一種快速檢測(cè)皂苷含量的方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種快速檢測(cè)皂苷含量的方法，采用衰減全反射-紫外可見光譜儀測(cè)量柱層析過程中上樣流出液、水洗流出液、洗脫液等多種液體的光譜圖，用化學(xué)計(jì)量學(xué)方法建立皂苷含量和光譜圖的定量模型，在分析待測(cè)樣品時(shí)，直接掃描未知濃度層析流出液的紫外-可見光光譜圖，然后將光譜圖數(shù)據(jù)輸入定量模型中，計(jì)算得到層析流出液中的皂苷含量值。該方法簡(jiǎn)單快速，無污染，樣品不需要稀釋或者過濾，可用于柱層析過程不同流出液中皂苷含量的快速測(cè)定，有助于監(jiān)控柱層析過程，提高過程質(zhì)量控制水平。
【專利說明】一種快速檢測(cè)皂苷含量的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于醫(yī)藥領(lǐng)域，特別涉及一種快速檢測(cè)皂苷含量的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]皂苷類成分廣泛存在于五加科、豆科、遠(yuǎn)志科、葫蘆科、薯蕷科、百合科和玄參科的植物中，具有擴(kuò)張血管、降低心肌耗氧量、延長凝血時(shí)間、調(diào)血脂、清除自由基、抗炎、抗氧化、解熱、鎮(zhèn)靜和抗癌等多種藥理作用。皂苷類成分也是諸如人參和三七等多種名貴藥材的主要有效成分。近年來，以皂苷為主要活性成分的中藥制劑在心腦血管疾病、糖尿病等慢性疾病的治療中取得了良好效果。
[0003]柱層析工藝是精制皂苷的常用工藝，所得產(chǎn)物具有雜質(zhì)少、色素少、總皂苷含量高等優(yōu)點(diǎn)，有利于降低病人用藥劑量，減少不良反應(yīng)。柱層析往往是生產(chǎn)中的關(guān)鍵工藝，對(duì)藥品質(zhì)量影響較大，具有耗時(shí)長，影響因素多，控制難度大等特點(diǎn)。目前的柱層析工藝多以大孔樹脂為分離材料，主要包括上樣、水洗、洗脫、再生等四個(gè)基本工序。上樣、水洗和洗脫等3個(gè)工序都具有明顯的除雜能力。但如果控制不當(dāng)，上樣流出液和水洗流出液中都可能會(huì)出現(xiàn)皂苷損失；洗脫工序則可能出現(xiàn)皂苷沒有完全洗脫等不良生產(chǎn)狀況。因此，為了減少皂苷損失，提高生產(chǎn)效率，有必要快速檢測(cè)柱層析過程流出液中的皂苷含量，以準(zhǔn)確判斷各個(gè)工序的終點(diǎn)。
[0004]目前常用的皂苷檢測(cè)方法有高效液相色譜法、毛細(xì)管電泳法、近紅外光譜法和紫外光譜法等。其中高效液相色譜法分析時(shí)間較長，毛細(xì)管電泳法穩(wěn)定性較差。另外，高效液相色譜法、毛細(xì)管電泳法和近紅外光譜法設(shè)備昂貴。相比近紅外光譜，紫外光譜意義相對(duì)明確。常規(guī)的紫外-可見光譜設(shè)備具有價(jià)格較低，分析速度快等優(yōu)點(diǎn)。但由于此范圍內(nèi)的光波穿透性能弱，在一般的生產(chǎn)過程流出液中吸收值太高，無法用于測(cè)定液體中成分的濃度。稀釋法和降低光程法是兩種常用于減少紫外光譜吸收值的方法。稀釋法的弊端在于使設(shè)備或者步驟變得復(fù)雜，而且在結(jié)果中引入了稀釋誤差。降低光程法要求比色皿中液體厚度變薄，但是薄了之后很容易造成堵塞，同時(shí)液體對(duì)比色皿的腐蝕對(duì)光程的影響也會(huì)變大。
[0005]衰減全反射-紫外可見光譜(ATR-UV)技術(shù)通過測(cè)定反射光譜的強(qiáng)度獲得樣品溶液信息，提供了一種解決困難的新思路。衰減全反射-紫外可見光譜技術(shù)測(cè)定溶液中成分的濃度可以達(dá)到普通紫外-可見分光光度法測(cè)定成分濃度的1000倍以上。由于具備分析時(shí)間短，設(shè)備成本低，光譜意義相對(duì)明確，無需稀釋，不受液體中小顆粒影響等多個(gè)優(yōu)點(diǎn)，衰減全反射-紫外可見光譜技術(shù)非常適合用于快速檢測(cè)大孔樹脂柱層析過程流出液中的皂苷含量。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明針對(duì)常規(guī)技術(shù)存在的不足，結(jié)合衰減全反射-紫外可見光譜技術(shù)的特點(diǎn)，提供一種快速檢測(cè)皂苷含量的方法，是一種快速檢測(cè)層析過程中皂苷含量的方法，通過以下步驟實(shí)現(xiàn):(1)測(cè)定層析過程流出液校正集樣本中的皂苷含量
采用高效液相色譜法測(cè)定層析過程中上樣流出液、水洗流出液和乙醇洗脫液校正集樣本的皂苷含量；色譜條件:色譜柱為Waters ACQUITY CSH C18 (50 mmX2.1 mm 1.d.，1.7Mm);流動(dòng)相:0.01 %甲酸水(A)-0.01 %甲酸乙腈(B)，線性梯度洗脫程序:0 min 19 % B,6 min 20 % B, 8.5 min 31 % B, 11 min 33 % B, 17 min 90 % B,運(yùn)行 19 min ;流速:0.35ml/min ;檢測(cè)波長:203 nm ;柱溫:40 °C ;進(jìn)樣量:5 μ?。按外標(biāo)兩點(diǎn)法方程計(jì)算含量。
[0007]對(duì)照品溶液的制備:取三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1、人參皂苷Rd 5種對(duì)照品或人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1 3種對(duì)照品適量，精密稱定，加70 %甲醇-水溶液(ν/ν)溶解,制成每I ml約含各對(duì)照品為0.3 mg/ml和0.03 mg/ml的混合對(duì)照品溶液1、2，于4°C保存。臨用時(shí)10000 rpm離心10 min，取上清液備用。
[0008]供試品溶液的制備:分別將上樣流出液、水洗流出液和洗脫液樣品過濾，取續(xù)濾液，備用。精密量取續(xù)濾液適量加70 %甲醇-水溶液(ν/ν)成適當(dāng)濃度，混勻，10000 rpm離心10 min，取上清液，即為供試品溶液。
[0009](2)紫外掃描得到校正集樣本的紫外-可見光譜圖
取層析過程中獲取的上樣流出液、水洗流出液和洗脫液樣品，直接用衰減全反射-紫外可見光譜儀進(jìn)行掃描，掃描的光譜區(qū)間是190nm~800nm，分辨率為0.1nm-1nm,光譜掃描三次之后，取平均值作為校正集樣本。
[0010](3)采用偏最小二乘法或者主成分回歸法分別對(duì)上樣和水洗流出液、乙醇洗脫液構(gòu)建定量模型
使用Simca、Unscrambler或者M(jìn)initab軟件處理數(shù)據(jù)，在構(gòu)建光譜圖和阜苷含量定量模型時(shí)使用的方法是偏最小二乘法或者主成分回歸法，使用交叉驗(yàn)證法確定最佳主成分?jǐn)?shù)，當(dāng)定量模型的相關(guān)系數(shù)到0.9以上時(shí)，認(rèn)為模型已經(jīng)建立完成。
[0011](4)層析過程流出液中皂苷含量的快速測(cè)定
將光纖探頭裝于層析柱出口管路，直接掃描未知濃度的層析過程流出液的光譜圖，層析過程流出液包括上樣流出液、水洗流出液和洗脫液，紫外掃描的光譜范圍和分辨率要求和建立標(biāo)準(zhǔn)集樣本時(shí)相同，將光譜數(shù)據(jù)代入構(gòu)建的定量模型中，作為預(yù)測(cè)集，就可以得到層析過程流出液中皂苷的含量。其中溶劑為水的流出液適用于采用上樣流出液和水洗流出液構(gòu)建的定量模型；溶劑為乙醇水溶液的洗脫液適用于采用洗脫液構(gòu)建的定量模型。
[0012]本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供所述方法在快速檢測(cè)皂苷含量中的應(yīng)用。
[0013]本發(fā)明提供了一種快速檢測(cè)柱層析過程流出液中皂苷含量的方法。該方法采用衰減全反射-紫外可見光譜儀測(cè)量柱層析過程中上樣流出液、水洗流出液、洗脫液等多種液體的光譜圖，并使用化學(xué)計(jì)量學(xué)方法建立皂苷含量和光譜圖的定量模型，計(jì)算得到皂苷含量。該方法首先收集柱層析過程中上樣流出液、水洗流出液和洗脫液作為校正集樣本，然后掃描得到校正集樣本的紫外-可見光譜圖作為標(biāo)準(zhǔn)光譜圖，再使用液相色譜法檢測(cè)得到校正集樣本中皂苷的含量，最后建立紫外-可見光光譜圖和皂苷含量之間的定量模型。在分析待測(cè)樣品時(shí)，直接掃描未知濃度層析流出液的紫外-可見光光譜圖，然后將光譜圖數(shù)據(jù)輸入定量模型中，計(jì)算得到層析流出液中的皂苷含量值。該測(cè)量方法簡(jiǎn)單快速，無污染，樣品不需要稀釋或者過濾，可用于柱層析過程不同流出液中皂苷含量的快速測(cè)定，有助于監(jiān)控柱層析過程，提高過程質(zhì)量控制水平。本發(fā)明的方法操作過程簡(jiǎn)單、快速，樣品溶液無需稀釋或者過濾，所需設(shè)備為衰減全反射-紫外可見光譜儀，定量模型構(gòu)建完畢后，無需專業(yè)背景的人員也可完成定量分析過程，因此，可以很好地在中藥生產(chǎn)企業(yè)進(jìn)行推廣，作為柱層析過程質(zhì)量控制的一種手段。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0014]圖1是三七層析流出液光譜擬合效果。
[0015]圖2是采用衰減全反射-紫外可見光譜計(jì)算得到的上樣出口液皂苷濃度曲線。
[0016]圖3是采用衰減全反射-紫外可見光譜計(jì)算得到的水洗出口液皂苷濃度曲線。
[0017]圖4是采用衰減全反射-紫外可見光譜計(jì)算得到的的洗脫液皂苷濃度曲線。
[0018]圖5是人參層析流出液光譜擬合效果。
[0019]圖6是采用衰減全反射-紫外可見光譜計(jì)算得到的上樣出口液皂苷濃度曲線。
[0020]圖7是采用衰減全反射-紫外可見光譜計(jì)算得到的水洗出口液皂苷濃度曲線。
[0021]圖8是采用衰減全反射-紫外可見光譜計(jì)算得到的洗脫液皂苷濃度曲線。
[0022]圖9是西洋參層析流出液光譜擬合效果。
[0023]圖10是采用衰減全反射-紫外可見光譜計(jì)算得到的西洋參皂苷上樣出口液皂苷濃度曲線。
[0024]圖11是采用衰減全反射-紫外可見光譜計(jì)算得到的西洋參皂苷水洗出口液皂苷濃度曲線。
[0025]圖12是采用衰減全反射-紫外可見光譜計(jì)算得到的西洋參皂苷洗脫液皂苷濃度曲線。
【具體實(shí)施方式】
[0026]本發(fā)明結(jié)合附圖和實(shí)施例作進(jìn)一步的說明。
[0027]實(shí)施例1
取三七藥材15kg，分別用80%(v/v)的乙醇70L回流提取3次，每次6小時(shí)。合并提取液后減壓濃縮至濃縮液密度為1.15g/ml。一邊攪拌，一邊在濃縮液中加入5倍體積的水，靜置48h后過濾得到上清液用于柱層析。層析柱高150cm，內(nèi)徑12cm，裝填DlOl大孔樹脂8公斤。上清液以1.5BV/h的流速上樣，同時(shí)收集層析柱出口處不同時(shí)刻的流出液作為上樣流出液樣品。上樣6BV后停止，改用水沖洗層析柱。水沖洗流速為2BV/h，水體積為10BV。水沖洗時(shí)收集不同時(shí)刻層析柱出口處的流出液作為水洗流出液樣品。水沖洗結(jié)束后改用80%(ν/ν)的乙醇對(duì)層析柱進(jìn)行洗脫，洗脫時(shí)乙醇流速為lBV/h，洗脫體積為5BV。乙醇洗脫時(shí)收集不同時(shí)刻層析柱出口處的流出液作為洗脫液樣品。
[0028]采用液相色譜法測(cè)定上樣流出液、水洗流出液和洗脫液樣品中的皂苷含量。液相色譜分析為:色譜柱為 Waters ACQUITY CSH C18 (50 mmX2.1 mm 1.d.，1.7 Mm);流動(dòng)相:
0.01 %甲酸水(A)-0.01 %甲酸乙腈(B)，線性梯度洗脫程序:0 min 19 % B, 6 min 20 %B, 8.5 min 31 % B, 11 min 33 % B, 17 min 90 % B,運(yùn)行 19 min ;流速:0.35 ml/min ;檢測(cè)波長:203 nm ;柱溫:40 V ;進(jìn)樣量:5 μ?。
[0029]對(duì)照品溶液的制備:取三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1、人參皂苷Rd對(duì)照品適量，精密稱定，加70 %甲醇-水溶液(ν/ν)溶解，制成每I ml約含三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1、人參皂苷Rd對(duì)照品為0.3 mg/ml和0.03mg/ml的混合對(duì)照品溶液1、2，于4°C保存。臨用時(shí)10000 rpm離心10 min,取上清液備用。
[0030]供試品溶液的制備:分別將上樣流出液、水洗流出液和洗脫液樣品過濾，取續(xù)濾液，備用。精密量取續(xù)濾液適量加70 %甲醇-水溶液(ν/ν)成適當(dāng)濃度，混勻，10000 rpm離心10 min，取上清液，即為供試品溶液。
[0031]含量測(cè)定:分別精密吸取混合對(duì)照品溶液1、2和供試品溶液各5 μ?，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，按外標(biāo)兩點(diǎn)法方程計(jì)算三七層析上樣流出液、水洗流出液和洗脫液中5種皂苷含量，作為參比數(shù)據(jù)。
[0032]取三七柱層析過程中獲取的上樣流出液、水洗流出液和洗脫液樣品，直接用衰減全反射-紫外可見光譜儀進(jìn)行掃描。掃描的光譜區(qū)間是190nm~800nm，分辨率為
0.lnm-lnm。光譜掃描三次之后，取平均值作為校正集樣本。
[0033]使用Simca軟件分別處理上樣和水洗流出液、乙醇洗脫液數(shù)據(jù)。在構(gòu)建光譜圖和5種皂苷含量定量模型時(shí)使用的方法是主成分回歸法。使用交叉驗(yàn)證法確定最佳主成分?jǐn)?shù)。當(dāng)定量模型的相關(guān)系數(shù)到0.9以上時(shí)，認(rèn)為模型已經(jīng)建立完成。模型建立的效果參見圖1，可以看到計(jì)算值和實(shí)驗(yàn)值符合良好。
[0034]用之前得到的上清液進(jìn)行另一次層析。層析柱高160cm，內(nèi)徑15cm，裝填DlOl大孔樹脂7公斤。將衰減全反射-紫外可見光譜儀探頭接在層析柱出口管路上。上清液以
1.2BV/h的流速上樣，開動(dòng)光譜儀采集上樣流出液光譜。上樣5BV后停止，改用水沖洗層析柱。水沖洗流速為2.5BV/ h，水體積為5BV。水沖洗時(shí)開動(dòng)光譜儀采集水洗流出液光譜。水沖洗結(jié)束后改用70%(v/v)的乙醇對(duì)層析柱進(jìn)行洗脫，洗脫時(shí)乙醇流速為lBV/h，洗脫體積為5BV。乙醇洗脫時(shí)開動(dòng)光譜儀采集洗脫液光譜。采集上樣流出液、水洗流出液和洗脫液光譜時(shí)掃描的光譜范圍和分辨率要求和建立標(biāo)準(zhǔn)集樣本時(shí)相同。將光譜數(shù)據(jù)代入構(gòu)建的定量模型中，作為預(yù)測(cè)集，就可以得到上樣流出液、水洗流出液和洗脫液中5種皂苷的含量。檢測(cè)得到的皂苷濃度參見圖2-圖4。
[0035]實(shí)施例2
取人參藥材15kg，分別用80%(v/v)的乙醇60L回流提取3次，每次6小時(shí)。合并提取液后減壓濃縮至濃縮液密度為1.10g/ml。一邊攪拌，一邊在濃縮液中加入5倍體積的水，靜置24h后過濾得到上清液用于柱層析。層析柱高150cm，內(nèi)徑12cm，裝填HPDlOO大孔樹脂7公斤。上清液以1.5BV/h的流速上樣，同時(shí)收集層析柱出口處不同時(shí)刻的流出液作為上樣流出液樣品。上樣6BV后停止，改用水沖洗層析柱。水沖洗流速為2BV/h，水體積為10BV。水沖洗時(shí)收集不同時(shí)刻層析柱出口處的流出液作為水洗流出液樣品。水沖洗結(jié)束后改用80%(ν/ν)的乙醇對(duì)層析柱進(jìn)行洗脫，洗脫時(shí)乙醇流速為lBV/h，洗脫體積為5BV。乙醇洗脫時(shí)收集不同時(shí)刻層析柱出口處的流出液作為洗脫液樣品。
[0036]采用液相色譜法測(cè)定上樣流出液、水洗流出液和洗脫液樣品中的皂苷含量。液相色譜分析條件為:色譜柱為 Waters ACQUITY CSH C18 (50 mmX2.1 mm 1.d.,1.7 Mm);流動(dòng)相:0.01 %甲酸水(A)-0.01 %甲酸乙腈(B)，線性梯度洗脫程序:0 min 19 % B, 6 min20 % B, 8.5 min 31 % B, 11 min 33 % B, 17 min 90 % B,運(yùn)行 19 min ;流速:0.35 ml/min ;檢測(cè)波長:203 nm ;柱溫:40 V ;進(jìn)樣量:5 μ?。
[0037]對(duì)照品溶液的制備:取人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1對(duì)照品適量，精密稱定，加70 %甲醇-水溶液(ν/ν)溶解，制成每I ml約含人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷RbJi照品為0.3 mg/ml和0.03 mg/ml的混合對(duì)照品溶液1、2，于4°C保存。臨用時(shí)10000 rpm離心10 min,取上清液備用。
[0038]供試品溶液的制備:分別將上樣流出液、水洗流出液和洗脫液樣品過濾，取續(xù)濾液，備用。精密量取續(xù)濾液適量加70 %甲醇-水溶液(ν/ν)成適當(dāng)濃度，混勻，10000 rpm離心10 min，取上清液，即為供試品溶液。
[0039]含量測(cè)定:分別精密吸取混合對(duì)照品溶液1、2和供試品溶液各5 μ?，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，按外標(biāo)兩點(diǎn)法方程計(jì)算人參或西洋參層析上樣流出液、水洗流出液和洗脫液中3種皂苷含量，作為參比數(shù)據(jù)。
[0040]取人參柱層析過程中獲取的上樣流出液、水洗流出液和洗脫液樣品，直接用衰減全反射-紫外可見光譜儀進(jìn)行掃描。掃描的光譜區(qū)間是190nm~800nm，分辨率為
0.lnm-lnm。光譜掃描三次之后，取平均值作為校正集樣本。
[0041]使用Unscrambler軟件分別處理上樣和水洗流出液、乙醇洗脫液數(shù)據(jù)。在構(gòu)建光譜圖和3種皂苷含量定量模型時(shí)使用的方法是偏最小二乘法。使用交叉驗(yàn)證法確定最佳主成分?jǐn)?shù)。當(dāng)定量模型的相關(guān)系數(shù)到0.9以上時(shí)，認(rèn)為模型已經(jīng)建立完成。模型建立的效果參見圖5，可以看到計(jì)算值和實(shí)驗(yàn)值符合良好。
[0042]用之前得到的上清液進(jìn)行另一次層析。層析柱高160cm，內(nèi)徑15cm，裝填HPD100大孔樹脂7公斤。將衰減全反射-紫外可見光譜儀探頭接在層析柱出口管路上。上清液以
1.2BV/h的流速上樣，開動(dòng)光譜儀采集上樣流出液光譜。上樣5BV后停止，改用水沖洗層析柱。水沖洗流速為3BV/h，水體積為9BV。水沖洗時(shí)開動(dòng)光譜儀采集水洗流出液光譜。水沖洗結(jié)束后改用70%(v/v)的乙醇對(duì)層析柱進(jìn)行洗脫，洗脫時(shí)乙醇流速為lBV/h，洗脫體積為5BV。乙醇洗脫時(shí)開動(dòng)光譜儀采集洗脫液光譜。采集上樣流出液、水洗流出液和洗脫液光譜時(shí)掃描的光譜范圍和分辨率要求和建立標(biāo)準(zhǔn)集樣本時(shí)相同。將光譜數(shù)據(jù)代入構(gòu)建的定量模型中，作為預(yù)測(cè)集，就可以得到上樣流出液、水洗流出液和洗脫液中3種皂苷的含量。其中溶劑為水的上樣和水洗流出液適用于采用上樣和水洗流出液構(gòu)建的定量模型；溶劑為乙醇水溶液的洗脫液適用于采用洗脫液構(gòu)建的定量模型。檢測(cè)得到的皂苷濃度參見圖6-8。
[0043]實(shí)施例3
取西洋參藥材15kg，分別用80%(ν/ν)的乙醇60L回流提取3次，每次6小時(shí)。合并提取液后減壓濃縮至濃縮液密度為1.10g/ml。一邊攪拌，一邊在濃縮液中加入5倍體積的水，靜置24h后過濾得到上清液用于柱層析。層析柱高150cm，內(nèi)徑12cm，裝填DlOl大孔樹脂7公斤。上清液以1.5BV/h的流速上樣，同時(shí)收集層析柱出口處不同時(shí)刻的流出液作為上樣流出液樣品。上樣6BV后停止，改用水沖洗層析柱。水沖洗流速為2BV/h，水體積為10BV。水沖洗時(shí)收集不同時(shí)刻層析柱出口處的流出液作為水洗流出液樣品。水沖洗結(jié)束后改用60%(ν/ν)的乙醇對(duì)層析柱進(jìn)行洗脫，洗脫時(shí)乙醇流速為lBV/h，洗脫體積為5BV。乙醇洗脫時(shí)收集不同時(shí)刻層析柱出口處的流出液作為洗脫液樣品。
[0044]采用液相色譜法測(cè)定上樣流出液、水洗流出液和洗脫液樣品中的皂苷含量。液相色譜分析條件包為:
色譜柱為 Waters A CQUITY CSH C18 (50 mmX2.1 mm 1.d.，1.7 Mm);流動(dòng)相:0.01 %甲酸水(A)-0.01 %甲酸乙腈(B)，線性梯度洗脫程序:0 min 19% B,6 min 20 % B,8.5min 31% B, 11 min 33% B, 17 min 90 % B,運(yùn)行19 min ;流速:0.35 ml/min ;檢測(cè)波長:203 nm ;柱溫:40 V ;進(jìn)樣量:5 μ?。
[0045]對(duì)照品溶液的制備:取人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1對(duì)照品適量，精密稱定，加70 %甲醇-水溶液(ν/ν)溶解，制成每I ml約含人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷RbJi照品為0.3 mg/ml和0.03 mg/ml的混合對(duì)照品溶液1、2，于4°C保存。臨用時(shí)10000 rpm離心10 min,取上清液備用。
[0046]供試品溶液的制備:分別將上樣流出液、水洗流出液和洗脫液樣品過濾，取續(xù)濾液，備用。精密量取續(xù)濾液適量加70 %甲醇-水溶液(ν/ν)成適當(dāng)濃度，混勻，10000 rpm離心10 min，取上清液，即為供試品溶液。
[0047]含量測(cè)定:分別精密吸取混合對(duì)照品溶液1、2和供試品溶液各5 μ?，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，按外標(biāo)兩點(diǎn)法方程計(jì)算人參或西洋參層析上樣流出液、水洗流出液和洗脫液中3種皂苷含量，作為參比數(shù)據(jù)。
[0048]取西洋參柱層析過程中獲取的上樣流出液、水洗流出液和洗脫液樣品，直接用衰減全反射-紫外可見光譜儀進(jìn)行掃描。掃描的光譜區(qū)間是190nm~800nm，分辨率為
0.lnm-lnm。光譜掃描三次之后，取平均值作為校正集樣本。
[0049]使用Minitab軟件分別處理上樣和水洗流出液、乙醇洗脫液數(shù)據(jù)。在構(gòu)建光譜圖和3種皂苷含量定量模型時(shí)使用的方法是主成分回歸法。使用交叉驗(yàn)證法確定最佳主成分?jǐn)?shù)。當(dāng)定量模型的相關(guān)系數(shù)到0.9以上時(shí)，認(rèn)為模型已經(jīng)建立完成。模型建立的效果參見圖9，可以看到計(jì)算值和實(shí)驗(yàn)值符合良好。
[0050]用之前得到的上清液進(jìn)行另一次層析。層析柱高160cm，內(nèi)徑15cm，裝填DlOl大孔樹脂7公斤。將衰減全反射-紫外可見光譜儀探頭接在層析柱出口管路上。上清液以
1.2BV/h的流速上樣，開動(dòng)光譜儀采集上樣流出液光譜。上樣5BV后停止，改用水沖洗層析柱。水沖洗流速為3BV/h，水體積為9BV。水沖洗時(shí)開動(dòng)光譜儀采集水洗流出液光譜。水沖洗結(jié)束后改用70%(v/v)的乙醇對(duì)層析柱進(jìn)行洗脫，洗脫時(shí)乙醇流速為lBV/h，洗脫體積為5BV。乙醇洗脫時(shí)開動(dòng)光譜儀采集洗脫液光譜。采集上樣流出液、水洗流出液和洗脫液光譜時(shí)掃描的光譜范圍和分辨率要求和建立標(biāo)準(zhǔn)集樣本時(shí)相同。將光譜數(shù)據(jù)代入構(gòu)建的定量模型中，作為預(yù)測(cè)集，就可以得到上樣流出液、水洗流出液和洗脫液中3種皂苷的含量。其中溶劑為水的上樣和水洗流出液適用于采用上樣和水洗流出液構(gòu)建的定量模型；溶劑為乙醇水溶液的洗脫液適用于采用洗脫液構(gòu)建的定量模型。檢測(cè)得到的皂苷濃度參見圖10-12。
【權(quán)利要求】
1.一種快速檢測(cè)皂苷含量的方法，通過以下步驟實(shí)現(xiàn): (1)測(cè)定層析過程流出液校正集樣本中的皂苷含量 采用高效液相色譜法測(cè)定層析過程中上樣流出液、水洗流出液和乙醇洗脫液校正集樣本的皂苷含量；色譜條件:色譜柱為Waters ACQUITY CSH C18, 50 mmX2.1 mm 1.d.，1.7Mm ;流動(dòng)相:0.01 %甲酸水(A)-0.01 %甲酸乙腈(B);線性梯度洗脫程序:0 min 19 % (B),6 min 20 % (B),8.5 min 31 % (B), 11 min 33 % (B), 17 min 90 % (B);運(yùn)行 19 min ；流速:0.35 ml/min ;檢測(cè)波長:203 nm ;柱溫:40 V ;進(jìn)樣量:5 μ?,按外標(biāo)兩點(diǎn)法方程計(jì)算含量; (2)紫外掃描得到校正集樣本的紫外-可見光譜圖 取層析過程中獲取的上樣流出液、水洗流出液和洗脫液樣品，直接用衰減全反射-紫外可見光譜儀進(jìn)行掃描，掃描的光譜區(qū)間是190nm~800nm，分辨率為0.1nm-1nm,光譜掃描三次之后，取平均值作為校正集樣本； (3)采用偏最小二乘法或者主成分回歸法分別對(duì)上樣和水洗流出液、乙醇洗脫液構(gòu)建定量模型 使用Simca、Unscrambler或者M(jìn)initab軟件處理數(shù)據(jù)，在構(gòu)建光譜圖和阜苷含量定量模型時(shí)使用的方法是偏最小二乘法或者主成分回歸法，使用交叉驗(yàn)證法確定最佳主成分?jǐn)?shù)，當(dāng)定量模型的相關(guān)系數(shù)到0.9以上時(shí)，認(rèn)為模型已經(jīng)建立完成； (4)層析過程流出液中皂苷含量的快速測(cè)定 將光纖探頭裝于層析柱出口管路，直接掃描未知濃度的層析過程流出液的光譜圖，層析過程流出液包括上樣流出液、水洗流出液和洗脫液，紫外掃描的光譜范圍和分辨率要求和建立標(biāo)準(zhǔn)集樣本時(shí)相同，將光譜數(shù)據(jù)代入構(gòu)建的定量模型中，作為預(yù)測(cè)集，得到層析過程流出液中皂苷的含量。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種快速檢測(cè)皂苷含量的方法，其特征在于，步驟(4)中溶劑為水的流出液適用于采用上樣流出液和水洗流出液構(gòu)建的定量模型；溶劑為乙醇水溶液的洗脫液適用于采用洗脫液構(gòu)建的定量模型。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種快速檢測(cè)皂苷含量的方法在快速檢測(cè)皂苷含量中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】G01N30/88GK103792313SQ201410026540
【公開日】2014年5月14日 申請(qǐng)日期:2014年1月21日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月21日
【發(fā)明者】瞿海斌, 程翼宇, 龔行楚 申請(qǐng)人:浙江大學(xué)