硝酸纖維素膜一端貼上吸收墊，在另一端貼上樣品墊，在硝酸纖維素膜的靠近吸收墊的一端依次劃上羊抗兔igg多克隆抗體質(zhì)控線、saa單克隆抗體檢測(cè)線、crp單克隆抗體檢測(cè)線和pct單克隆抗體檢測(cè)線，制備成試紙板，然后用切條機(jī)將試紙板縱向切成4mm寬的試紙條；

2)熒光物質(zhì)應(yīng)用溶液的制備：分別將兔igg多克隆抗體、配對(duì)saa單克隆抗體的熒光物質(zhì)、配對(duì)crp單克隆抗體和配對(duì)pct單克隆抗體偶聯(lián)熒光物質(zhì)得到抗體修飾的熒光物質(zhì)，再將上述抗體修飾的熒光物質(zhì)一起稀釋至穩(wěn)定緩沖液中得到熒光物質(zhì)應(yīng)用溶液。

進(jìn)一步的，本發(fā)明提供另一種定量檢測(cè)saa、crp、pct的免疫熒光層析試劑盒的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：

1)固相結(jié)合熒光物質(zhì)的樣品墊的制備：分別將兔igg多克隆抗體、配對(duì)saa單克隆抗體的熒光物質(zhì)、配對(duì)crp單克隆抗體和配對(duì)pct單克隆抗體偶聯(lián)熒光物質(zhì)得到抗體修飾的熒光物質(zhì)，再將上述抗體修飾的熒光物質(zhì)一起固相結(jié)合至樣品墊中得到熒光物質(zhì)樣品墊。

2)熒光免疫層析試紙條的制備：在試紙底襯上粘貼硝酸纖維素膜，在硝酸纖維素膜一端貼上吸收墊，在硝酸纖維素膜的靠近吸收墊的一端依次劃上包被了羊抗兔igg多克隆抗體的質(zhì)控線、包被了saa單克隆抗體的檢測(cè)線、包被了crp單克隆抗體的檢測(cè)線和包被了pct單克隆抗體的檢測(cè)線，制備成試紙半成品板，然后組合上固相結(jié)合熒光物質(zhì)的樣品墊，最后用切條機(jī)將試紙板縱向切成4mm寬的試紙條。

以下實(shí)施例中所使用的原料如無特別說明，均來自于市售。所涉及的％均為重量百分?jǐn)?shù)。

實(shí)施例1

本實(shí)施例提供定量檢測(cè)saa、crp、pct的免疫熒光層析試劑盒及其制備方法。

該實(shí)施例中，所述熒光物質(zhì)為激發(fā)波長(zhǎng)360nm、發(fā)射波長(zhǎng)為615nm的時(shí)間分辨熒光微球，系包裹了稀土銪元素的熒光染料聚苯乙烯微球。

該實(shí)施例的定量檢測(cè)saa、crp、pct的免疫熒光層析試劑盒的制備方法包括以下步驟：

(1)時(shí)間分辨熒光微球的活化：先取1ml熒光微球加入4ml0.05mol/l、ph6.0mes溶液，用超聲波進(jìn)行超聲分散，；稱取5mg的n-羥基琥珀酰亞胺(nhs)加入到微球懸浮液中，然后搖勻使之溶解；接著稱取5mg的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(edc)加入到微球懸浮液中，混勻后室溫?cái)嚢璺磻?yīng)1小時(shí)；將反應(yīng)后的懸浮液用超聲波超聲，將混勻的微球離心處理，離心條件12000r/min,離心20min，倒掉上清液，加入0.8ml0.05mol/l、ph7.4的pb緩沖液，然后用超聲波超聲分散均勻，接著定容到1ml。

(2)活化的時(shí)間分辨熒光微球偶聯(lián)抗體：取1ml活化后的微球懸浮液，超聲分散均勻，然后邊攪拌邊滴加入兔igg多克隆抗體(購自arista公司)，優(yōu)選的抗體量為0.1～0.3mg，在2-8℃條件下，攪拌反應(yīng)過夜；加10％的bsa(終濃度在1％)進(jìn)行封閉，混勻后室溫?cái)嚢璺磻?yīng)2小時(shí)，離心洗滌2次，倒掉上清液，沉淀用0.8ml0.05mol/l、ph7.4的pbst溶解，并用超聲波超聲分散均勻，接著定容到1ml，4℃保存，備用。

以上述同樣方式將活化的時(shí)間分辨熒光微球分別偶聯(lián)至saa單克隆抗體(購自arista公司)、crp單克隆抗體(購自medix公司)和pct單克隆抗體(購自medix公司)，4℃保存，備用。

(3)熒光微球應(yīng)用溶液的配制：將偶聯(lián)了兔igg多克隆抗體的時(shí)間分辨熒光微球、偶聯(lián)了配對(duì)saa單克隆抗體的時(shí)間分辨熒光微球、偶聯(lián)了配對(duì)crp單克隆抗體的時(shí)間分辨熒光微球、偶聯(lián)了配對(duì)pct單克隆抗體的時(shí)間分辨熒光微球稀釋至穩(wěn)定緩沖液(包含3％酪蛋白、5％海藻糖、0.5％吐溫-20、3％bsa、0.1％nan3、0.3％pva，余量為0.05mol/l、ph7.4的mes緩沖液)中，4℃保存，備用。

(4)硝酸纖維素膜的制備：用包被緩沖液(包含3％甲醇、2％海藻糖，余量為0.01mol/l、ph7.4的pbs緩沖液)稀釋羊抗兔igg多克隆抗體至0.5mg/ml，稀釋saa單克隆抗體至1mg/ml，稀釋crp單克隆抗體至0.5mg/ml，稀釋pct單克隆抗體至0.8mg/ml；然后以劃線用量1μl/cm在爬速為95s/4cm的硝酸纖維素膜上依次劃上羊抗兔igg多克隆抗體質(zhì)控線、saa單克隆抗體檢測(cè)線、crp單克隆抗體檢測(cè)線和pct單克隆抗體檢測(cè)線。

包被了羊抗兔igg多克隆抗體的質(zhì)控線、包被了saa單克隆抗體的檢測(cè)線、包被了crp單克隆抗體的檢測(cè)線和包被了pct單克隆抗體的檢測(cè)線相互間間隔3mm。

將包被好的硝酸纖維素膜放置于37℃真空干燥箱干燥0.5小時(shí)以上，密封室溫保存，備用。

(5)試紙條的制備：在試紙底襯上粘貼硝酸纖維素膜，在硝酸纖維素膜的靠近包被了pct單克隆抗體檢測(cè)線的一端粘貼樣品墊，在硝酸纖維素膜靠近包被了羊抗兔igg多克隆抗體質(zhì)控線的另一端粘貼吸收墊，制備成試紙板。用切條機(jī)將試紙板縱向切成4mm寬的試紙條。

實(shí)施例2

本實(shí)施例提供定量檢測(cè)saa、crp、pct的免疫熒光層析試劑盒及其制備方法。

該實(shí)施例的試紙條結(jié)構(gòu)與實(shí)施例1的結(jié)構(gòu)相同，不同之處在于，實(shí)施例2中的熒光物質(zhì)為激發(fā)波長(zhǎng)470nm～490mm、發(fā)射波長(zhǎng)為525～560nm的熒光微球，為包裹了熒光染料的聚苯乙烯微球。

該實(shí)施例的定量檢測(cè)saa、crp、pct的免疫熒光層析試劑盒的制備方法包括以下步驟：

(1)熒光微球的活化：先取1ml熒光微球用超聲波進(jìn)行超聲分散，超聲波100w處理時(shí)間30s；加入1ml0.8ml0.1mol/l、ph4.7的mes混勻后離心處理，離心條件12000r/min,離心20min，倒掉上清液，加入1ml0.1mol/l、ph4.7的mes緩沖液。稱取3mg的n-羥基琥珀酰亞胺(nhs)加入到微球懸浮液中，然后搖勻使之溶解；接著稱取5mg的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(edc)加入到微球懸浮液中，混勻后室溫?cái)嚢璺磻?yīng)1小時(shí)；將反應(yīng)后的懸浮液用超聲波超聲，將混勻的微球離心處理，離心條件12000r/min,離心20min，倒掉上清液，加入0.8ml0.05mol/l、ph7.4的bbs緩沖液，然后用超聲波超聲分散均勻，接著定容到1ml。

(2)活化的熒光微球偶聯(lián)抗體：取1ml活化后的微球懸浮液，超聲分散均勻，然后邊攪拌邊滴加入兔igg多克隆抗體(購自arista公司)，優(yōu)選的抗體量為0.1～0.3mg，在2-8℃條件下，攪拌反應(yīng)過夜；加10％的bsa(終濃度在1％)進(jìn)行封閉，混勻后室溫?cái)嚢璺磻?yīng)2小時(shí)，離心洗滌2次，倒掉上清液，沉淀用0.8ml0.05mol/l、ph7.4的tris-hcl溶解，并用超聲波超聲分散均勻，接著定容到1ml，4℃保存，備用。

以上述同樣方式將活化的時(shí)間分辨熒光微球分別偶聯(lián)至saa單克隆抗體(購自arista公司)、crp單克隆抗體(購自medix公司)和pct單克隆抗體(購自medix公司)，4℃保存，備用。

(3)熒光微球應(yīng)用溶液的配制：同實(shí)施例1。

(4)硝酸纖維素膜的制備：同實(shí)施例1。

(5)試紙條的制備：同實(shí)施例1。

實(shí)施例3

本實(shí)施例提供定量檢測(cè)saa、crp、pct的免疫熒光層析試劑盒及其制備方法。

該實(shí)施例的試紙條結(jié)構(gòu)與實(shí)施例1的結(jié)構(gòu)相同，不同之處在于，實(shí)施例3中的硝酸纖維素膜2為爬速為135s/4cm的為硝酸纖維素膜。

(1)熒光微球的活化：同實(shí)施例1。

(2)活化的熒光微球偶聯(lián)抗體：同實(shí)施例1。

(3)熒光微球應(yīng)用溶液的配制：同實(shí)施例1。

(4)硝酸纖維素膜的制備：用包被緩沖液(包含3％甲醇、2％海藻糖，余量為0.01mol/l、ph7.4的pbs緩沖液)稀釋羊抗兔igg多克隆抗體至0.3mg/ml，稀釋saa單克隆抗體至0.8mg/ml，稀釋crp單克隆抗體至0.3mg/ml，稀釋pct單克隆抗體至0.6mg/ml；然后以劃線用量1μl/cm在爬速為135s/4cm的硝酸纖維素膜上依次劃上羊抗兔igg多克隆抗體質(zhì)控線、saa單克隆抗體檢測(cè)線、crp單克隆抗體檢測(cè)線和pct單克隆抗體檢測(cè)線。

(6)試紙條的制備：同實(shí)施例1。

實(shí)施例4

本實(shí)施例提供定量檢測(cè)saa、crp、pct的免疫熒光層析試劑盒及其制備方法。

該實(shí)施例的試紙條結(jié)構(gòu)與實(shí)施例1的結(jié)構(gòu)相同，不同之處在于，實(shí)施例3中的硝酸纖維素膜2為爬速為180s/4cm的硝酸纖維素膜。

(1)熒光微球的活化：同實(shí)施例1。

(2)活化的熒光微球偶聯(lián)抗體：同實(shí)施例1。

(3)熒光微球應(yīng)用溶液的配制：同實(shí)施例1。

(4)硝酸纖維素膜的制備：用包被緩沖液(包含3％甲醇、2％海藻糖，余量為0.01mol/l、ph7.4的pbs緩沖液)稀釋羊抗兔igg多克隆抗體至0.25mg/ml，稀釋saa單克隆抗體至0.7mg/ml，稀釋crp單克隆抗體至0.25mg/ml，稀釋pct單克隆抗體至0.5mg/ml；然后以劃線用量1.2μl/cm在爬速為180s/4cm的硝酸纖維素膜上依次劃上羊抗兔igg多克隆抗體質(zhì)控線、saa單克隆抗體檢測(cè)線、crp單克隆抗體檢測(cè)線和pct單克隆抗體檢測(cè)線。

(7)試紙條的制備：同實(shí)施例1。

實(shí)施例5

本實(shí)施例提供定量檢測(cè)saa、crp、pct的免疫熒光層析試劑盒及其制備方法。

該實(shí)施例中，所述熒光物質(zhì)為激發(fā)波長(zhǎng)360nm、發(fā)射波長(zhǎng)為615nm的時(shí)間分辨熒光微球，系包裹了稀土銪元素的熒光染料聚苯乙烯微球。

該實(shí)施例中，所述熒光物質(zhì)固相結(jié)合到樣品墊上形成固相結(jié)合熒光物質(zhì)的樣品墊上。

該實(shí)施例的定量檢測(cè)saa、crp、pct的免疫熒光層析試劑盒的制備方法包括以下步驟：

(1)時(shí)間分辨熒光微球的活化：同實(shí)施例1。

(2)活化的時(shí)間分辨熒光微球偶聯(lián)抗體：同實(shí)施例1。

(3)固相結(jié)合熒光物質(zhì)的樣品墊的制備：將偶聯(lián)了兔igg多克隆抗體的時(shí)間分辨熒光微球、偶聯(lián)了配對(duì)saa單克隆抗體的時(shí)間分辨熒光微球、偶聯(lián)了配對(duì)crp單克隆抗體的時(shí)間分辨熒光微球、偶聯(lián)了配對(duì)pct單克隆抗體的時(shí)間分辨熒光微球稀釋至穩(wěn)定緩沖液(包含3％酪蛋白、5％海藻糖、0.5％吐溫-20、3％bsa、0.1％nan3、0.3％pva，余量為0.05mol/l、ph7.4的pbs緩沖液)中，將所配制熒光偶合物液均勻的噴涂在樣品墊上(噴液量為50ul/cm2)。將噴好熒光偶合物液的樣品墊置于37℃真空干燥箱干燥1小時(shí)以上，密封室溫保存，備用。

(4)硝酸纖維素膜的制備:同實(shí)施例1。

(5)試紙條的制備：在試紙底襯上粘貼硝酸纖維素膜，在硝酸纖維素膜的靠近包被了pct單克隆抗體檢測(cè)線的一端粘貼固相結(jié)合熒光物質(zhì)的樣品墊，在硝酸纖維素膜靠近包被了羊抗兔igg多克隆抗體質(zhì)控線的另一端粘貼吸收墊，制備成試紙板。用切條機(jī)將試紙板縱向切成4mm寬的試紙條。

實(shí)施例6

本實(shí)施例提供定量檢測(cè)saa、crp、pct的免疫熒光層析試劑盒及其制備方法。

該實(shí)施例中，熒光物質(zhì)為激發(fā)波長(zhǎng)470nm～490mm、發(fā)射波長(zhǎng)為525～560nm的熒光微球，為包裹了熒光染料的聚苯乙烯微球。

該實(shí)施例中，所述熒光物質(zhì)固相結(jié)合到樣品墊上形成固相結(jié)合熒光物質(zhì)的樣品墊上，而不是保存在熒光物質(zhì)應(yīng)用溶液中。

該實(shí)施例的定量檢測(cè)saa、crp、pct的免疫熒光層析試劑盒的制備方法包括以下步驟：

(1)熒光微球的活化：同實(shí)施例2。

(2)活化的熒光微球偶聯(lián)抗體：同實(shí)施例2。

(3)熒光偶合物樣品墊的制備：將偶聯(lián)了兔igg多克隆抗體的熒光微球、偶聯(lián)了配對(duì)saa單克隆抗體的熒光微球、偶聯(lián)了配對(duì)crp單克隆抗體的熒光微球、偶聯(lián)了配對(duì)pct單克隆抗體的熒光微球稀釋至穩(wěn)定緩沖液(包含3％酪蛋白、5％海藻糖、0.5％吐溫-20、3％bsa、0.1％nan3、0.3％pva，余量為0.05mol/l、ph7.4的pbs緩沖液)中，將所配制熒光偶合物液均勻的噴涂在樣品墊上(噴液量為70ul/cm2)。將噴好熒光偶合物液的樣品墊置于37℃真空干燥箱干燥1小時(shí)以上，密封室溫保存，備用。

(4)硝酸纖維素膜的制備:同實(shí)施例1。

(5)試紙條的制備：同實(shí)施例5。

實(shí)施例7

該實(shí)施例中，所述熒光物質(zhì)為激發(fā)波長(zhǎng)360nm、發(fā)射波長(zhǎng)為615nm的時(shí)間分辨熒光微球，系包裹了稀土銪元素的熒光染料聚苯乙烯微球。

該實(shí)施例中，所述樣品墊粘貼靠近硝酸纖維素膜上包被了羊抗兔igg多克隆抗體質(zhì)控線的一端，而吸收墊粘貼靠近硝酸纖維素膜上包被了saa單克隆抗體檢測(cè)線的另一端。

該實(shí)施例的定量檢測(cè)saa、crp、pct的免疫熒光層析試劑盒的制備方法包括以下步驟：

(1)時(shí)間分辨熒光微球的活化：同實(shí)施例1。

(2)活化的時(shí)間分辨熒光微球偶聯(lián)抗體：同實(shí)施例1。

(3)固相結(jié)合熒光物質(zhì)的樣品墊的制備：同實(shí)施例1。

(4)硝酸纖維素膜的制備:用包被緩沖液(包含3％甲醇、2％海藻糖，余量為0.01mol/l、ph7.4的pbs緩沖液)稀釋saa單克隆抗體至1mg/ml，稀釋crp單克隆抗體至0.5mg/ml，稀釋pct單克隆抗體至0.8mg/ml，稀釋羊抗兔igg多克隆抗體至0.4mg/ml；然后以劃線用量1μl/cm在爬速為95s/4cm的硝酸纖維素膜上依次劃上saa單克隆抗體檢測(cè)線、crp單克隆抗體檢測(cè)線、pct單克隆抗體檢測(cè)線和羊抗兔igg多克隆抗體質(zhì)控線。

包被了包被了saa單克隆抗體的檢測(cè)線、包被了crp單克隆抗體的檢測(cè)線、包被了pct單克隆抗體的檢測(cè)線和羊抗兔igg多克隆抗體的質(zhì)控線相互間間隔3mm。

將包被好的硝酸纖維素膜放置于37℃真空干燥箱干燥0.5小時(shí)以上，密封室溫保存，備用。

(5)試紙條的制備：在試紙底襯上粘貼硝酸纖維素膜，在硝酸纖維素膜的靠近包被了羊抗兔igg多克隆抗體質(zhì)控線的一端粘貼樣品墊，在硝酸纖維素膜靠近包被了saa單克隆抗體檢測(cè)線的另一端粘貼吸收墊，制備成試紙板。用切條機(jī)將試紙板縱向切成4mm寬的試紙條。

實(shí)施例8

該實(shí)施例中，所述熒光物質(zhì)為量子點(diǎn)，系發(fā)射波長(zhǎng)為360nm-1300nm的量子點(diǎn)，或包埋了所述量子點(diǎn)的sio2微球。

(1)量子點(diǎn)標(biāo)記：

a)取不同波長(zhǎng)量子點(diǎn)分別用磷酸緩沖液(pbs)調(diào)ph＝5-9，加入edc(l-(3-二甲基氨丙基)-3-乙基碳二胺鹽酸鹽)和nhs(n-羥基硫代琥珀酸亞胺)室溫活化15-60分鐘。

b)分別對(duì)應(yīng)加入saa/pct/crp的相應(yīng)抗體，旋渦振蕩反應(yīng)30分鐘-2小時(shí)。

c)分別對(duì)應(yīng)加入bsa封閉反應(yīng)30分鐘-2小時(shí)。

d)離心純化產(chǎn)物，取沉淀用pbs緩沖液重懸分散，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

(2)制備試劑條組分：

a)樣品墊制備:選用玻璃纖維素膜，將該膜放入含有0.1％-10％bsa和0.01％-10％tween20的pbs中浸泡，取出，干燥備用。

b)結(jié)合物墊制備：選用玻璃纖維膜切成一定規(guī)格膜塊，加入用不同波長(zhǎng)量子點(diǎn)對(duì)應(yīng)標(biāo)記的各抗體的混合物溶液于該膜塊上，干燥膜塊備用。

c)硝酸纖維素膜制備：用包被緩沖液(包含3％甲醇、2％海藻糖，余量為0.01mol/l、ph7.4的pbs緩沖液)稀釋saa單克隆抗體至1mg/ml，稀釋crp單克隆抗體至0.5mg/ml，稀釋pct單克隆抗體至0.8mg/ml，稀釋羊抗兔igg多克隆抗體至0.4mg/ml；然后以劃線用量1μl/cm在爬速為95s/4cm的硝酸纖維素膜上依次劃上saa單克隆抗體檢測(cè)線、crp單克隆抗體檢測(cè)線、pct單克隆抗體檢測(cè)線和羊抗兔igg多克隆抗體質(zhì)控線。

包被了包被了saa單克隆抗體的檢測(cè)線、包被了crp單克隆抗體的檢測(cè)線、包被了pct單克隆抗體的檢測(cè)線和羊抗兔igg多克隆抗體的質(zhì)控線相互間間隔3mm。

將包被好的硝酸纖維素膜放置于37℃真空干燥箱干燥0.5小時(shí)以上，密封室溫保存，備用。

(3)試劑條的制備：在試紙底襯上粘貼硝酸纖維素膜，在硝酸纖維素膜的靠近包被了羊抗兔igg多克隆抗體質(zhì)控線的一端粘貼樣品墊，在硝酸纖維素膜靠近包被了saa單克隆抗體檢測(cè)線的另一端粘貼吸收墊，制備成試紙板。用切條機(jī)將試紙板縱向切成4mm寬的試紙條。

檢測(cè)試驗(yàn)例1

將實(shí)施例1所制得的定量檢測(cè)saa、crp、pct的免疫熒光層析試劑盒進(jìn)行測(cè)試效果檢測(cè)。

試驗(yàn)中設(shè)有用來檢測(cè)實(shí)施例1所制得的定量檢測(cè)saa、crp、pct的免疫熒光層析試劑盒的熒光定量分析儀。

對(duì)saa進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，采用德國西門子公司的bnprospec特定蛋白分析儀及配套nlatexsaa試劑盒做檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)；對(duì)crp進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，采用對(duì)德國西門子公司的bnⅱ全自動(dòng)特定蛋白分析儀及配套試劑做檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)；pct進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，采用梅里埃公司的vidas儀器及配套試劑做檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)。表1為采用實(shí)施例1所制得的試劑盒對(duì)部分樣品進(jìn)行定量測(cè)定的結(jié)果。圖3、圖4和圖5分別為實(shí)施例1所制得的試劑盒與西門子saa、西門子crp和梅里埃pct分別檢測(cè)30份標(biāo)本的相關(guān)線性。

西門子和梅里埃的儀器和配套試劑均是知名試劑盒，其檢測(cè)精度和結(jié)果公認(rèn)可靠，由表1可看出實(shí)施例1所制得的試劑盒能得出與檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)相當(dāng)?shù)慕Y(jié)果，可以進(jìn)行定量測(cè)定。

進(jìn)一步的由圖3、圖4和圖5分別得出實(shí)施例1所制得的試劑盒與西門子saa線性相關(guān)系數(shù)為r²＝0.98，實(shí)施例1所制得的試劑盒與西門子crp線性相關(guān)系數(shù)為r²＝0.99，實(shí)施例1所制得的試劑盒與梅里埃pct線性相關(guān)系數(shù)r²＝0.98，相關(guān)性良好，可以用于臨床診斷。

表1采用實(shí)施例1所制得的試劑盒對(duì)部分樣品進(jìn)行定量測(cè)定結(jié)果

檢測(cè)試驗(yàn)例2

將實(shí)施例1及實(shí)施例2所制得的定量檢測(cè)saa、crp、pct的免疫熒光層析試劑盒進(jìn)行測(cè)試比較。

比較激發(fā)波長(zhǎng)360nm、發(fā)射波長(zhǎng)為615nm的時(shí)間分辨熒光微球和激發(fā)波長(zhǎng)470nm～490mm、發(fā)射波長(zhǎng)為525～560nm的普通熒光微球這2種熒光標(biāo)記微球?qū)Y(jié)果的影響，圖6、圖7和圖8分別得出實(shí)施例1所制得的試劑盒與實(shí)施例2所制得的試劑盒saa線性相關(guān)系數(shù)為r²＝0.98，crp線性相關(guān)系數(shù)為r²＝0.98，pct線性相關(guān)系數(shù)為r²＝0.97，相關(guān)性良好。

檢測(cè)試驗(yàn)例3

將實(shí)施例1、實(shí)施例3、實(shí)施例4所制得的定量檢測(cè)saa、crp、pct的免疫熒光層析試劑盒進(jìn)行測(cè)試比較。

比較爬速為95s/4cm的硝酸纖維素膜、爬速為135s/4cm的硝酸纖維素膜、爬速為180s/4cm的硝酸纖維素膜這3種硝酸纖維素膜對(duì)結(jié)果的影響，優(yōu)選的爬速為95s/4cm的硝酸纖維素膜。

本發(fā)明試劑盒以熒光物質(zhì)，如熒光微球、時(shí)間分辨熒光微球、量子點(diǎn)等為標(biāo)記物，以側(cè)向流層析及雙抗體夾心法為技術(shù)原理，配合使用熒光免疫分析儀，實(shí)現(xiàn)快速同時(shí)檢測(cè)saa/pct/crp的含量。標(biāo)記抗體與樣本中的抗原相結(jié)合然后再與檢測(cè)卡上面的抗體相互作用，最后通過熒光分析儀將熒光微球的不同光信號(hào)轉(zhuǎn)化為電信號(hào)得到不同的樣本檢測(cè)濃度。本發(fā)明試劑盒檢測(cè)范圍：crp:0.2～200mg/l，pct:0.1～100ug/l，saa:0.5～200mg/l。

以上所述實(shí)施例僅表達(dá)了本發(fā)明的幾種實(shí)施方式，其描述較為具體和詳細(xì)，但并不能因此而理解為對(duì)本發(fā)明專利范圍的限制。應(yīng)當(dāng)指出的是，對(duì)于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干變形和改進(jìn)，這些都屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。因此，本發(fā)明專利的保護(hù)范圍應(yīng)以所附權(quán)利要求為準(zhǔn)。