專利名稱：一種用于糖尿病自身抗體6項(xiàng)聯(lián)檢試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種用于糖尿病自身抗體6項(xiàng)聯(lián)檢試劑盒。
背景技術(shù)：
糖尿病(diabetes)是由遺傳因素、免疫功能紊亂、微生物感染及其毒素、自由基毒素、精神因素等等各種致病因子作用于機(jī)體導(dǎo)致胰島功能減退、胰島素抵抗等而引發(fā)的糖、蛋白質(zhì)、脂肪、水和電解質(zhì)等一系列代謝紊亂綜合征，臨床上以高血糖為主要特點(diǎn)，典型病例可出現(xiàn)多尿、多飲、多食、消瘦等表現(xiàn)，即“三多一少”癥狀，糖尿病(血糖)一旦控制不好會(huì)引發(fā)并發(fā)癥，導(dǎo)致腎、眼、足等部位的衰竭病變，且無法治愈。糖尿病已經(jīng)成為繼心腦血管、癌癥以外危害人類健康的第三大疾病。臨床上根據(jù)病因和發(fā)病機(jī)制分為I型糖尿病(T1DM)、2型糖尿病(T2DM)及其他 類型。T1DM又稱免疫介導(dǎo)性糖尿病，它是由于自身免疫系統(tǒng)破壞胰島細(xì)胞，使胰島素的合成和分泌減少或完全缺乏的自身免疫性疾病J2DM主要是因?yàn)橐葝u素抵抗伴相對(duì)性胰島素不足而引起。LADA全稱為成人隱匿性免疫性糖尿病(latent autoimmune diabetes inadult, LADA)，其介于I型糖尿病和2型糖尿病之間，屬于免疫介導(dǎo)型I型糖尿病的亞型，其患病率約占初診2型糖尿病患者的10%-15% (患病率是I型糖尿病的2倍)，其中胰島B細(xì)胞功能衰退速度是2型糖尿病患者的3倍。由此可知，對(duì)糖尿病進(jìn)行準(zhǔn)確的分型是對(duì)其實(shí)施預(yù)防及治療的基本前提。檢測(cè)糖尿病患者自身抗體是對(duì)糖尿病進(jìn)行準(zhǔn)確分型的主要方法。目前確認(rèn)的糖尿病自身抗體包括胰島細(xì)胞抗體(ICA)、谷氨酸脫羧酶抗體(GADA)、胰島素抗體(IAA)酪氨酸磷酸抗體(IA-2A)、羧基肽酶抗體(CPH-A)和鋅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白8抗體(ZnT8-A)
坐寸o目前常用免疫組化法、免疫熒光法、酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)、放射免疫法(RIA)檢測(cè)。但是上述方法檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)，對(duì)輔助設(shè)備的要求較高，且僅能檢測(cè)單一自身抗體，單一自身抗體檢測(cè)的敏感性僅為39%-68. 8%。免疫印跡(IB)法或稱蛋白免疫印跡試驗(yàn)(Western Blot, WB)是目前國(guó)內(nèi)測(cè)定可提取性核抗原(ENA)多肽抗體的主要方法，因?yàn)樗Y(jié)合了聚丙烯酰凝膠電泳的高分辨率和免疫標(biāo)記技術(shù)的高特異性及敏感性的優(yōu)點(diǎn)。近年來被衛(wèi)生部臨檢中心推薦為愛滋病等傳染性疾病的確認(rèn)試驗(yàn)。但將免疫印跡法用于糖尿病自身抗體6項(xiàng)聯(lián)檢在國(guó)內(nèi)尚未見報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
有鑒于此，本發(fā)明提供一種用于糖尿病自身抗體6項(xiàng)聯(lián)檢試劑盒。本發(fā)明提供的試劑盒對(duì)I\DM、T2DM和正常人血清中ICA、GADA, IAA、IA-2ACPH-A和ZnT8_A等6種抗體聯(lián)合檢測(cè)，對(duì)I型糖尿病診斷有高度敏感性(可達(dá)98%)和特異性(可達(dá)99. 6%)，為糖尿病的分型診斷提供高效、快捷的檢測(cè)手段。為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供以下技術(shù)方案本發(fā)明提供了一種用于糖尿病自身抗體6項(xiàng)聯(lián)檢試劑盒，包括檢測(cè)印跡膜和標(biāo)準(zhǔn)帶;檢測(cè)印跡膜依次包括起始帶、檢測(cè)帶和質(zhì)控帶；檢測(cè)帶轉(zhuǎn)印有胰島細(xì)胞抗原、酪氨酸磷酸酶抗原、谷氨酸脫羧酶抗原、鋅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白8抗原、羧基肽酶抗原、胰島素自身抗原；標(biāo)準(zhǔn)帶的制備方法為取胰島細(xì)胞抗體、酪氨酸磷酸酶抗體、谷氨酸脫羧酶抗體、鋅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白8抗體、羧基肽酶抗體、胰島素自身抗體經(jīng)梯度不連續(xù)電泳后轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜，顯色后，獲得標(biāo)準(zhǔn)印跡膜，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)印跡膜上各陽(yáng)性區(qū)帶分別與起始帶、質(zhì)控帶的相對(duì)距離，獲得標(biāo)準(zhǔn)帶。同一胰島細(xì)胞蛋白抗原因電泳時(shí)的微笑效應(yīng)(在電泳槽中心的抗原移動(dòng)速度大 于兩邊)，使相同的胰島細(xì)胞蛋白抗原帶不能在一條直線上，與標(biāo)準(zhǔn)帶比對(duì)時(shí)會(huì)造成結(jié)果誤判。本發(fā)明在制備試劑盒的過程中，利用梯度不連續(xù)電泳解決了這一難題，不僅保證了結(jié)果判斷的準(zhǔn)確性，而且也是大批量生產(chǎn)的前提。ICA作為一類自身抗體，發(fā)現(xiàn)于1974年，當(dāng)時(shí)認(rèn)為與胰島的所有細(xì)胞均存在反應(yīng)，T1DM兒童中，70%-80%在明確診斷時(shí)ICA為陽(yáng)性。ICA檢測(cè)是臨床上應(yīng)用較早的指標(biāo)，在多數(shù)試驗(yàn)室中采用免疫組化的方法來進(jìn)行測(cè)定，雖然具有一定的靈敏度和特異性，但由于受檢測(cè)方法學(xué)的限制，使檢測(cè)結(jié)果在不同的試驗(yàn)室中有一定差異。Palmer等在1983年最先檢出IAA后，指出T1DM自身免疫過程并非僅限于胰島細(xì)胞膜和胞漿抗原，胰島素分子作為抗原也參與T1DM的自身免疫過程。胰腺內(nèi)的GAD65被證實(shí)是T1DMdtiff-Hian綜合征及多發(fā)性自身免疫性內(nèi)分泌綜合征等疾病的一種自身抗原，上述疾病的部分患者體內(nèi)存在GAD65抗體，其中T1DM中的陽(yáng)性率最聞。蛋白酪氨酸磷酸酶(PTP)樣跨膜蛋白(1994年發(fā)現(xiàn))，目前稱為ICA512或IA-2抗體，它是胰島細(xì)胞瘤相關(guān)蛋白，是ICA的主要的成分之一，結(jié)構(gòu)上分為4部分，信號(hào)肽、胞外結(jié)構(gòu)、單一跨膜結(jié)構(gòu)域及胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域，其分子量為120KD。IA-2識(shí)別的表位局限于胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域。羧基肽酶-H自身抗體(CPH-Ab)，位于胰島細(xì)胞胞漿中羧基肽酶-H自身抗體(CPH-Ab)。2003年在成人遲發(fā)自身免疫性糖尿病(LADA)患者中發(fā)現(xiàn)。經(jīng)典I型糖尿病中的檢出率不到13%，CPH-A陽(yáng)性糖尿病患者具有LADA患者的臨床特征，CPH-A是提高LADA診斷效率的一項(xiàng)新指標(biāo)，與GADA聯(lián)合檢測(cè)可提高LADA診斷的敏感性。鋅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白8抗體(2004年Chimienti發(fā)現(xiàn))定位于胰島素分泌細(xì)胞的分泌顆粒中。是一種新的鋅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，主要是負(fù)責(zé)將Zn轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞外基質(zhì)。其定位于胰島素分泌顆粒中，參與胰島素分泌功能。在本發(fā)明的一些實(shí)施例中，本發(fā)明提供的用于糖尿病自身抗體6項(xiàng)聯(lián)檢試劑盒中，標(biāo)準(zhǔn)帶與標(biāo)準(zhǔn)印跡膜中相應(yīng)陽(yáng)性區(qū)帶的誤差小于0. 5mm。在本發(fā)明的一些實(shí)施例中，本發(fā)明提供的用于糖尿病自身抗體6項(xiàng)聯(lián)檢試劑盒中還包括濃縮洗滌液、工作液、酶聯(lián)試劑和顯色液。在本發(fā)明的一些實(shí)施例中，本發(fā)明提供的用于糖尿病自身抗體6項(xiàng)聯(lián)檢試劑盒中，還包括與檢測(cè)印跡膜相配合的反應(yīng)槽，反應(yīng)槽與檢測(cè)印跡膜可拆卸連接。在本發(fā)明的一些實(shí)施例中，本發(fā)明提供的用于糖尿病自身抗體6項(xiàng)聯(lián)檢試劑盒中，檢測(cè)印跡膜的制備方法為取胰島細(xì)胞抗原、酪氨酸磷酸酶抗原、谷氨酸脫羧酶抗原、鋅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白8抗原、羧基肽酶抗原、胰島素自身抗原經(jīng)梯度不連續(xù)電泳后轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜，即得。在本發(fā)明的一些實(shí)施例中，制備獲得胰島細(xì)胞抗原、酪氨酸磷酸酶抗原、谷氨酸脫羧酶抗原、鋅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白8抗原、羧基肽酶抗原、胰島素自身抗原的方法具體為將胰腺組織用超聲波細(xì)胞破碎儀破碎，置高速冷凍離心機(jī)，收集上清液，置透析袋透析后置聚乙二醇中濃縮，用紫外分光光度儀測(cè)定DM蛋白抗原含量。其主要解決的關(guān)鍵問題是在于提取和純化DM抗原過程中，其抗原成份會(huì)降解丟失。在本發(fā)明的一些實(shí)施例中，本發(fā)明提供的用于糖尿病自身抗體6項(xiàng)聯(lián)檢試劑盒中，酶聯(lián)試劑的制備方法為取磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、硫柳汞與水混合溶解，與小牛血清、酶標(biāo)記物混合后，加水稀釋，調(diào)節(jié)PH值為7. 0 7. 4，混勻，即得；酶標(biāo)記物為辣根過氧化物酶標(biāo)記抗人IgG (效價(jià)1:100); 磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、硫柳汞的質(zhì)量比為20:1:1 ;以g/mL/mL/mL計(jì)，磷酸二氫鉀與小牛血清、酶標(biāo)記物、酶聯(lián)試劑的質(zhì)量體積比為1:70:47:140。在本發(fā)明的一些實(shí)施例中，本發(fā)明提供的用于糖尿病自身抗體6項(xiàng)聯(lián)檢試劑盒中，顯色液的制備方法為取3，3’，5，5’ -四甲基聯(lián)苯胺與0. 02mol/L的pH值為5. 0的磷酸鹽/檸檬酸緩沖液混合，與H2O2混合后，調(diào)節(jié)pH值為4. 8 5. 2，混勻，即得；以g/mL/mL/計(jì)，3，3’，5，5’ -四甲基聯(lián)苯胺與磷酸鹽/檸檬酸緩沖液、H2O2的質(zhì)量體積比為 0. 5:1000:0. I。在本發(fā)明的一些實(shí)施例中，本發(fā)明提供的用于糖尿病自身抗體6項(xiàng)聯(lián)檢試劑盒中，濃縮洗滌液的制備方法為取氯化鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀溶于水后，與吐溫-20混合，加水后調(diào)節(jié)pH值為7. 0 7. 4，混勻，即得；氯化鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀的質(zhì)量比為30:20:1 ;以g/mL/mL/計(jì),氯化鈉與吐溫_20、濃縮洗漆液的質(zhì)量體積比為9:5:70。在本發(fā)明的一些實(shí)施例中，本發(fā)明提供的用于糖尿病自身抗體6項(xiàng)聯(lián)檢試劑盒中，工作液的制備方法為取氯化鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀溶于水后，與小牛血清白蛋白混合，加水后調(diào)節(jié)pH值為7. 0 7. 4，混勻，即得；氯化鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、小牛血清白蛋白的質(zhì)量比為90:60:3:10 ；以g/mL計(jì)，氯化鈉與工作液的體積比為9:1000。本發(fā)明還提供了一種以非疾病診斷為目的的糖尿病自身抗體6項(xiàng)聯(lián)檢方法，包括如下步驟制備獲得標(biāo)準(zhǔn)帶；制備獲得檢測(cè)印跡膜；取濃縮洗滌液配制獲得洗滌應(yīng)用液；取檢測(cè)印跡膜與洗滌應(yīng)用液、待檢血清混合、孵育，棄去反應(yīng)液、拍干、洗滌，重復(fù)上述操作后，加入洗滌應(yīng)用液和酶聯(lián)試劑混合、孵育，棄去酶聯(lián)反應(yīng)液、拍干、洗滌，重復(fù)上述操作后，加入顯色劑顯色；質(zhì)控帶和各陽(yáng)性區(qū)帶顯色清晰后，棄去顯色液，流水沖洗終止反應(yīng)，取檢測(cè)印跡膜、干燥后與標(biāo)準(zhǔn)帶對(duì)照，獲得結(jié)果；
取檢測(cè)印跡膜的起始線與標(biāo)準(zhǔn)帶的起始線對(duì)齊，如果標(biāo)準(zhǔn)帶上的陽(yáng)性區(qū)帶對(duì)應(yīng)的檢測(cè)印跡膜上的相應(yīng)位置有顯色區(qū)帶，則待檢血清中含有相應(yīng)的抗體。本發(fā)明利用免疫印跡技術(shù)將胰腺細(xì)胞提取的混合蛋白抗原(包含有IA、GAD、IA_2、CPH、ZnT8和ICA等6種細(xì)胞蛋白成份)用SDS-聚丙酰胺凝膠電泳(PAGE)，按分子量大小依次分開，再通過印跡技術(shù)轉(zhuǎn)移至印跡膜上，其印跡膜條上即含有按分子量大小不同排列的各種胰島細(xì)胞自身抗原成份。將其放入反應(yīng)槽與待測(cè)血清反應(yīng),如待測(cè)血清含有自身抗體，將會(huì)分別與相應(yīng)抗原結(jié)合，再加入酶聯(lián)免疫顯色試劑，就會(huì)在抗原、抗體結(jié)合位置出現(xiàn)顯色區(qū)帶，與標(biāo)準(zhǔn)帶對(duì)照即可判斷待測(cè)血清中含有何種抗體。其抗體的有無及抗體的種類和數(shù)量，對(duì)糖尿病分型診斷、預(yù)測(cè)和防治均有重要的臨床意義。本發(fā)明提供的試劑盒對(duì)I\DM、T2DM和正常人血清中ICA、GADA, IAA、IA-2A、CPH-A和ZnT8-A等6種抗體聯(lián)合檢測(cè)，其T1DM陽(yáng)性率為98. 0 %，T2DM陽(yáng)性率為28. 81 %，而正常人陽(yáng)性率僅為3. 33%，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析其差別具有顯著性意義(P〈0. 01)。本發(fā)明提供的試劑盒對(duì)糖尿病的診斷和分型均有重要的臨床意義，一次能對(duì)6種胰島細(xì)胞自身抗體(ICA、GADA、IAA、IA-2A CPH-A和ZnT8_A)聯(lián)合檢測(cè)，能夠在分子水平檢測(cè)技術(shù)根據(jù)顯色區(qū)帶位置可判 斷自身抗原的分子量。與傳統(tǒng)試劑只能檢測(cè)一種自身抗體相比，使檢測(cè)效率提高了 6倍，其敏感性高(98. 0%)特異性強(qiáng)(99. 6%)，具有確認(rèn)價(jià)值，且操作簡(jiǎn)單、快速，多種自身抗體檢測(cè)一次完成只需2小時(shí)就可獲得檢驗(yàn)結(jié)果。同時(shí)該試劑盒操作簡(jiǎn)單，為糖尿病的分型診斷提供一個(gè)高效、快捷的檢測(cè)手段，不需特殊設(shè)備輔助，適宜在基層醫(yī)院推廣應(yīng)用。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明公開了一種用于糖尿病自身抗體6項(xiàng)聯(lián)檢試劑盒，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以借鑒本文內(nèi)容，適當(dāng)改進(jìn)工藝參數(shù)實(shí)現(xiàn)。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動(dòng)對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發(fā)明。本發(fā)明的方法及應(yīng)用已經(jīng)通過較佳實(shí)施例進(jìn)行了描述，相關(guān)人員明顯能在不脫離本發(fā)明內(nèi)容、精神和范圍內(nèi)對(duì)本文所述的方法和應(yīng)用進(jìn)行改動(dòng)或適當(dāng)變更與組合，來實(shí)現(xiàn)和應(yīng)用本發(fā)明技術(shù)。本發(fā)明提供的一種用于糖尿病自身抗體6項(xiàng)聯(lián)檢試劑盒中所用抗原、抗體及試劑均可由市場(chǎng)購(gòu)得。下面結(jié)合實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明實(shí)施例I試劑盒的制備IA、GAD、IA-2, CPH、ZnT8和ICA等6種胰島細(xì)胞蛋白抗原的提取和純化篩選豬、牛、大鼠和人胰腺組織，選出含6種胰島細(xì)胞蛋白抗原的胰腺組織；抽提6種胰島細(xì)胞蛋白抗原將胰腺組織用超聲波細(xì)胞破碎儀破碎，置高速冷凍離心機(jī)，收集上清液，置透析袋透析后置聚乙二醇中濃縮，用紫外分光光度儀測(cè)定DM蛋白抗原含量。其主要解決的關(guān)鍵問題是在提取和純化DM抗原過程中，其抗原成份會(huì)降解丟失。電泳將胰島細(xì)胞6種抗原用樣品緩沖液適當(dāng)稀釋，采用SDS-聚丙稀酰胺凝膠梯度不連續(xù)電泳，將各種蛋白組分按分子量大小分開。電轉(zhuǎn)移將電泳后的凝膠置電轉(zhuǎn)移儀，將胰島細(xì)胞蛋白混合抗原各種蛋白組分由凝膠層中轉(zhuǎn)移到硝酸纖維膜上，制備獲得檢測(cè)印跡膜。
酶標(biāo)試劑配制(每1000人份用量)稱取磷酸氫二鈉0. 2g、磷酸二氫鉀0. Olgjt柳汞0. Olg,并用純化水溶解于一潔凈容器中，用量筒量取滅活小牛血清0. 7mL傾入容器中，量取酶標(biāo)記物(酶標(biāo)記物為辣根過氧化物酶標(biāo)記抗人IgG,效價(jià)1:100)0. 47mL加入容器中，用純化水加到體積14mL。用精密pH試紙測(cè)定溶液pH值，pH=7. 2±0. 2。蓋緊瓶蓋，充分搖晃，使溶液混勻。在容器上貼上半成品標(biāo)簽，注上品名、批號(hào)、批量及分裝期限。顯色劑配制(每1000人份用量)稱取0. 5g3, 3'，5，5'-四甲基聯(lián)苯胺，溶解于lOOOmL.O. 02M PH5. 0磷酸鹽/檸檬酸緩沖液中，倒入顯色劑專用棕色瓶中，加入ImL H2O2,蓋緊瓶蓋，充分搖晃15分鐘，使溶液混勻。用精密PH試紙測(cè)定溶液PH值，PH = 5. 0±0. 2，在容器上貼上半成品標(biāo)簽，注上品名、批號(hào)、批量及分裝期限。濃縮洗滌液配制(每1000人份用量):量取吐溫_2050mL傾入一潔凈容器中。稱取氯化鈉90g、磷酸氫二鈉60g、磷酸二氫鉀3g并用純化水溶解于一潔凈容器中充分溶解。用 純化水將溶液加至批量體積700mL。用PH試紙測(cè)定溶液PH值，PH = 7. 2±0. 2。蓋緊桶蓋，充分搖晃15分鐘，使溶液混勻。在容器上貼上半成品標(biāo)簽，注上品名、批號(hào)、批量及分裝期限。工作液配制(每1000人份用量):稱量小牛血清白蛋白10克傾入一潔凈容器中。稱取氯化鈉9g、磷酸氫二鈉6g、磷酸二氫鉀0. 3g并用純化水溶解于一潔凈容器中充分溶解。用純化水將溶液加至批量體積1000mL。用PH試紙測(cè)定溶液PH值，PH = 7. 2±0. 2。標(biāo)準(zhǔn)帶的制備獲得胰島細(xì)胞6種自身抗體；電泳將胰島細(xì)胞6種自身抗體用樣品緩沖液適當(dāng)稀釋，采用SDS-聚丙稀酰胺凝膠梯度不連續(xù)電泳，將各種蛋白組分按分子量大小分開。電轉(zhuǎn)移將電泳后的凝膠置電轉(zhuǎn)移儀，將胰島細(xì)胞蛋白自身抗體由凝膠層中轉(zhuǎn)移到硝酸纖維膜上，制備獲得標(biāo)準(zhǔn)印跡膜。根據(jù)各陽(yáng)性區(qū)帶、質(zhì)控帶距起始線的距離用電腦模擬出標(biāo)準(zhǔn)帶。用A6銅版紙彩色打印或印刷。用標(biāo)準(zhǔn)印跡膜陽(yáng)性區(qū)帶與電腦模擬的標(biāo)準(zhǔn)帶對(duì)比使兩種區(qū)帶誤差小于0. 5_。實(shí)施例2基于本發(fā)明提供的試劑盒的檢測(cè)方法待測(cè)血清或全血IOii 1，待測(cè)標(biāo)本宜用新鮮血清或全血，血清一般可用靜脈取血，待凝固后離心取得。即時(shí)檢測(cè)可手指采血，用全血檢測(cè)。采得的血清或全血如當(dāng)天不檢測(cè)，應(yīng)置4°C保存；超過七天以上，需置一 20°C以下保存。洗滌應(yīng)用液的配制在2_8°C貯存的濃縮洗滌液會(huì)有結(jié)晶析出，將整瓶(25mL)濃縮洗滌液用蒸餾水或純凈水稀釋至250mL，放入試劑瓶中，標(biāo)簽上注明配制時(shí)間，保存于2-8 0C，有效期3個(gè)月，如有絮狀物或霉變應(yīng)廢棄；使用鑷子將所需數(shù)量的印跡膜放到反應(yīng)槽中，加入洗滌應(yīng)用液ImL和待檢血清IOii L ;置搖床上室溫(20 37°C )搖動(dòng)30min或置37°C溫箱30min ；棄去反應(yīng)槽液體,在吸水紙上拍干,加入洗漆應(yīng)用液ImL,洗漆Imin棄去反應(yīng)槽液體，反復(fù)洗滌3次，最后在吸水紙上拍干液體；在反應(yīng)槽中加入洗滌應(yīng)用液0. 5mL和酶聯(lián)試劑10 ii L ;置搖床上室溫(20 37°C )搖動(dòng)30min或置37°C溫箱30min ；
棄去反應(yīng)槽液體,在吸水紙上拍干,加入洗漆應(yīng)用液ImL,洗漆Imin棄去反應(yīng)槽液體，反復(fù)洗滌3次，最后在吸水紙上拍干液體；在反應(yīng)槽中加入顯色劑0. 5mL，在搖床上搖動(dòng)5±2min，顯色；待質(zhì)控帶和陽(yáng)性區(qū)帶顯色清晰后，倒掉槽中液體，用流水(自來水或蒸餾水)沖洗3次以終止反應(yīng)，取出印跡膜條，置吸水紙上，待干后與標(biāo)準(zhǔn)帶對(duì)照判斷結(jié)果。將印跡膜上起始線與標(biāo)準(zhǔn)帶起始線對(duì)齊，觀察陽(yáng)性顯色區(qū)帶與對(duì)應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)帶位置即可判斷是否有DM自身抗體。實(shí)施例3幾種檢測(cè)方法的比較45例TlDM患者來自分泌科和兒科的初診患者，均符合世界衛(wèi)生組織(WHO) 1999年診斷標(biāo)準(zhǔn)。年齡5-48歲，平均年齡(25±12歲)，其中男27例，女18例，健康對(duì)照組為50例來我院體檢者，年齡15-41歲，平均年齡(24±5歲)，其中男24例，女26例，所有對(duì)照者空腹血糖均正常，無糖尿病家族史和自身免疫病史。所有被檢標(biāo)本均是空腹靜脈采血，分離血清，分裝后置-20°C保存待檢。IAA放射免疫檢測(cè)試劑盒購(gòu)自北京生物技術(shù)研究所，SN-697全自動(dòng)雙探頭放射免疫r-計(jì)數(shù)儀由上海原子能研究所日環(huán)儀器一廠生產(chǎn)；IAA酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒是美國(guó)Biomerica公司產(chǎn)品，按試劑盒使用說明書操作，IAA陽(yáng)性判斷標(biāo)準(zhǔn)為測(cè)定值大于陰性對(duì)照值的2. 5倍；本發(fā)明提供的糖尿病自身抗體免疫印跡試劑盒，按試劑使用說明書操作，IAA陽(yáng)性判斷標(biāo)準(zhǔn)為在5. 8KD區(qū)帶位置出現(xiàn)清晰的顯色區(qū)帶。用SPSS8. 0統(tǒng)計(jì)軟件分析，各組間陽(yáng)性率比較采用卡方檢驗(yàn)。ELISA、RIA和IB法檢測(cè)45例TlDM患者IAA陽(yáng)性率分別為35. 56%、37. 78%和24. 44% ；檢測(cè)50例健康對(duì)照者假陽(yáng)性率分別為10. 00%, 8. 00%和0。三種檢測(cè)方法檢測(cè) IAA 對(duì) TlDM 的敏感性依次為 RIA (37. 78%) >ELISA (35. 56%) >IB (24. 44%)，其特異性為IB (100%) >RIA (92%) >ELISA (90%)，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，ELISA和RIA法檢測(cè)IAA的特異性和敏感性均無明顯差異(P>0. 05) ; IB法檢測(cè)IAA的敏感性明顯低于ELISA或RIA法(P〈0. 05)，其特異性明顯高于后兩種方法(P〈0. 05)，見表I。表1ELISA、RIA和本發(fā)明提供的試劑盒的檢測(cè)方法檢測(cè)TlDM患者IAA的結(jié)果比較(n, %)
權(quán)利要求
1.一種用于糖尿病自身抗體6項(xiàng)聯(lián)檢試劑盒，其特征在于，包括檢測(cè)印跡膜和標(biāo)準(zhǔn)帶； 所述檢測(cè)印跡膜依次包括起始帶、檢測(cè)帶和質(zhì)控帶；所述檢測(cè)帶轉(zhuǎn)印有胰島細(xì)胞抗原、酪氨酸磷酸酶抗原、谷氨酸脫羧酶抗原、鋅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白8抗原、羧基肽酶抗原、胰島素自身抗原； 所述標(biāo)準(zhǔn)帶的制備方法為取胰島細(xì)胞抗體、酪氨酸磷酸酶抗體、谷氨酸脫羧酶抗體、鋅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白8抗體、羧基肽酶抗體、胰島素自身抗體經(jīng)梯度不連續(xù)電泳后轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜，顯色后，獲得標(biāo)準(zhǔn)印跡膜，根據(jù)所述標(biāo)準(zhǔn)印跡膜上各陽(yáng)性區(qū)帶分別與起始帶、質(zhì)控帶的相對(duì)距離，獲得所述標(biāo)準(zhǔn)帶。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的用于糖尿病自身抗體6項(xiàng)聯(lián)檢試劑盒，其特征在于，所述標(biāo)準(zhǔn)帶與所述標(biāo)準(zhǔn)印跡膜中相應(yīng)陽(yáng)性區(qū)帶的誤差小于O. 5mm。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的用于糖尿病自身抗體6項(xiàng)聯(lián)檢試劑盒，其特征在于，還包括濃縮洗滌液、工作液、酶聯(lián)試劑和顯色液。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的用于糖尿病自身抗體6項(xiàng)聯(lián)檢試劑盒，其特征在于，還包括與所述檢測(cè)印跡膜相配合的反應(yīng)槽，所述反應(yīng)槽與所述檢測(cè)印跡膜可拆卸連接。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的用于糖尿病自身抗體6項(xiàng)聯(lián)檢試劑盒，其特征在于，所述檢測(cè)印跡膜的制備方法為取胰島細(xì)胞抗原、酪氨酸磷酸酶抗原、谷氨酸脫羧酶抗原、鋅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白8抗原、羧基肽酶抗原、胰島素自身抗原經(jīng)梯度不連續(xù)電泳后轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜，即得。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的用于糖尿病自身抗體6項(xiàng)聯(lián)檢試劑盒，其特征在于，所述酶聯(lián)試劑的制備方法為取磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、硫柳汞與水混合溶解，與小牛血清、酶標(biāo)記物混合后，加水稀釋，調(diào)節(jié)PH值為7. O 7. 4，混勻，即得； 所述酶標(biāo)記物為辣根過氧化物酶標(biāo)記抗人IgG (效價(jià)1:100)； 所述磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、硫柳汞的質(zhì)量比為20:1:1 ； 以g/mL/mL/mL計(jì)，所述磷酸二氫鉀與所述小牛血清、所述酶標(biāo)記物、所述酶聯(lián)試劑的質(zhì)量體積比為1:70:47:140。
7.根據(jù)權(quán)利要求3所述的用于糖尿病自身抗體6項(xiàng)聯(lián)檢試劑盒，其特征在于，所述顯色液的制備方法為取3，3’，5，5’ -四甲基聯(lián)苯胺與O. 02mol/L的pH值為5. O的磷酸鹽/檸檬酸緩沖液混合，與H2O2混合后，調(diào)節(jié)pH值為4. 8 5. 2，混勻，即得； 以g/mL/mL/計(jì)，所述3，3’，5，5’ -四甲基聯(lián)苯胺與磷酸鹽/檸檬酸緩沖液、H2O2的質(zhì)量體積比為O. 5:1000:0. I。
8.根據(jù)權(quán)利要求3所述的用于糖尿病自身抗體6項(xiàng)聯(lián)檢試劑盒，其特征在于，所述濃縮洗滌液的制備方法為取氯化鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀溶于水后，與吐溫-20混合，加水后調(diào)節(jié)PH值為7. O 7. 4，混勻，即得； 所述氯化鈉、所述磷酸氫二鈉、所述磷酸二氫鉀的質(zhì)量比為30:20:1 ; 以g/mL/mL/計(jì)，所述氯化鈉與所述吐溫-20、所述濃縮洗滌液的質(zhì)量體積比為9:5:70。
9.根據(jù)權(quán)利要求3所述的用于糖尿病自身抗體6項(xiàng)聯(lián)檢試劑盒，其特征在于，所述工作液的制備方法為取氯化鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀溶于水后，與小牛血清白蛋白混合，力口水后調(diào)節(jié)PH值為7. O 7. 4，混勻，即得； 所述氯化鈉、所述磷酸氫二鈉、所述磷酸二氫鉀、所述小牛血清白蛋白的質(zhì)量比為·90:60:3:10 ；以g/mL計(jì),所述氯化鈉與所述工作 液的體積比為9:1000。
全文摘要
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種用于糖尿病自身抗體6項(xiàng)聯(lián)檢試劑盒。該試劑盒對(duì)T1DM、T2DM和正常人血清中ICA、GADA、IAA、IA-2ACPH-A和ZnT8-A等6種抗體聯(lián)合檢測(cè)，對(duì)Ⅰ型糖尿病診斷有高度敏感性(可達(dá)98%)和特異性(可達(dá)99.6%)，為糖尿病的分型診斷提供高效、快捷的檢測(cè)手段。
文檔編號(hào)G01N33/531GK102967704SQ20121048657
公開日2013年3月13日 申請(qǐng)日期2012年11月26日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月26日
發(fā)明者馬偉民, 張永頂, 馬新民 申請(qǐng)人:深圳市伯勞特生物制品有限公司