本發(fā)明涉及肝素提取領域，具體而言，涉及一種提高肝素鈉提取得率的方法。
背景技術：
：肝素是一種由動物解讀組織的肥大細胞所產(chǎn)生的酸性粘多糖額硫酸酯類物質(zhì)，因其具有強抗凝作用，是放置深層靜脈血栓形成等血酸栓塞性疾病的首選藥物，隨著研究的深入，人們發(fā)現(xiàn)肝素不僅有抗凝、抗血栓形成和調(diào)整血脂的作用，還有抗炎、抗過敏、抗病毒、抗癌等多種生物學功能。雖然將肝素類產(chǎn)品用于臨床已有60余年的歷史，但迄今還沒有一種能夠完全替代它的產(chǎn)品，所以它仍然是最重要的抗凝血和抗血栓的生化藥物，且目前只能從動物的部分組織中提取，仍然不能人工合成。我國是生豬飼養(yǎng)、屠宰和消費大國，更是腸衣加工大國。腸粘膜是提取肝素的最佳原料之一，我國也有大量致力于從腸黏膜中提取肝素產(chǎn)品的廠家。然而，我國現(xiàn)行的肝素提取和純化工藝比較落后，產(chǎn)品雜質(zhì)含量較高。為了滿足醫(yī)學臨床及生化研究，每年要從國外大量進口精品肝素及低分子肝素。最早的肝素提取方法介紹見于howell在美國生理雜志上發(fā)表的文章，肝素提取需要去除雜質(zhì)后再精制，因此在處理原料時要通過酶水解、鹽析等方法去除蛋白質(zhì)，得到肝素粗品。粗品肝素中含有其它黏多糖，也含有一些殘余的蛋白質(zhì)和核酸類物質(zhì)，從而使粗品肝素的效價過低?，F(xiàn)有的工藝中，對酸堿性雜質(zhì)是通過等電點沉淀及熱變性作用、鹽析作用等辦法去除；對低抗凝活性的水溶雜質(zhì)，是通過控制產(chǎn)品溶液濃度特別是酒精沉淀濃度來加以去除；對熱原雜質(zhì)，通過超濾氧化及離子交換方法加以去除。國內(nèi)常用的豬小腸肝素提取方法是鹽析法；60、70年代美國專利技術-氧化法純化技術在國外曾經(jīng)廣泛采用；國內(nèi)90年代以前基本采用組合氧化法純化技術是肝素的主要純化方法，因此對氧化法純化技術研究的比較多。例如，現(xiàn)有技術(cn102746421a)公開了一種粗品肝素鈉提純的方法，主要時對粗品肝素鈉進行溶解、吸附、洗脫、沉淀和干燥處理，最終得到肝素鈉產(chǎn)品。同時，現(xiàn)有技術(cn103588902a)公開了一種采用吸附、醇沉以及兩步氧化法對粗品肝素鈉進行提純的方法。同樣的，現(xiàn)有技術(cn10299336a)公開了一種采用加入硅藻土、聚合氯化鋁后經(jīng)離心除雜，再經(jīng)醇沉、雙氧水氧化、醇沉以及過濾、冷凍干燥后得到肝素鈉產(chǎn)品。然而，這些傳統(tǒng)方法工藝較為復雜，產(chǎn)品的生產(chǎn)周期長，并且在提純過程中需要加入化學試劑，處理成本較高，精制的過程也較為復雜，產(chǎn)品純度也難以保證。近幾年，隨著生物技術的進展，以及新型高分子材料的不斷出現(xiàn)，又有新成果出現(xiàn)。酶解輔助提取肝素，離子交換層析分離肝素技術是現(xiàn)在企業(yè)主要使用的技術。加入蛋白水解酶，可以減少水解時間和減少微生物的污染。但酶解技術受限于溫度、ph的控制，提取肝素后還要滅酶、并將其除去，同時采用離子交換法從酶解液中吸附肝素時，由于吸附不完全，所以會導致殘留液中仍含有較高量的肝素，從而影響肝素得率。進一步的，由于吸附洗脫等條件未得到有效的調(diào)整和優(yōu)化，也進一步影響了肝素的有效分離和獲得，影響了肝素的得率。雖然肝素提取純化技術的研究已有眾多報道，專家們在各種提取、分離純化肝素的技術研究方面也做了大量工作，但綜合而言，提取技術水平較高的仍然是發(fā)達國家，他們不僅開創(chuàng)和掌握了扎實的提取技術，并具有專用的高分子材料和裝備。國內(nèi)目前這方面欠缺的是先進的工藝和配套的裝備。為此，進一步深入探索粗肝素的酶解、提取和分離純化技術，選擇適合我國中小企業(yè)的粗品肝素生產(chǎn)模式及研究適合的技術裝備，將具有重要的實用價值。有鑒于此，特提出本發(fā)明。技術實現(xiàn)要素：本發(fā)明的第一目的在于提供一種提高肝素鈉提取得率的方法，本發(fā)明方法中，通過采用復合酶對原料進行酶解處理，并對吸附后解離條件的調(diào)整和優(yōu)化，從而不僅提高了肝素鈉的提取效率，同時也提高了肝素鈉粗品的得率。本發(fā)明的第二目的在于提供一種肝素鈉的制備方法。為了實現(xiàn)本發(fā)明的上述目的，特采用以下技術方案：一種提高肝素鈉提取得率的方法，所述方法包括如下步驟：將新鮮豬小腸處理后以復合酶進行酶解，所得酶解液濃縮過濾后加入樹脂進行吸附；吸附后的樹脂以濃度為0.3～0.6mol/l的鹽溶液進行洗脫，洗脫液醇沉后，將所得固形物干燥，得到肝素鈉粗品；優(yōu)選的，鹽溶液的濃度為0.4～0.5mol/l?？蛇x的，本發(fā)明中，所述將新鮮豬小腸處理包括如下步驟：將新鮮豬小腸放入刮腸機中，得到豬小腸粘膜，然后將其粉碎，加水攪拌?？蛇x的，本發(fā)明中，所述復合酶包括堿性蛋白酶和胰蛋白酶?？蛇x的，本發(fā)明中，所述復合酶的總量為0.3～0.5g/l?？蛇x的，本發(fā)明中，所述樹脂為大孔樹脂；優(yōu)選的，所述樹脂為d208樹脂?？蛇x的，本發(fā)明中，所述方法還進一步包括在加入樹脂吸附前對體系ph進行調(diào)整的步驟；優(yōu)選的，是將體系ph調(diào)整至7.5～8.5?？蛇x的，本發(fā)明中，所述吸附的溫度為35～55℃；優(yōu)選的，所述吸附的溫度為40～50℃?？蛇x的，本發(fā)明中，所述吸附的時間為3～6h；優(yōu)選的，所述吸附的時間為4～5h?？蛇x的，本發(fā)明中，所述鹽溶液為氯化鈉或氯化鉀溶液；優(yōu)選的，所述鹽溶液為氯化鈉溶液；更優(yōu)選的，所述氯化鈉溶液的濃度為0.3～0.6mol/l。同時，本發(fā)明還提供了一種肝素鈉的制備方法，所述方法包括如下步驟：首先按照本發(fā)明所述方法提取得到肝素鈉粗品，再由肝素鈉粗品精制得到肝素鈉。與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明的有益效果為：(1)本發(fā)明方法中，以復合酶進行酶解，從而能夠有效提高酶解處理的效率，而這也有利于提高肝素鈉粗品的得率；(2)本發(fā)明方法中，通過對吸附以及洗脫等步驟條件的選擇和調(diào)整，從而進一步提高對肝素鈉產(chǎn)品的吸附和洗脫率，從而能夠進一步提高肝素鈉粗品的收率。具體實施方式下面將結(jié)合實施例對本發(fā)明的實施方案進行詳細描述，但是本領域技術人員將會理解，下列實施例僅用于說明本發(fā)明，而不應視為限制本發(fā)明的范圍。實施例中未注明具體條件者，按照常規(guī)條件或制造商建議的條件進行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過市售購買獲得的常規(guī)產(chǎn)品。鑒于目前現(xiàn)有技術中對肝素提取所存在的肝素得率低等問題，本發(fā)明特采用一種復合酶酶解提取-提取液濃縮-過濾-樹脂吸附-洗脫-沉淀-干燥的方法進行肝素提取，通過采用復合酶酶解以及對吸附、洗脫步驟的調(diào)整，從而有效提高了肝素的酶解處理和分離效率，進而提高了肝素粗品的得率，具體的：本發(fā)明中，將原料新鮮豬小腸放入刮腸機中處理后，得到豬小腸粘膜，然后，將豬小腸粘膜粉碎后加水攪拌，得到待處理的混合體系；然后，對混合體系的溫度以及ph進行調(diào)節(jié)，并將體系調(diào)整至適于酶解處理的條件；優(yōu)選的，可以將體系的ph調(diào)節(jié)至8.5～9，溫度調(diào)節(jié)至55～65℃；在調(diào)整完成后，向體系內(nèi)加入復合酶進行酶解；優(yōu)選的，所用到的復合酶為包含堿性蛋白酶和胰蛋白酶的復合酶，更優(yōu)選的，堿性蛋白酶和胰蛋白酶的質(zhì)量比為(2～4)：(1～2)；進一步優(yōu)選的，在加入復合酶后，要使得體系中酶的總濃度能夠達到0.3～0.5g/l；酶解反應的時間優(yōu)選的控制在2～4h，然后，將所得酶解液濃縮，并在濃縮后過濾，然后向濾液中加入大孔樹脂進行吸附，優(yōu)選的，所述大孔樹脂為d208樹脂；進一步優(yōu)選的，在使用之前需要對大孔樹脂進行預處理，預處理的步驟可參考如下：將原料干樹脂在蒸餾水中充分浸泡，然后在溶脹后濾干，加等體積乙醇攪拌1h,用蒸餾水洗凈濾干,加4倍量的2mol/l的鹽酸溶液攪拌2h,用蒸餾水洗至中性,濾干；加2倍量2mol/l的氫氧化鈉溶液攪拌2h,蒸餾水洗至中性,濾干；最后用2倍量2mol/l的鹽酸溶液攪拌2h,水洗至中性,濾干后備用；加入大孔樹脂進行吸附的步驟可優(yōu)選的參考如下：將濃縮過濾后所得濾液加入吸附罐中，然后加入離子交換水，并調(diào)整其鹽濃度為1～6mol/l，同時，優(yōu)選的將體系的ph調(diào)節(jié)至7.5～8.5，體系的溫度調(diào)節(jié)為35～55℃，體系溫度更優(yōu)選的調(diào)整至40～50℃；然后加入樹脂進行離子交換，并吸附肝素鈉；吸附處理的時間優(yōu)選的控制在3～6h，更優(yōu)選的，吸附的時間控制在4～5h；然后，將離子交換后的樹脂以清水清洗后，進行洗脫；洗脫的步驟可以參考如下：將吸附后的樹脂以鹽水洗脫，優(yōu)選的，所用鹽水為氯化鈉或氯化鉀溶液，更優(yōu)選的，所述鹽溶液為氯化鈉溶液；進一步優(yōu)選的，所述氯化鈉溶液的濃度為0.3～0.6mol/l；更進一步優(yōu)選的，所述氯化鈉溶液的濃度為0.4～0.5mol/l；然后將所得洗脫液以酒精沉淀，沉淀的時間控制在10～12h；然后，將體系進行固液分離，將固形物在80～85℃條件下干燥10～15h后，即得到肝素鈉粗品。進一步的，還可以以本發(fā)明肝素鈉粗品為原料，并進一步精制得到高純度的肝素鈉，從而進一步提高產(chǎn)品的價值。實施例1新鮮豬小腸經(jīng)刮腸機處理得到新鮮粘膜，將粘膜粉碎后加水攪拌；然后，將體系ph調(diào)節(jié)至8.5，溫度調(diào)整至60℃，然后，按照2:1的比例加入堿性蛋白酶以及胰蛋白酶，并使得體系中兩種酶的濃度達到0.5g/l,并進行酶解，酶解的時間控制在3h；將所得酶解液濃縮后過濾，然后向濾液中加入樹脂,調(diào)節(jié)體系ph至8.2，進行吸附，吸附過程中，保持體系的溫度為45℃；在吸附4.5h后，將樹脂過濾得到，并以濃度為0.45mol/l的氯化鈉溶液進行洗脫，然后將洗脫液以酒精沉淀，固液分離后，將固形物干燥得到實施例1的肝素鈉粗品。進一步的，還可以將實施例1的肝素鈉粗品進一步進行純化，并得到高純度的肝素鈉產(chǎn)品。實施例2新鮮豬小腸經(jīng)刮腸機處理得到新鮮粘膜，將粘膜粉碎后加水攪拌；然后，將體系ph調(diào)節(jié)至8.5，溫度調(diào)整至60℃，然后，按照2:1的比例加入堿性蛋白酶以及胰蛋白酶，并使得體系中兩種酶的濃度達到0.5g/l,并進行酶解，酶解的時間控制在3h；將所得酶解液濃縮后過濾，然后向濾液中加入樹脂,調(diào)節(jié)體系ph至8.2，進行吸附，吸附過程中，保持體系的溫度為35℃；在吸附4.5h后，將樹脂過濾得到，并以濃度為0.45mol/l的氯化鈉溶液進行洗脫，然后將洗脫液以酒精沉淀，固液分離后，將固形物干燥得到實施例2的肝素鈉粗品。實施例3新鮮豬小腸經(jīng)刮腸機處理得到新鮮粘膜，將粘膜粉碎后加水攪拌；然后，將體系ph調(diào)節(jié)至8.5，溫度調(diào)整至60℃，然后，按照2:1的比例加入堿性蛋白酶以及胰蛋白酶，并使得體系中兩種酶的濃度達到0.5g/l,并進行酶解，酶解的時間控制在3h；將所得酶解液濃縮后過濾，然后向濾液中加入樹脂,調(diào)節(jié)體系ph至8.2，進行吸附，吸附過程中，保持體系的溫度為55℃；在吸附4.5h后，將樹脂過濾得到，并以濃度為0.45mol/l的氯化鈉溶液進行洗脫，然后將洗脫液以酒精沉淀，固液分離后，將固形物干燥得到實施例3的肝素鈉粗品。實施例4新鮮豬小腸經(jīng)刮腸機處理得到新鮮粘膜，將粘膜粉碎后加水攪拌；然后，將體系ph調(diào)節(jié)至8.5，溫度調(diào)整至60℃，然后，按照2:1的比例加入堿性蛋白酶以及胰蛋白酶，并使得體系中兩種酶的濃度達到0.5g/l,并進行酶解，酶解的時間控制在3h；將所得酶解液濃縮后過濾，然后向濾液中加入樹脂，調(diào)節(jié)體系的ph至7.5，進行吸附，吸附過程中，保持體系的溫度為45℃；在吸附4.5h后，將樹脂過濾得到，并以濃度為0.45mol/l的氯化鈉溶液進行洗脫，然后將洗脫液以酒精沉淀，固液分離后，將固形物干燥得到實施例4的肝素鈉粗品。實施例5新鮮豬小腸經(jīng)刮腸機處理得到新鮮粘膜，將粘膜粉碎后加水攪拌；然后，將體系ph調(diào)節(jié)至8.5，溫度調(diào)整至60℃，然后，按照2:1的比例加入堿性蛋白酶以及胰蛋白酶，并使得體系中兩種酶的濃度達到0.5g/l,并進行酶解，酶解的時間控制在3h；將所得酶解液濃縮后過濾，然后向濾液中加入樹脂，調(diào)節(jié)體系的ph至8.5，進行吸附，吸附過程中，保持體系的溫度為45℃；在吸附4.5h后，將樹脂過濾得到，并以濃度為0.45mol/l的氯化鈉溶液進行洗脫，然后將洗脫液以酒精沉淀，固液分離后，將固形物干燥得到實施例5的肝素鈉粗品。實施例6新鮮豬小腸經(jīng)刮腸機處理得到新鮮粘膜，將粘膜粉碎后加水攪拌；然后，將體系ph調(diào)節(jié)至8.5，溫度調(diào)整至60℃，然后，按照2:1的比例加入堿性蛋白酶以及胰蛋白酶，并使得體系中兩種酶的濃度達到0.5g/l,并進行酶解，酶解的時間控制在3h；將所得酶解液濃縮后過濾，然后向濾液中加入樹脂，,調(diào)節(jié)體系ph至8.2進行吸附，吸附過程中，保持體系的溫度為45℃；在吸附4.5h后，將樹脂過濾得到，并以濃度為0.35mol/l的氯化鈉溶液進行洗脫，然后將洗脫液以酒精沉淀，固液分離后，將固形物干燥得到實施例6的肝素鈉粗品。實施例7新鮮豬小腸經(jīng)刮腸機處理得到新鮮粘膜，將粘膜粉碎后加水攪拌；然后，將體系ph調(diào)節(jié)至8.5，溫度調(diào)整至60℃，然后，按照2:1的比例加入堿性蛋白酶以及胰蛋白酶，并使得體系中兩種酶的濃度達到0.5g/l,并進行酶解，酶解的時間控制在3h；將所得酶解液濃縮后過濾，然后向濾液中加入樹脂,調(diào)節(jié)體系ph至8.2，進行吸附，吸附過程中，保持體系的溫度為45℃；在吸附4.5h后，將樹脂過濾得到，并以濃度為0.55mol/l的氯化鈉溶液進行洗脫，然后將洗脫液以酒精沉淀，固液分離后，將固形物干燥得到實施例7的肝素鈉粗品。對比例1新鮮豬小腸經(jīng)刮腸機處理得到新鮮粘膜，將粘膜粉碎后加水攪拌；然后，將體系ph調(diào)節(jié)至8.5，溫度調(diào)整至60℃，然后，加入堿性蛋白酶，并使得體系中兩種酶的濃度達到0.5g/l,并進行酶解，酶解的時間控制在3h；將所得酶解液濃縮后過濾，然后向濾液中加入樹脂,調(diào)節(jié)體系ph至8.2，進行吸附，吸附過程中，保持體系的溫度為45℃；在吸附4.5h后，將樹脂過濾得到，并以濃度為0.45mol/l的氯化鈉溶液進行洗脫，然后將洗脫液以酒精沉淀，固液分離后，將固形物干燥得到對比例1的肝素鈉粗品。對比例2新鮮豬小腸經(jīng)刮腸機處理得到新鮮粘膜，將粘膜粉碎后加水攪拌；然后，將體系ph調(diào)節(jié)至8.5，溫度調(diào)整至60℃，然后，加入胰蛋白酶，并使得體系中兩種酶的濃度達到0.5g/l,并進行酶解，酶解的時間控制在3h；將所得酶解液濃縮后過濾，然后向濾液中加入樹脂,調(diào)節(jié)體系ph至8.2，進行吸附，吸附過程中，保持體系的溫度為45℃；在吸附4.5h后，將樹脂過濾得到，并以濃度為0.45mol/l的氯化鈉溶液進行洗脫，然后將洗脫液以酒精沉淀，固液分離后，將固形物干燥得到對比例2的肝素鈉粗品。實驗例1按照肝素鈉得率＝肝素鈉粗品質(zhì)量/新鮮粘膜質(zhì)量，分別計算各組實施例和對比例的肝素鈉得率，結(jié)果如下：實驗組肝素鈉得率(×100％)實施例10.035實施例20.029實施例30.030實施例40.027實施例50.026實施例60.024實施例70.022對比例10.015對比例20.013由如上的對比數(shù)據(jù)可以看出，以復合酶進行酶解能夠有效提高肝素鈉粗品的得率；同時，由各實施例組的得率數(shù)據(jù)對比也可以看出，樹脂吸附和洗脫條件對于肝素鈉粗品的得率也有著一定的影響。然后，分別對各組所制得的肝素鈉粗品進行吸光度測試，結(jié)果顯示：實施例1的肝素鈉粗品的吸光度明顯低于對比例1、2的吸光度。由此可見，以復合酶進行酶解所得肝素鈉粗品的純度要優(yōu)于采用單一酶進行酶解的產(chǎn)物；同時，實施例2-7所得肝素鈉粗品的吸光度基本相當，且稍高于實施例1產(chǎn)品。由此可見，相較于其他實驗組而言，以實施例1條件進行樹脂吸附和鹽水洗脫所得肝素鈉的純度最高。盡管已用具體實施例來說明和描述了本發(fā)明，然而應意識到，在不背離本發(fā)明的精神和范圍的情況下可以作出許多其它的更改和修改。因此，這意味著在所附權利要求中包括屬于本發(fā)明范圍內(nèi)的所有這些變化和修改。當前第1頁12