本發(fā)明涉及藥物分析技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種蘇拉明鈉的高效液相檢測方法。

背景技術(shù)：

蘇拉明鈉(suramin)，又名舒拉明鈉、蘇拉明等，是德國bayerag公司于1961年合成的一種抗錐蟲類化合物，白色至淺黃色粉末，主要用于治療非洲錐蟲病和盤尾絲蟲病。20世紀80年代，有學者發(fā)現(xiàn)蘇拉明鈉能夠抑制腫瘤病毒有關(guān)的逆轉(zhuǎn)錄酶活性，將蘇拉明鈉應用于獲得性免疫缺陷綜合癥(aids)的治療，表明蘇拉明鈉對人類免疫缺陷病毒(hiv)有一定的抑制作用。使用蘇拉明鈉治療aids患者時發(fā)現(xiàn)患者同時患有的卡西肉瘤和非何杰金淋巴瘤完全消退，結(jié)合體外實驗發(fā)現(xiàn)蘇拉明鈉能夠阻斷某些與腫瘤生長密切相關(guān)的生長因子和酶的活性，可以將蘇拉明鈉作為一種抗腫瘤藥物廣泛應用于各種惡性腫瘤的治療，如前列腺癌，肺癌，結(jié)腸癌，子宮肌瘤等。近年來，蘇拉明鈉在防治眼部增殖性疾病的研究中也取得了較大的進展。最近，又有蘇拉明鈉治療肝纖維化的報道。

但是蘇拉明鈉暫時沒有發(fā)展到臨床使用水平，原因在于蘇拉明鈉的物理特性使其在體內(nèi)分布不良，產(chǎn)生藥物動力學和毒性相關(guān)的難題，從而需要降低劑量以限制毒性進一步提高患者的耐受性，使靶向投藥達到最大，這必然要求蘇拉明鈉的定量檢測線相對較低。

目前還沒有檢測蘇拉明鈉的高效液相方法的報道。根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)中類似化合物的高效液相檢測方法進行檢測，發(fā)現(xiàn)對蘇拉明鈉的分離效果較差，分離度r小于1，無法有效檢出個別工藝雜質(zhì)峰或有關(guān)物質(zhì)峰，洗脫時基線易發(fā)生漂移，積分不準確，其用于定量分析時的精確度和準確度不高，且檢測耗時長需15min以上。本發(fā)明針對現(xiàn)有技術(shù)中的檢測方法進行了改進與優(yōu)化，與現(xiàn)有技術(shù)中的方法相比，本發(fā)明的檢測方法不僅分離效果好，精密度和準確度高，而且操作安全簡易，處理方便快捷，適合高通量篩選及精準定量。該方法對蘇拉明鈉的原料、制劑質(zhì)量研究以及相關(guān)藥動學定量研究等方面均具有重要研究價值。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是，提供一種檢測時間短、分離效果好、精確度和準確度更高的蘇拉明鈉的高效液相檢測方法。

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供的蘇拉明鈉的高效液相檢測方法，其中，

色譜柱采用反相c18色譜柱；

檢測器采用dad檢測器；

流動相包括流動相a和流動相b；流動相a為0.0005～0.0015％氨水、1～3mm醋酸銨和0.15～0.20mm二丁銨乙酸鹽(dbaa)的水溶液；流動相b為1.5～4.5mm醋酸銨和5～15mmn,n-二甲基己銨(dmha)的50％乙腈/水混合溶液；

采用梯度洗脫，梯度洗脫程序按以下程序進行：流動相a+流動相b＝100％，0～0.01min，流動相b保持體積百分比為20％；0.01～2.10min，流動相b體積百分比由20％遞增至80％；2.10～2.11min，流動相b體積百分數(shù)由80％遞減至20％；2.11～3.00min，流動相b保持體積百分數(shù)為20％。

在一個優(yōu)選的實施例中，流動相a為0.001％氨水、2mm醋酸銨和0.18mm二丁銨乙酸鹽(dbaa)的水溶液；流動相b為3mm醋酸銨和10mmn,n-二甲基己銨(dmha)的50％乙腈/水混合溶液；

在一個優(yōu)選的實施例中，色譜柱柱長為100mm。

在一個優(yōu)選的實施例中，流速為1.0～2.0ml/min，更優(yōu)選為1.4ml/min。

在一個優(yōu)選的實施例中，檢測波長為250～255nm，更優(yōu)選為254nm。

在一個優(yōu)選的實施例中，柱溫控制在35～40℃，更優(yōu)選為40℃。

在一個優(yōu)選的實施例中，進樣量為2～8μl，更優(yōu)選為3～5μl。

本發(fā)明還提供一種測定蘇拉明鈉含量的高效液相方法，包括以下步驟：

(1)對照品溶液及供試品溶液的制備：精密稱取適量蘇拉明鈉對照品，用注射用水溶解，稀釋定容成具有一定濃度梯度的多個對照品溶液；精密稱取適量蘇拉明鈉供試品，用注射用水溶解并定容得到供試品溶液；

(2)色譜條件：

色譜柱采用反相c18色譜柱；

檢測器采用dad檢測器；

流動相包括流動相a和流動相b；流動相a為0.0005～0.0015％氨水、1～3mm醋酸銨和0.15～0.20mm二丁銨乙酸鹽(dbaa)的水溶液；流動相b為1.5～4.5mm醋酸銨和5～15mmdmha的50％乙腈/水混合溶液；

采用梯度洗脫，梯度洗脫程序按以下程序進行：流動相a+流動相b＝100％，0～0.01min，流動相b保持體積百分比為20％；0.01～2.10min，流動相b體積百分比由20％遞增至80％；2.10～2.11min，流動相b體積百分數(shù)由80％遞減至20％；2.11～3.00min，流動相b保持體積百分數(shù)為20％；

(3)測定方法：

將所述多個對照品溶液以及供試品溶液按所述(2)色譜條件依次進樣，記錄色譜圖，根據(jù)多個對照品溶液的圖譜數(shù)據(jù)和濃度數(shù)據(jù)制備線性相關(guān)工作曲線，代入供試樣品的圖譜數(shù)據(jù)計算并得出供試品溶液濃度，完成了蘇拉明鈉含量的測定。

在一個優(yōu)選的實施例中，對照品溶液的濃度依次為6.25、12.5、25、50、100、200μg/ml，流速為1.4ml/min。檢測波長為254nm，柱溫為40℃，進樣量為3～5μl。

本發(fā)明提供的蘇拉明鈉的高效液相檢測方法的有益效果在于：

1.本發(fā)明的方法能夠有效檢出蘇拉明鈉及其有關(guān)物質(zhì)，并且分離度r能達1.5以上，分離效果好。

2.本發(fā)明的方法檢測時間短，只需3min即可完成高效液相檢測過程，大大提高了檢測效率，適合高通量篩選。

3.本發(fā)明的方法測定hplc圖譜基線平穩(wěn)，不發(fā)生漂移。

4.本發(fā)明的方法能節(jié)省溶劑，降低成本，操作安全簡易，處理方便快捷。

5.本發(fā)明的方法用于蘇拉明鈉的含量測定，具有良好的線性關(guān)系，重現(xiàn)性高，精確度和準確度高，在原料藥、制劑質(zhì)量研究以及相關(guān)藥動學定量研究等方面具有重要研究價值。

附圖說明

圖1為采用本發(fā)明的方法測定蘇拉明鈉供試品的hplc圖譜一。

圖2為采用本發(fā)明的方法測定蘇拉明鈉供試品的hplc圖譜二。

圖3為采用本發(fā)明的方法測定蘇拉明鈉供試品的hplc圖譜三。

圖4為采用本發(fā)明的方法繪制的蘇拉明鈉工作曲線。

具體實施方式

本申請的發(fā)明人經(jīng)過廣泛的研究和大量的實驗，摸索得到了一種蘇拉明鈉的高效液相檢測方法，該方法提供了能夠有效分離蘇拉明鈉及其有關(guān)物質(zhì)的流動相體系及梯度洗脫程序，可以將現(xiàn)有技術(shù)中難以有效分離的蘇拉明鈉及其有關(guān)物質(zhì)實現(xiàn)很好的分離效果，分離度r可達1.5以上。

發(fā)明人采用的蘇拉明鈉的高效液相檢測方法，其色譜條件如下：

色譜柱采用反相c18色譜柱，比如以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑的watersxbridge色譜柱；

檢測器采用dad檢測器；

流動相包括流動相a和流動相b；流動相a為0.0005～0.0015％氨水、1～3mm醋酸銨和0.15～0.20mm二丁銨乙酸鹽(dbaa)的水溶液；流動相b為1～4.5mm醋酸銨和5～15mmdmha的50％乙腈/水混合溶液；

采用梯度洗脫，流動相a+流動相b＝100％，梯度洗脫程序按以下程序進行：0～0.01min，流動相b保持體積百分比為20％；0.01～2.10min，流動相b體積百分比由20％遞增至80％；2.10～2.11min，流動相b體積百分數(shù)由80％遞減至20％；2.11～3.00min，流動相b保持體積百分數(shù)為20％；

本發(fā)明的一個優(yōu)選的實施例中，流動相a為0.001％氨水、2mm醋酸銨和0.18mm二丁銨乙酸鹽(dbaa)的水溶液；流動相b為3mm醋酸銨和10mmn,n-二甲基己銨(dmha)的50％乙腈/水混合溶液。

本發(fā)明的一個優(yōu)選的實施例中，色譜柱柱長為100mm。

本發(fā)明的一個優(yōu)選的實施例中，流速為1.0～2.0ml/min，更優(yōu)選為1.4ml/min。

本發(fā)明的一個優(yōu)選的實施例中，檢測波長為250～255nm，更優(yōu)選為254nm。

本發(fā)明的一個優(yōu)選的實施例中，柱溫控制在35～40℃，更優(yōu)選為40℃。

本發(fā)明的一個優(yōu)選的實施例中，進樣量為2～8μl，更優(yōu)選為3～5μl。

下面將結(jié)合具體實施例對本發(fā)明的技術(shù)方案進行清楚、完整的描述，顯然，所描述的實施例是本發(fā)明的一部分實施例，而不是全部的實施例。基于本發(fā)明中的實施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有做出創(chuàng)造性勞動的前提下所獲得的所有其他實施例，都屬于本發(fā)明保護的范圍。

本發(fā)明實施例中的實驗條件如下：

儀器：高效液相色譜儀(lc-20a)

色譜柱：watersxbridgec18色譜柱，柱長為100mm；

供試品溶液：精密稱取蘇拉明鈉供試品10mg，置于10ml容量瓶，用注射用水溶解并定容，得到供試品溶液；

流速：1.4ml/min；

檢測波長：254nm；

柱溫：40℃；

流動相：流動相a+流動相b＝100％；

梯度洗脫：0～0.01min，流動相b保持體積百分比為20％；0.01～2.10min，流動相b體積百分比由20％遞增至80％；2.10～2.11min，流動相b體積百分數(shù)由80％遞減至20％；2.11～3.00min，流動相b保持體積百分數(shù)為20％；

實施例1

流動相a為0.001％氨水、2mm醋酸銨和0.18mm二丁銨乙酸鹽(dbaa)的水溶液；流動相b為3mm醋酸銨和10mmn,n-二甲基己銨(dmha)的50％乙腈/水混合溶液。

按此方法下經(jīng)過三次進樣，hplc圖譜如圖1-3所示，基線平穩(wěn)，重復性好，3min能夠全部出峰，蘇拉明鈉保留時間為1.953～1.959min，理論塔板數(shù)為9219。

實施例2

流動相a為0.0005％氨水、1mm醋酸銨和0.15mm二丁銨乙酸鹽(dbaa)的水溶液；流動相b為1.5mm醋酸銨和5mmn,n-二甲基己銨(dmha)的50％乙腈/水混合溶液。

此方法下基線平穩(wěn)，蘇拉明鈉保留時間為2.1min左右，且分離度為1.6。

實施例3

流動相a為0.0015％氨水、3mm醋酸銨和0.20mm二丁銨乙酸鹽(dbaa)的水溶液；流動相b為4.5mm醋酸銨和15mmn,n-二甲基己銨(dmha)的50％乙腈/水混合溶液。

此方法下基線平穩(wěn)，蘇拉明鈉保留時間為1.8min左右，且分離度為1.5。

實施例4蘇拉明鈉的含量測定

基于上述的檢測方法，發(fā)明人還提供一種測定蘇拉明鈉含量的高效液相方法，按以下步驟進行：

(1)對照品溶液及供試品溶液的制備：精密稱取適量蘇拉明鈉對照品，用注射用水溶解并定容得到1mg/ml的儲備液，準確吸取50μl儲備液，用注射用水依次稀釋定容得到6.25、12.5、25、50、100、200ug/ml的對照品溶液；精密稱取適量蘇拉明鈉供試品，用注射用水溶解并定容得到供試品溶液；

(2)色譜條件：

色譜柱采用反相c18色譜柱；

檢測器采用dad檢測器；

流動相包括流動相a和流動相b；流動相a為0.001％氨水、2mm醋酸銨和0.18mm二丁銨乙酸鹽(dbaa)的水溶液；流動相b為3mm醋酸銨和10mmn,n-二甲基己銨(dmha)的50％乙腈/水混合溶液。

采用梯度洗脫，梯度洗脫程序按以下程序進行0～0.01min，流動相b保持體積百分比為20％；0.01～2.10min，流動相b體積百分比由20％遞增至80％；2.10～2.11min，流動相b體積百分數(shù)由80％遞減至20％；2.11～3.00min，流動相b保持體積百分數(shù)為20％；

(3)測定方法：

將所述6個對照品溶液和供試品溶液按所述色譜條件依次進樣，記錄色譜圖，根據(jù)6個對照品溶液的蘇拉明鈉峰面積和濃度數(shù)據(jù)制備線性相關(guān)工作曲線(如圖4所示)，該工作曲線線性關(guān)系良好，r≥0.9999；代入供試樣品的蘇拉明鈉峰面積計算并得出供試品溶液濃度，比較測定的供試品溶液濃度和定容的供試品溶液濃度以及進樣時的稀釋倍數(shù)，計算得出蘇拉明鈉的含量。

本發(fā)明的蘇拉明鈉的高效液相檢測方法，能夠有效檢出蘇拉明鈉及其有關(guān)物質(zhì)，并且分離度r能達1.5以上，填補了目前蘇拉明鈉含量測試分析方法尚無的空缺；本發(fā)明的檢測方法的hplc譜基線穩(wěn)定，不發(fā)生漂移；本發(fā)明的方法檢測時間短，只需3min即可完成高效液相檢測過程，大大提高了檢測效率，適合高通量篩選；本發(fā)明的方法能節(jié)省溶劑，降低成本，操作安全簡易，處理方便快捷；本發(fā)明的方法用于蘇拉明鈉的含量測定，具有良好的線性關(guān)系，r≥0.9999，重現(xiàn)性高，精確度和準確度高，在原料藥、制劑質(zhì)量研究以及相關(guān)藥動學定量研究等方面具有重要研究價值。

綜上所述，上述各實施例及附圖僅為本發(fā)明的較佳實施例而已，并不用以限定本發(fā)明的保護范圍，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所做的任何修改、等同替換、改進等，皆應包含在本發(fā)明的保護范圍內(nèi)。