本發(fā)明涉及食品測試技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種保健酒中總皂苷含量的測定方法。

背景技術(shù)：

保健酒已有數(shù)千年的歷史，是中國醫(yī)藥科學(xué)的重要組成部分。中國的歷代醫(yī)藥著作中幾乎無一例外地有藥酒治疾健身的記載。今天隨著科學(xué)技術(shù)的進(jìn)步，從中藥浸酒的傳統(tǒng)工藝的基礎(chǔ)上已發(fā)展到利用萃取、浸提和生物工程等現(xiàn)代化手段，提取中藥中的有效成份制成高含量的功能藥酒。當(dāng)人們的保健意識日趨增強(qiáng)，一些藥物成為食用保健品時(shí)，保健酒這一新名詞便開始出現(xiàn)。保健酒作為保健食品的一大類，是由基酒加中藥配制而成，具有抗疲勞，調(diào)節(jié)免疫力之功效，免疫調(diào)節(jié)的功效。保健酒將中藥功能與酒的作用有效結(jié)合，極大地增強(qiáng)了藥物的效能與作用，藥借酒勢，酒助藥威，迅速增強(qiáng)人體微循環(huán)(擴(kuò)張毛細(xì)血管)，使有效成份直達(dá)病所，諸多癥狀可迅速緩解或消失。保健酒的生物活性成份通常來自傳統(tǒng)中藥，特別是有滋補(bǔ)作用的中藥。全球市場上常見的保健酒有法國的廊酒(法語：Bénédictine)日本的養(yǎng)命酒，中國的勁酒和椰島的鹿龜酒。它們的共同特征是配方復(fù)雜(采用數(shù)十種中藥)，均聲稱有各樣保健功效。然而，由于成份過于復(fù)雜，如何有效的對其活性成份進(jìn)行定量和質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)是保健酒業(yè)面臨的巨大挑戰(zhàn)。以鹿龜酒為例，它是由人參、枸杞、熟地黃、當(dāng)歸、黃精、砂仁、肉桂等多位中藥材為原料經(jīng)浸提、調(diào)配、陳釀、過濾等工藝精制而成?？傇碥兆鳛楸＝【浦兄匾墓πС煞?，建立穩(wěn)定的總皂苷含量測定方法是保障產(chǎn)品品質(zhì)穩(wěn)定的基礎(chǔ)。“皂苷”是由甾體或三萜類化合物作為苷元與糖分子縮合而成的一類低聚糖苷，是一類廣泛存在于植物細(xì)胞內(nèi)的有機(jī)化合物，它具有調(diào)節(jié)腎臟功能，抗缺氧和抗疲勞、抗低溫應(yīng)激作用，抗脂質(zhì)氧化作用，抗致突變作用及雙向調(diào)節(jié)免疫的保健功能。

總皂苷的現(xiàn)有檢測標(biāo)準(zhǔn)為2003版《保健食品檢驗(yàn)與評價(jià)技術(shù)規(guī)范》，該法是針對保健食品中“總皂苷”含量測定的一個(gè)廣泛方法，其采用香草醛顯色劑測定總皂苷含量。但是，皂苷結(jié)構(gòu)中的糖基本身可與香草醛發(fā)生顯色反應(yīng)，保健酒中含有多種不同糖基數(shù)的皂苷致使與香草醛出現(xiàn)顯色結(jié)果差異。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

鑒以此，本發(fā)明的目的在于提出一種保健酒中總皂苷含量的測定方法，消除皂苷結(jié)構(gòu)中的糖基對香草醛顯色劑的干擾，從而達(dá)到準(zhǔn)確檢測保健酒樣中總皂苷含量的目的。

本發(fā)明的技術(shù)方案是這樣實(shí)現(xiàn)的：

一種保健酒中總皂苷含量的測定方法，包括以下步驟：

S1：校準(zhǔn)溶液的制備和顯色

S101水解：往乙腈和鹽酸的混合溶劑中加入人參皂苷Re甲醇溶液，混勻后于恒溫水浴條件下進(jìn)行水解；

S102萃取：水解產(chǎn)物冷卻后加入二氯甲烷和去離子水，水洗分離去掉水層，經(jīng)氮吹儀吹干有機(jī)相層；

S103校準(zhǔn)溶液配制：將萃取吹干后的產(chǎn)物用乙腈溶解和定容，得到人參皂苷苷元校準(zhǔn)溶液；

S104測定吸光度：取人參皂苷苷元校準(zhǔn)溶液加入到香草醛硫酸顯色中間溶液中，顯色體系中人參皂苷苷元校準(zhǔn)溶液的濃度記為C_標(biāo)，測定人參皂苷苷元校準(zhǔn)溶液的吸光度值，該吸光度值記為A_標(biāo)；

S2：酒樣溶液的制備和顯色

S201皂苷的提?。簩⒈＝【凭茦訐]干乙醇和水，所得固體用水溶解，將該溶液進(jìn)行固相萃取和洗脫，收集洗脫液，除去溶劑，所得固體用甲醇溶解，獲得酒樣皂苷甲醇溶液；

S202水解：往乙腈和鹽酸的混合溶劑中加入酒樣皂苷甲醇溶液，混勻后于恒溫水浴條件下進(jìn)行水解；

S203萃?。簩⑺猱a(chǎn)物冷卻后加入二氯甲烷和去離子水，水洗分離去掉水層，經(jīng)氮吹儀吹干有機(jī)相層；

S204酒樣溶液的配制：將萃取吹干后的產(chǎn)物用乙腈溶解并定容至V₁mL，得到酒樣苷元乙腈溶液；

S205測定吸光度：吸取V₂mL酒樣苷元乙腈溶液加入到V₃mL的香草醛硫酸顯色中間溶液中，測定酒樣苷元乙腈溶液的吸光度，該吸光度值記為A_樣；

S3：酒樣中總皂苷的含量計(jì)算

計(jì)算公式為：

式中，X表示酒樣中總皂苷的含量，單位為mg/100mL；A_標(biāo)表示紫外分光光度計(jì)測定的校準(zhǔn)溶液的吸光度值；A_樣表示紫外分光光度計(jì)測定的樣品吸光度值；C_標(biāo)表示顯色體系中校準(zhǔn)溶液的濃度，單位為μg/mL；946.55為人參皂苷Re的摩爾分子量，單位為g/mol；476.73為人參皂苷水解成苷元的摩爾分子量，單位為g/mol。

進(jìn)一步的，步驟S101和S202的水解過程中，恒溫水浴溫度為70～90℃，時(shí)間為1～5小時(shí)。

進(jìn)一步的，步驟S101和S202的水解過程中，乙腈和鹽酸的體積比為1:1。

進(jìn)一步的，步驟S101和S202的水解過程中使用的鹽酸還可以用硫酸或硝酸代替。

進(jìn)一步的，所述步驟S104的測定吸光度過程中，取人參皂苷苷元校準(zhǔn)溶液加入到香草醛硫酸顯色中間溶液中，渦旋混勻，得到校準(zhǔn)顯色組；同時(shí)吸取乙腈加入到香草醛硫酸顯色中間溶液中，渦旋混勻，得到溶劑空白顯色組；所得校準(zhǔn)顯色組和溶劑空白顯色組水浴加熱后迅速放入冰水中冷卻，后檢測溶液在最大吸收波長下的吸光度值。

進(jìn)一步的，所述步驟S201皂苷的提取過程中，將保健酒酒樣水浴揮干乙醇和水，所得固體用水溶解，將該溶液加入經(jīng)激活的萃取小柱中萃取，然后用去離子水洗滌，保持1～2滴/秒的速度洗滌，再用甲醇進(jìn)行洗脫，收集洗脫液，除去甲醇和水，所得固體用甲醇溶解，獲得酒樣皂苷甲醇溶液。

進(jìn)一步的，所述步驟S205的測定吸光度過程中，取酒樣苷元乙腈溶液加入到的香草醛硫酸顯色中間溶液中，混合均勻，所得混合物水浴加熱后迅速放入冰水中冷卻，后檢測溶液在最大吸收波長下的吸光度值。

進(jìn)一步的，測定過程中所使用到的甲醇還可以替換為水飽和正丁醇。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果為：

本發(fā)明提出的保健酒中總皂苷含量的測定方法采用皂苷酸水解顯色法測定保健酒中的總皂苷含量，將保健酒中的皂苷水解成苷元，消除了皂苷糖基對香草醛顯色劑的干擾，采用液液萃取方式提取苷元的同時(shí)除去了酒樣中的干擾色素。且以水解后的人參皂苷苷元制備標(biāo)準(zhǔn)曲線，本發(fā)明方法具有線性關(guān)系良好的優(yōu)點(diǎn)。本發(fā)明測定方法具有準(zhǔn)確度高、精確度好、重復(fù)性效果良好等優(yōu)點(diǎn)，因此非常適合用于保健酒中總皂苷含量的定量分析和質(zhì)量控制。

附圖說明

為了更清楚地說明本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案，下面將對實(shí)施例描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹。

圖1為本發(fā)明實(shí)施例中人參皂苷苷元標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。

圖中，橫坐標(biāo)為苷元標(biāo)準(zhǔn)曲線工作溶液顯色體系中的濃度，縱坐標(biāo)為吸光度。

具體實(shí)施方式

為對本發(fā)明中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述，顯然，發(fā)明人結(jié)合實(shí)施例進(jìn)行說明，但以下實(shí)施例所描述的僅僅是本發(fā)明一部分實(shí)施例，而不是全部的實(shí)施例。基于本發(fā)明中的實(shí)施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有做出創(chuàng)造性勞動(dòng)前提下所獲得的所有其他實(shí)施例，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。

儀器與試劑：

萊伯泰科UV2000型紫外分光光度計(jì)；十萬分之一分析天平(Mettler Toledo XS205DU)；萬分之一天平(Mettler Toledo AL204-IC)；漩渦混懸器(VELPZX3)；固相萃取儀(supelco 12管路)；隔膜真空泵(Ameritech AVP-7120)；氮吹儀(上海安譜DC-12)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海申順生物科技R-201)。

移液槍；塑料離心管；50ml圓底燒瓶；巴氏吸管；固相萃取柱(bond Elut-C18OH，500mg 3ml，50/PK，Agilent Technologies)。

香草醛(基準(zhǔn)試劑)二氯甲烷、甲醇、乙腈、硫酸、鹽酸為分析純。

77％硫酸溶液(v/v)；氯化氫水溶液(4mol/L)；70％甲醇水溶液(v/v)。

香草醛硫酸顯色中間液：準(zhǔn)確吸取8％香草醛甲醇溶液500μL加入3ml的77％硫酸溶液中，振蕩混合均勻，冷卻至室溫，現(xiàn)配現(xiàn)用。

供試品：保健酒A：海南椰島酒業(yè)發(fā)展有限公司提供。

對照品：人參皂苷Re：中國藥品生物制品檢定所。

本發(fā)明提出的一種保健酒中總皂苷含量的測定方法，包括以下步驟：

S1：校準(zhǔn)溶液的制備和顯色

S101水解：稱取人參皂苷Re適量(精確至0.0001克)，用甲醇定容，配制成3.6mg/mL人參皂苷Re甲醇溶液，然后移取500μL的乙腈于塑料離心管中，加入500μL鹽酸(4mol/L)，渦旋混勻得到水解溶劑，往水解溶劑中加入3.6mg/mL的人參皂苷Re甲醇溶液1mL，渦旋混勻后放入70～90℃恒溫水浴1～5小時(shí)，優(yōu)選為80℃恒溫水浴3小時(shí)。該水解過程中使用的鹽酸還可以用硫酸或硝酸等代替。

S102萃?。簩⑸鲜鏊猱a(chǎn)物冷卻后加入5mL的二氯甲烷和3mL的去離子水，有機(jī)相分別用3mL水洗兩遍，分離去掉水層(上層)，二氯甲烷有機(jī)相層經(jīng)氮吹儀吹干。

S103校準(zhǔn)溶液(苷元標(biāo)準(zhǔn)曲線工作溶液)配制：萃取后的產(chǎn)物用乙腈溶解和定容，得到濃度為0.068mg/mL、0.136mg/mL、0.272mg/mL、0.544mg/mL和0.907mg/mL的人參皂苷苷元校準(zhǔn)溶液(苷元標(biāo)準(zhǔn)曲線工作溶液)，現(xiàn)配現(xiàn)用。

S104測定吸光度：分別吸取濃度為0.068mg/mL、0.136mg/mL、0.272mg/mL、0.544mg/mL和0.907mg/mL的苷元標(biāo)準(zhǔn)曲線工作溶液各0.5mL加入到4.5mL香草醛硫酸顯色中間溶液中，該顯色體系中人參皂苷苷元校準(zhǔn)溶液的濃度記為C_標(biāo)，渦旋混勻，得到5組校準(zhǔn)顯色組；同時(shí)吸取0.5mL的乙腈加入到4.5mL的香草醛硫酸顯色中間溶液中，渦旋混勻，得到溶劑空白顯色組；所得校準(zhǔn)顯色組和溶劑空白顯色組于70℃水浴加熱10分鐘后迅速放入冰水中冷卻30秒，檢測溶液在541nm(掃描最大吸收波長)波長下的吸光度,每個(gè)樣品平行測定二次，求平均值(該吸光度為A_標(biāo))。

S2：酒樣溶液的制備和顯色

S201皂苷的提取：吸取1.0mL保健酒A于瓷蒸發(fā)皿中，水浴揮干乙醇和水，所得固體用1mL水溶解，備用。將此樣品溶液加入經(jīng)激活的萃取小柱中，然后用6mL去離子水洗滌，保持1-2滴/秒的速度除去樣品中的游離糖類等水溶性雜質(zhì)，再分別用70％甲醇水溶液(6mL)和甲醇(10mL)進(jìn)行洗脫，收集洗脫液于圓底燒瓶中，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上旋去甲醇和水，所得固體用甲醇1mL溶解備用，稱為酒樣皂苷甲醇溶液。

S202水解：移取500μL的乙腈于15mL塑料離心管中，加入鹽酸(4mol/L)500μL，渦旋混勻得到水解溶劑。加入上述酒樣皂苷甲醇溶液1mL，渦旋混勻后放入80℃恒溫水浴3小時(shí)。

S203萃?。簩⑸鲜鏊猱a(chǎn)物冷卻至室溫后加入5mL的二氯甲烷和3mL的去離子水，有機(jī)相分別用3mL水洗兩遍，分離去掉水層(上層)，二氯甲烷有機(jī)相層經(jīng)氮吹儀吹干。

S204酒樣溶液的配制：將萃取吹干后的產(chǎn)物用乙腈溶解并定容至2mL，得到酒樣苷元乙腈溶液；

S205測定吸光度：吸取0.5mL酒樣苷元乙腈溶液加入到4.5mL的香草醛硫酸顯色中間溶液中，混合均勻，所得混合物于70℃水浴加熱10分鐘后迅速放入冰水中冷卻30秒，檢測溶液在541nm(掃描最大吸收波長)波長下的吸光度，每個(gè)樣品平行測定二次，求平均值(該吸光度為A_樣)。

S3：酒樣中總皂苷的含量計(jì)算

計(jì)算公式為：

式中，

X表示酒樣中總皂苷的含量，單位為mg/100mL；

A_標(biāo)表示紫外分光光度計(jì)測定的校準(zhǔn)溶液的吸光度值；

A_樣表示紫外分光光度計(jì)測定的樣品吸光度值；

C_標(biāo)表示顯色體系中校準(zhǔn)溶液的濃度，單位為μg/mL；

946.55為人參皂苷Re的摩爾分子量，單位為g/mol；

476.73為人參皂苷水解成苷元的摩爾分子量，單位為g/mol；

V₁為步驟S204酒樣溶液的配制過程中酒樣苷元乙腈溶液的定容體積，單位為mL；

V₂為步驟S205測定吸光度過程中吸取酒樣苷元乙腈溶液的體積，單位為mL；

V₃為步驟S205測定吸光度過程中香草醛硫酸顯色中間溶液的體積，單位為mL。

即，上述實(shí)施例中酒樣A的計(jì)算公式為：

此外，上述測定方法在測定過程中使用到的甲醇溶劑還可以替換為水飽和正丁醇溶劑。

方法學(xué)驗(yàn)證

(1)線性關(guān)系考察

步驟S104中的苷元標(biāo)準(zhǔn)曲線工作溶液顯色體系中，不同濃度的苷元標(biāo)準(zhǔn)曲線工作溶液的吸光度如表1所示：

表1線性關(guān)系試驗(yàn)結(jié)果

以步驟S104中的苷元標(biāo)準(zhǔn)曲線工作溶液顯色體系中的濃度(6.8μg/mL、13.6μg/mL、27.2μg/mL、54.4μg/mL、90.7μg/mL)為橫坐標(biāo)，測定的吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1人參皂苷苷元標(biāo)準(zhǔn)曲線所示。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，人參皂苷苷元在6.8～90.7μg/mL濃度內(nèi)呈良好線性關(guān)系。線性回歸方程為y＝0.011x+0.012，線性相關(guān)系數(shù)R為0.9996，R為標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性相關(guān)系數(shù)，相關(guān)系數(shù)越接近于1，線性相關(guān)性質(zhì)越好，根據(jù)數(shù)據(jù)描點(diǎn)畫出的函數(shù)-自變量圖線越趨近于一條平直線，擬合的直線與描點(diǎn)所得圖線也更接近。

(2)精密度考察

吸取0.136mg/mL的人參皂苷苷元溶液500μL，按照步驟S205操作顯色并測定吸光度(顯色液中苷元濃度為13.6μg/mL)，重復(fù)測定6次，測定相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD值)，精密度試驗(yàn)結(jié)果如表2所示：

表2精密度試驗(yàn)結(jié)果(n＝6)

由表2精密度試驗(yàn)結(jié)果可見，6次測定的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD值為0.579％，說明酸水解皂苷顯色法測定皂苷含量精密度較好。

(3)重復(fù)性考察

取試樣1.0毫升保健酒A，按照步驟S201至步驟S205處理及顯色，平行處理6份測定吸光度，測定RSD值，測驗(yàn)結(jié)果如表3所示：

表3重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果(n＝6)

由表3重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果可見，平行處理6份樣品測定皂苷含量，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD值為2.25％，說明酸水解皂苷顯色法測定總皂苷含量方法重復(fù)性較好。

(4)穩(wěn)定性考察

吸取0.136mg/ml的苷元標(biāo)準(zhǔn)曲線工作溶液500μl，按照步驟S205操作顯色，在指定時(shí)間間隔下(30min)觀察吸光度值的變化，測定RSD值，測驗(yàn)結(jié)果如表4所示：

表4穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果(n＝10)

由表4穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果可見，供試樣品10次測定吸光度值的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD值為0.634％，說明供試品在0.5h內(nèi)較穩(wěn)定。

(5)加標(biāo)回收試驗(yàn)

取保健酒A1.0mL，按照步驟S201至步驟S205操作處理和顯色測定，測定保健酒A中總皂苷的含量，平行測定2次，即對照樣品1和2。

吸取人參皂苷Re標(biāo)準(zhǔn)溶液(3.6mg/mL)1.5mL于10mL的容量瓶中，用保健酒A定容至刻度，獲得加標(biāo)樣品，吸取3份加標(biāo)樣品1mL于100ml的瓷蒸發(fā)皿中，水浴揮干乙醇和水，用1mL去離子水溶解，按照步驟S201至步驟S205操作處理和顯色測定，平行測定2次。

測定加標(biāo)樣品的總皂苷含量并計(jì)算加標(biāo)回收率(加標(biāo)樣品的測量值減去樣品的測定值再除以加標(biāo)量，即加標(biāo)回收率)，加標(biāo)回收試驗(yàn)結(jié)果如表5所示：

表5加標(biāo)回收試驗(yàn)結(jié)果

由表5加標(biāo)回收試驗(yàn)結(jié)果可見，加標(biāo)樣品平行處理6份，測定平均加標(biāo)回收率為99.15％，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD值為1.91％，說明酸水解皂苷顯色法測定皂苷含量的準(zhǔn)確度較好。

綜上所述，本發(fā)明將保健酒A中的皂苷水解成苷元，消除了糖基對香草醛顯色劑的干擾，采用液液萃取方式提取苷元的同時(shí)除去了酒樣中的干擾色素，采用皂苷酸水解顯色法測定保健酒A中的總皂苷含量，以水解后的人參皂苷苷元制備標(biāo)準(zhǔn)曲線。本發(fā)明測定方法具有范圍線性范圍良好、準(zhǔn)確度高、精確度好、重復(fù)性效果良好等優(yōu)點(diǎn)，因此非常適合用于保健酒中總皂苷含量的定量分析和質(zhì)量控制，適合于保健酒產(chǎn)業(yè)領(lǐng)域推廣。

以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。