本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體地說，涉及一種ECH1自身抗體的篩選和鑒定方法及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

肺癌是中國，以及全球發(fā)病率及死亡率第一的惡性腫瘤。在過去的40年間，肺癌的5年生存率僅從12％上升至16％，最主要原因是診斷時已屬晚期,相反，早期診斷的肺癌進行手術(shù)后生存率可提高到80％?？梢姡绨l(fā)現(xiàn)、早期診斷對肺癌的治療及預(yù)后具有重要的臨床意義。當(dāng)前廣泛運用的檢測手段包括無創(chuàng)檢查(如X線、CT、鉬靶攝片等)和有創(chuàng)檢查(纖維支氣管鏡、支氣管造影、B超或CT定位下穿刺活檢等)，但缺乏依從性和普及運用的可能。找尋新的肺癌分子標(biāo)志物，尤其是血清分子標(biāo)志物，讓肺癌患者能夠及時有效的早查、早診、早治，是提高肺癌患者生存率、降低死亡率的關(guān)鍵科學(xué)問題。盡管目前有一些腫瘤標(biāo)志物,如CA125(癌抗原125)、CA19-9(癌抗原19-9)、CEA(癌胚抗原)等可用于肺癌的檢測，但敏感性和特異性均不高，所以目前為止，尚沒有理想的可供臨床使用的肺癌早期篩查和診斷標(biāo)志物。

腫瘤相關(guān)抗原(tumor-associate antigens，TAAs)的自身抗體在正常人和非腫瘤患者血清中不存在或滴度很低，而且患者血清中自身抗體水平的升高往往早于腫瘤癥狀的出現(xiàn)。再者，抗-TAA抗體具有其它腫瘤標(biāo)志物不具備的優(yōu)勢，一方面是它能夠在血清中持續(xù)穩(wěn)定存在，而其它的標(biāo)志物，包括TAA本身，在其被腫瘤細胞釋放后就被快速降解或者在其進入血液循環(huán)后的很短時間內(nèi)就被機體清除，而且，檢測自身抗體檢測方法和試劑的普及性也有助于研究癌癥患者體內(nèi)抗-TAA抗體的產(chǎn)生規(guī)律和功能。因此檢測抗-TAAs的自身抗體可以作為早期腫瘤的血清標(biāo)志物。各國學(xué)者已開展相關(guān)多項研究，值得一提的是EarlyCDT-Lung test的研究成果。EarlyCDT-Lung test是首個通過檢測血清中自身抗體以檢測肺癌的工具，用以輔助內(nèi)科醫(yī)生的物理檢查方法，從而提高肺癌診斷率。最初，該實驗包括六種TAAs自身抗體(p53,NY-ESO-1,CAGE,GBU4-5,Annexin I和SOX2)的檢測，檢測肺癌的靈敏度和特異度分別為40％和82％。新一版的EarlyCDT-Lung test將TAAs自身抗體更新至7種(p53,NY-ESO-1,CAGE,GBU4-5,SOX2,HuD和MAGE A4)，其靈敏度和特異度也分別提高到47％和90％。有研究顯示，這些自身抗體結(jié)果陽性的非小細胞肺癌患者中超過一半(57％)為I期和II期的早期肺癌，提示EarlyCDT-Lung test可作為輔助CT早期檢測肺癌的生物學(xué)標(biāo)志物檢查工具。這些研究成果提示腫瘤相關(guān)抗原抗體的檢測將有望成為肺癌早期檢測的重要血清學(xué)生物標(biāo)志物。但值得注意的是，EarlyCDT-Lung test雖然具有較高的特異度和陽性預(yù)測值，但靈敏度仍然不夠理想(不到50％)，漏診的病例較多，導(dǎo)致大量患者未能被及時發(fā)現(xiàn)，而錯失手術(shù)治療的良機。鑒于目前自身抗體檢測在肺癌診斷的臨床應(yīng)用中仍有不足，不斷地發(fā)現(xiàn)和鑒定新的肺癌相關(guān)TAAs仍是一項重要的工作。

綜上所述，為了最終實現(xiàn)降低肺癌的死亡率，提高生存率，本領(lǐng)域迫切需要篩選和鑒定更加敏感、特異血清學(xué)自身抗體標(biāo)志物，并開發(fā)操作簡單、成本低、適用范圍廣泛的檢測肺癌自身抗體的試劑盒。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于克服肺癌現(xiàn)有腫瘤標(biāo)志物不理想的問題，旨在提高肺癌早期診斷的靈敏度、特異度和準(zhǔn)確性。利用一種特異性高、敏感度強的診斷標(biāo)志物制備穩(wěn)定性好、檢測方便的用于肺癌早期診斷的試劑。提供一種在ECH1自身抗體的篩選和鑒定方法及其應(yīng)用，具體設(shè)計一種能區(qū)分肺癌和正常人的抗腫瘤相關(guān)抗原ECH1(enoyl-CoA hydratase 1)自身抗體。本發(fā)明的另一目的是提供該抗腫瘤相關(guān)抗原ECH1自身抗體的ELISA檢測方法。其具體技術(shù)方案為：

一種ECH1自身抗體的篩選和鑒定方法，包括以下步驟：

1)通過肺癌細胞系H1299全蛋白提取物進行雙向電泳，與5例肺癌患者血清和5例正常人血清進行蛋白印跡法，篩選有意義的腫瘤自身抗原，經(jīng)過比對分析，僅出現(xiàn)在患者血清的蛋白點被進行進一步分析；

2)SDS-PAGE膠上的興趣蛋白點經(jīng)切割、消化后，采用LC-MS/MS質(zhì)譜分析方法對上述蛋白點進行分析，經(jīng)檢測鑒定為ECH1；

3)為進一步驗證ECH1自身抗體能否作為肺癌診斷標(biāo)志物，應(yīng)用ELISA檢測方法，對90例肺癌患者血清，90例慢性肺病患者血清，以及89例正常人血清進行ECH1自身抗體水平的檢測；結(jié)果顯示，ECH1自身抗體在肺癌患者血清中的表達水平高于慢性阻塞性肺炎(以下簡稱：慢阻肺)患者和正常人血清，具有統(tǒng)計學(xué)意義。

進一步，步驟3)中所述ECH1自身抗體水平的檢測的步驟具體為：用抗原稀釋液將純化的ECH1蛋白稀釋至0.5ug/ml，包被96孔板，血清樣本1:100稀釋，與抗原作用后，與辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗人IgG抗體反應(yīng)，最終加入ABTS(2,2ˊ-連氮基-雙(3-乙基苯并二氫噻唑-6-磺酸)二銨鹽)底物液進行顯色。在酶標(biāo)儀下讀取OD值，以反應(yīng)血清中ECH1自身抗體的水平。

本發(fā)明所述ECH1自身抗體在肺癌與正常人和慢性肺病的鑒別過程中的應(yīng)用。

本發(fā)明所述ECH1自身抗體在肺癌早期診斷過程中的應(yīng)用。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果：

本發(fā)明提供一種操作簡單、成本低、準(zhǔn)確性高、無創(chuàng)傷的應(yīng)用于臨床的肺癌診斷的血清生物標(biāo)志物。本發(fā)明研究發(fā)現(xiàn)應(yīng)用ELISA方法進行血清ECH1自身抗體的檢測，可以較準(zhǔn)確地將肺癌患者和正常人，以及慢阻肺患者鑒別開來，并可以用于肺癌的早期診斷。在此背景下提供此方便、快捷、有效的檢測肺癌患者，可用于臨床的肺癌早期診斷。

附圖說明

圖1是篩選和鑒定肺癌ECH1自身抗體的技術(shù)路線；

圖2是血清蛋白組學(xué)檢測結(jié)果，其中圖2A為H1299肺癌細胞系經(jīng)雙向電泳后考馬斯亮藍染色結(jié)果，圖2B為肺癌患者血清的雙向電泳-免疫印跡結(jié)果，圖2C為正常人血清的雙向電泳-免疫印跡結(jié)果；

圖3是肺癌患者、慢阻肺患者和正常人血清中ECH1自身抗體的滴度水平；

圖4是受試者工作曲線(ROC)分析ECH1自身抗體對肺癌的診斷效能。A：肺癌患者和正常對照的ROC分析；B:肺癌患者和慢阻肺的ROC分析；C：肺癌和正常對照+慢阻肺的ROC分析。A：肺癌患者和正常對照的ROC分析；B:肺癌患者和慢阻肺的ROC分析；C:肺癌和正常對照+慢阻肺的ROC分析。Sensitivity:靈敏度；specificity:特異度；AUC：曲線下面積

具體實施方式

下面結(jié)合附圖和具體實施方案對本發(fā)明的技術(shù)方案作進一步詳細地說明。

本發(fā)明采用血清蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)(如圖1)篩選肺癌相關(guān)腫瘤抗原，并應(yīng)用ELISA方法檢測肺癌患者血清中ECH1抗體水平。

1)通過肺癌細胞系H1299全蛋白提取物進行雙向電泳，與5例肺癌患者血清和5例正常人血清進行蛋白印跡法，篩選有意義的腫瘤自身抗原，經(jīng)過比對分析，僅出現(xiàn)在患者血清的蛋白點被進行進一步分析(如圖2)。

2)SDS-PAGE膠上的興趣蛋白點經(jīng)切割、消化后，采用LC-MS/MS質(zhì)譜分析方法對上述蛋白點進行分析，經(jīng)檢測鑒定為ECH1。

3)為進一步驗證ECH1自身抗體能否作為肺癌診斷標(biāo)志物，應(yīng)用ELISA檢測方法，對90例肺癌患者血清，90例慢阻肺患者血清，以及89例正常人血清進行ECH1自身抗體水平的檢測，其步驟包括：用抗原稀釋液將純化的ECH1蛋白稀釋至0.5ug/ml，包被96孔板，血清樣本1:100稀釋，與抗原作用后，與辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗人IgG抗體反應(yīng)，最終加入ABTS底物液進行顯色。在酶標(biāo)儀(405nm吸光度)下讀取OD值，以反應(yīng)血清中ECH1自身抗體的水平。結(jié)果顯示，ECH1自身抗體在肺癌患者血清中的表達水平高于COPD患者和正常人血清，具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001，如圖3所示)。

4)為檢測ECH1自身抗體對于肺癌患者的鑒別能力，本發(fā)明通過對肺癌患者組與慢阻肺組，以及肺癌患者組與正常人組進行ROC曲線分析，結(jié)果顯示，肺癌對正常人的曲線下面積為0.799(0.731-0.867)，靈敏度和特異度分別為62.2％和95.5％；肺癌對慢阻肺的曲線下面積為0.801(0.732-0.870)，靈敏度和特異度分別為62.2％和97.8％(圖4)。

5)為進一步了解ECH1自身抗體在肺癌早期診斷中的應(yīng)用價值，本發(fā)明對25例早期(I期)肺癌患者血清以及56例配對正常人血清進行ECH1檢測，并進行ROC分析，結(jié)果顯示曲線下面積及95％可信區(qū)間為0.763(0.641-0.884)，靈敏度和特異度分別為60.0％和89.3％。

結(jié)果表明，本發(fā)明提供的ECH1自身抗體可作為早期肺癌的診斷標(biāo)志物，本發(fā)明提供了所述ECH1自身抗體標(biāo)志物的ELISA檢測方法；本發(fā)明提供的ECH1自身抗體可用于肺癌的診斷。

1.血清標(biāo)本收集

本發(fā)明中共使用90例肺癌患者血清、90例慢阻肺患者血清和89例正常人血清，進行ECH1自身抗體在肺癌診斷中的初步評價。另外25例早期肺癌血清和56例年齡性別匹配的正常人血清進行進一步在早期肺癌中診斷價值的評價。所有肺癌患者均經(jīng)病理學(xué)診斷肺癌，正常人來自常規(guī)體檢人群。血液標(biāo)本于2000g離心5分鐘，收集血清，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.雙向電泳-蛋白印跡分析

使用再水化樣本緩沖液(8M尿素，50mM DTT，4％CHAPS，2％兩性載體ampholytes溶液，Bio-Rad公司)充分裂解肺癌細胞H1299，室溫渦旋震蕩1個小時，4℃16000g離心20分鐘，留上清。取200微克蛋白上清液置于IPG膠條上(7cm，pH 3-10)，在Protein IEF Cell(Bio-Rad)進行第一向等點聚焦，共使用3個膠條。一向聚焦的條件為：每個膠條電流50mM，電壓30V 30分鐘，然后3500V 2.5小時，最后8000V 5個小時。聚焦結(jié)束的3個膠條立即進行平衡及第二向SDS-PAGE電泳，電泳結(jié)束后，一個SDS-PAGE膠進行考馬斯亮藍染色(圖2A)。另外兩塊SDS-PAGE膠進行蛋白印跡分析，操作如下：在點轉(zhuǎn)移裝置中將SDS-PAGE膠上的蛋白點轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜(NC膜)，NC膜在封閉液(含5％脫脂奶粉和0.05％Tween20的PBS溶液，PBST)中室溫封閉1小時，然后分別與五例患者血清混合液或5例正常人血清混合液(1:500稀釋在封閉液中)4℃孵育過夜，PBST洗滌三次，再與1:10000稀釋的羊抗人IgG-HRP二抗反應(yīng)1小時。PBST洗膜三次后，進行化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，最后曝光，拍照(圖2B和圖2C)。

3.質(zhì)譜分析

通過對比與正常人血清和肺癌患者血清反應(yīng)的NC膜，將僅出現(xiàn)在患者血清中的蛋白點(圖2B和圖2C)，在SDS-PAGE膠上相應(yīng)的蛋白點切割下來，消化后進行LC-MS/MS串聯(lián)質(zhì)譜分析(具體由生物工程公司進行質(zhì)譜分析)。最后利用BioTools軟件搜索NCBI數(shù)據(jù)庫，尋找匹配的相關(guān)蛋白質(zhì)，同時查詢其功能，以明確鑒定的蛋白質(zhì)的種類和功能。結(jié)果經(jīng)過分析比對，發(fā)現(xiàn)了34KD處的蛋白點為ECH1蛋白。

4.ELISA法檢測ECH1自身抗體的血清表達水平

4.1所需試劑：

1)0.5M磷酸鹽緩沖液：56.8g Na₂HPO₄，13.8g NaH₂PO₄·H₂O，加蒸餾水至1L。

2)PBS緩沖液(pH7.2)：65.4g NaCl，0.5M磷酸鹽緩沖液160ml，加蒸餾水至8L。

3)PBST：PBS緩沖液1L，加入0.5ml Tween20，混勻。

4)封閉液：10mg/ml明膠100ml，NaCl 8.2g，0.5M磷酸鹽緩沖液20ml，加蒸餾水至1L。

5)血清稀釋液：10mg/ml明膠100ml，NaCl 8.2g，0.5M磷酸鹽緩沖液20ml，BGG(bovine gamma globulin)5g，BSA(bovine serum albumin)1g，10％Tween-20 5ml，加蒸餾水至1L。

6)二抗稀釋液：NaCl 8.2g，0.5M磷酸鹽緩沖液20ml，BGG 1g，BSA 5g，10％Tween-205ml加蒸餾水至1L。

7)McIIvain’s緩沖液：0.2M Na₂HPO₄ 234ml，0.1M枸櫞酸溶液266ml，混勻，調(diào)pH值至4.6.

8)ABST底物工作液：10mg/ml ABST 2ml，McIIvain’s緩沖液18ml，H₂O₂ 0.1ml，新鮮配置。

4.2ECH1自身抗體檢測方法

1)抗原包被：從生物公司購買的純化ECH1蛋白，用PBS稀釋至0.5ug/ml，在每個96孔板加100ul，4℃過夜。

2)封閉：PBST洗板3次，每孔加入200ul封閉液，37℃孵育2小時，PBST洗三次，拍干。

3)與一抗反應(yīng)：血清樣本用血清稀釋液1:100稀釋，每孔加入100ul，室溫孵育2小時，PBST洗滌三次，拍干。

4)與二抗反應(yīng)：羊抗人IgG-HRP抗體用二抗稀釋液1:4000稀釋，每孔加入100ul，室溫孵育2小時，洗滌三次，拍干。

5)顯色：每個反應(yīng)孔加入ABTS底物工作液100ul，室溫孵育30分鐘。

6)結(jié)果判定：用酶標(biāo)儀405nm波長測定各孔OD值。

5.統(tǒng)計分析方法

本發(fā)明使用Manner-Whitney U檢驗分析比較兩組血清抗體的表達水平差異；ROC曲線確定抗體陽性的判斷標(biāo)準(zhǔn)，即約登指數(shù)最大的OD值；根據(jù)曲線下面積(AUC)判斷抗體對肺癌的鑒別能力。所有統(tǒng)計分析使用SPSS20.0軟件進行，P<0.05為統(tǒng)計判斷標(biāo)準(zhǔn)。

6.臨床上檢測ECH1自身抗體在肺癌診斷中的應(yīng)用

1)ECH1自身抗體對肺癌與正常人和慢性肺病(慢阻肺)的鑒別能力：

本發(fā)明用ELISA檢測方法對90例肺癌患者血清，90例正常人血清和89例COPD患者血清進行ECH1自身抗體水平的檢測，結(jié)果顯示，肺癌血清中ECH1自身抗體的OD值中位數(shù)為0.187，顯著高于正常人血清(0.082)與COPD血清(0.077)，P值均小于0.001(見圖3)。ECH1自身抗體肺癌對于正常人的AUC及95％可信區(qū)間為0.799(0.731-0.867)，靈敏度和特異度分別為62.2％和95.5％，準(zhǔn)確性為78.8％；肺癌對于COPD的AUC及95％可信區(qū)間為0.801(0.732-0.870)，靈敏度和特異度分別為62.2％和97.8％，準(zhǔn)確性為80.0％(圖4)。本發(fā)明提示，ECH1自身抗體可以很好地將肺癌與正常人和慢阻肺區(qū)別開來。

2)ECH1自身抗體對早期肺癌診斷價值

本發(fā)明用ELISA檢測方法對25例肺癌早期患者(I期)和56例性別年齡匹配的正常人血清進行ECH1自身抗體水平的檢測，結(jié)果顯示，早期肺癌患者ECH1自身抗體OD值中位數(shù)為0.171，顯著高于正常人血清(0.093)，統(tǒng)計學(xué)檢驗P<0.008。ROC分析結(jié)果顯示，早期肺癌對于正常人的曲線下面積AUC及可信區(qū)間是0.763(0.641-0.884)，靈敏度和特異度分別為60.0％和89.3％。本發(fā)明結(jié)果提示，ECH1自身抗體可以作為早期肺癌的診斷生物標(biāo)志物。

以上所述，僅為本發(fā)明較佳的具體實施方式，本發(fā)明的保護范圍不限于此，任何熟悉本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員在本發(fā)明披露的技術(shù)范圍內(nèi)，可顯而易見地得到的技術(shù)方案的簡單變化或等效替換均落入本發(fā)明的保護范圍內(nèi)。