本發(fā)明涉及磷脂檢測(cè)領(lǐng)域，具體涉及一種利用氧化酶法來(lái)檢測(cè)磷脂的檢測(cè)試劑和檢測(cè)方法。

背景技術(shù)：

磷脂（Phospholipid），也稱磷脂類、磷脂質(zhì)，是指含有磷酸的脂類，屬于復(fù)合脂。磷脂是組成生物膜的主要成分，分為甘油磷脂與鞘磷脂兩大類，分別由甘油和鞘氨醇構(gòu)成。磷脂為兩性分子，一端為親水的含氮或磷的頭，另一端為疏水（親油）的長(zhǎng)烴基鏈。由于此原因，磷脂分子親水端相互靠近，疏水端相互靠近，常與蛋白質(zhì)、糖脂、膽固醇等其它分子共同構(gòu)成脂雙分子層，即細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)。

血清磷脂主要包括卵磷脂、溶血卵磷脂、神經(jīng)磷脂和腦磷脂等四部分。臨床工作中一般測(cè)定血清總磷脂有化學(xué)法和酶法測(cè)定兩類方法，如需進(jìn)一步檢查血清磷脂的組成則需要借助薄層層析、氣相層析或高效液相層析等各項(xiàng)技術(shù)。升高原因：梗阻性黃疸、原發(fā)性膽汁性肝硬化、原發(fā)性硬化性膽管炎、Ziere綜合征、糖原累積病、肥胖癥、糖尿病、急慢性胰腺炎、腎病綜合征、甲狀腺功能減低癥、脂肪肝、脂肪營(yíng)養(yǎng)不良、妊娠、口服避孕藥等。降低原因：重癥肝炎、失代償肝硬化、丹吉爾(Tangier)病、甲狀腺功能亢進(jìn)癥、吸收不良綜合征、骨髓增殖性疾病、多發(fā)性骨髓瘤、Wolman病、Leye綜合征、多發(fā)性硬化癥等。

目前檢測(cè)磷脂的方法較多，主要檢測(cè)方法有色譜分析方法、質(zhì)譜檢測(cè)方法、化學(xué)法、酶法等方法。其中色譜和質(zhì)譜檢測(cè)方法最為準(zhǔn)確，但是這兩種方法對(duì)儀器和操作人員要求較高，使用成本太貴，不適合大面積的推廣?；瘜W(xué)成本法相對(duì)較低，但是這種方法準(zhǔn)確度不高，容易受到干擾。酶法則在市面上較為常見(jiàn)，這種方法主要是借助于TRINDER反應(yīng)進(jìn)行，利用磷脂酶和膽堿氧化酶生成H2O2，借助色原進(jìn)行成色反應(yīng)，本方法應(yīng)用較廣，價(jià)格便宜，操作方便，適合全自動(dòng)生化分析儀器的配套使用，但是本法因?yàn)樯婕暗矫割愝^多，且涉及到TRINDER反應(yīng)本身固有的抗干擾能力不強(qiáng)等問(wèn)題，市面上現(xiàn)有的磷脂檢測(cè)試劑多為不穩(wěn)定和抗干擾能力差等問(wèn)題，影響著正常的使用。本發(fā)明為解決這幾個(gè)問(wèn)題，研究發(fā)明了一種抗干擾性強(qiáng)、穩(wěn)定性好的氧化酶法磷脂檢測(cè)試劑及其使用方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的問(wèn)題是提供一種穩(wěn)定性強(qiáng)的利用氧化酶法檢測(cè)血清磷脂的檢測(cè)試劑。同時(shí)還提供了一種利用本發(fā)明的檢測(cè)試劑檢測(cè)血清磷脂的檢測(cè)方法。

磷脂在磷脂酶D的作用下水解生成膽堿和磷脂酸，膽堿被膽堿氧化酶氧化生成過(guò)氧化氫，過(guò)氧化氫與4-氨基安替比林、DAOS反應(yīng)生成藍(lán)色染料。此染料在600nm有最大吸收峰，吸收強(qiáng)度與血清中磷脂含量成正比。

本發(fā)明一種穩(wěn)定、抗干擾性強(qiáng)的磷脂檢測(cè)試劑及其檢測(cè)方法，包括試劑R1和試劑R2。其特征在于：

所述試劑R1包含，生物緩沖液，其中溶質(zhì)在試劑R1中的濃度為100-150mmol/L：

磷脂酶D 0.5KU/L-2KU/L

DAOS 1.2mmol/L-3.2 mmol/L

Triton X-305 solution 1ml/L-3ml/L

Emulgen 707 0.5ml/L-2ml/L

還原保護(hù)劑 0.5mmol/L-2mmol/L

螯合保護(hù)劑 1mmol/L-5mmol/L

防腐劑 1g/L-5g/L

所述試劑R2包含，緩沖液，其中溶質(zhì)在試劑R2中的濃度為100-200mmol/L：

4-氨基安替吡啉 0.75mmol/L-1.5 mmol/L

過(guò)氧化物酶 10KU/L-15 KU/L

膽堿氧化酶 8KU/L-12KU/l

防腐劑 1g/L-5g/L。

本發(fā)明一種穩(wěn)定、抗干擾性強(qiáng)的磷脂檢測(cè)試劑及其檢測(cè)方法，其特征在于，所述試劑R1中還包括：抗壞血酸氧化酶1-5KU/L。

本發(fā)明一種穩(wěn)定、抗干擾性強(qiáng)的磷脂檢測(cè)試劑及其檢測(cè)方法，其特征在于，所述試劑R2中還包括：FAD2-5 mg/L和蔗糖 5g/L-10g/L。

本發(fā)明一種穩(wěn)定、抗干擾性強(qiáng)的磷脂檢測(cè)試劑及其檢測(cè)方法，其特征在于，所述試劑R1中緩沖液為檸檬酸緩沖液，其溶質(zhì)在試劑R1中的濃度為100mmol/L的，在25℃時(shí)，緩沖液的PH值為6.0。

本發(fā)明一種穩(wěn)定、抗干擾性強(qiáng)的磷脂檢測(cè)試劑及其檢測(cè)方法，其特征在于，所述試劑R2中緩沖液為Bis-Tris Propane生物緩沖液，其溶質(zhì)在試劑R1中的濃度為100mmol/L，在25℃時(shí)，緩沖液的PH為7.1。

本發(fā)明一種穩(wěn)定、抗干擾性強(qiáng)的磷脂檢測(cè)試劑及其檢測(cè)方法，其特征在于，所述防腐劑為納他霉素。

本發(fā)明一種穩(wěn)定、抗干擾性強(qiáng)的磷脂檢測(cè)試劑及其檢測(cè)方法，其特征在于，所述R1試劑中螯合保護(hù)劑為HEDTA (羥乙基乙二胺三乙酸)。

本發(fā)明一種穩(wěn)定、抗干擾性強(qiáng)的磷脂檢測(cè)試劑及其檢測(cè)方法，其特征在于，所述R1試劑中還原保護(hù)劑為DTT(二硫蘇糖醇)。

本發(fā)明一種穩(wěn)定、抗干擾性強(qiáng)的磷脂檢測(cè)試劑及其檢測(cè)方法，其特征在于，所述試劑R1與試劑R2的體積比為4:1。

本發(fā)明一種穩(wěn)定、抗干擾性強(qiáng)的磷脂檢測(cè)試劑及其檢測(cè)方法，其特征在于，包含如下步驟：

（1）量取試劑R1和試劑R2；

（2）將待測(cè)血清與試劑R1混合，測(cè)得波長(zhǎng)為600nm時(shí)的吸光度A1；

（3）將試劑R2加入步驟（2）的混合溶液內(nèi)，3-8min后，測(cè)得波長(zhǎng)為600nm時(shí)的吸光度A2。

本發(fā)明一種穩(wěn)定、抗干擾性強(qiáng)的磷脂檢測(cè)試劑及其檢測(cè)方法，其特征在于，步驟（3）中的反應(yīng)時(shí)間為5min。試劑R1和試劑R2的制備方法為在將各原料量取好，加入到容器中，混合均勻即可。

本發(fā)明在試劑R1和R2中分別使用了檸檬酸鈉緩沖液和Bis-Tris Propane（1,3-二[三(羥甲基)甲氨基]丙烷）緩沖液。在試劑中使用的Bis-Tris Propane（1,3-二[三(羥甲基)甲氨基]丙烷）緩沖液是生物緩沖液，對(duì)試劑中所使用的過(guò)氧化物酶有較好的保護(hù)作用，并且不會(huì)對(duì)反應(yīng)體系產(chǎn)生負(fù)面影響。在試劑R1中加入了Triton X-305 solution和Emulgen 707兩種表面活性劑，這兩種表面活性劑能有較好的提高試劑的乳化作用，并且對(duì)磷脂酶D這種重要的工具酶有非常強(qiáng)的保護(hù)作用，同時(shí)有較好的增效作用。為了增強(qiáng)R2試劑中關(guān)鍵酶膽堿氧化酶的穩(wěn)定性，特在R2試劑中加入了蔗糖和酶保護(hù)劑FAD，大大提高了酶的穩(wěn)定性。

本發(fā)明還在試劑中加入了抗壞血酸氧化酶和螯合劑HEDTA (羥乙基乙二胺三乙酸)，能夠有效的去除抗壞血酸和重金屬離子的干擾，且適量的螯合劑HEDTA (羥乙基乙二胺三乙酸)與特異性保護(hù)工具酶磷脂酶D，DTT（二硫蘇糖醇）的加入則可以防止空氣對(duì)酶的氧化。

本磷脂的檢測(cè)試劑具有穩(wěn)定性好、價(jià)格低廉的優(yōu)點(diǎn)，可廣泛在磷脂檢測(cè)領(lǐng)域進(jìn)行推廣。

本磷脂的檢測(cè)方法，其原理是，A2與A1的差值，與標(biāo)準(zhǔn)液的使用同樣方法測(cè)得的數(shù)值的差值之比乘上標(biāo)準(zhǔn)液的PLIP的濃度，就是待測(cè)血清的濃度，具有速度快、穩(wěn)定性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)。

附圖說(shuō)明：

圖1為配方1、配方2和配方3的穩(wěn)定性趨勢(shì)圖。

具體實(shí)施方式：

下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步說(shuō)明。

（1）配方1（一種現(xiàn)有氧化酶法的磷脂檢測(cè)試劑）：

R1的組分：

檸檬酸緩沖液（PH7.2） 100mmol/L

磷脂酶D 0.46U/mL

DAOS 1.2mmol/L

抗壞血酸酶 0.6U/mL

R2的組分：

檸檬酸緩沖液（PH7.2） 100mmol/L

4-氨基安替吡啉 0.75mmol/L

過(guò)氧化物酶 17U/mL

膽堿氧化酶 7.2U/mL。

（2）配方2（一種優(yōu)化穩(wěn)定的氧化酶法磷脂檢測(cè)試劑）：

R1的組分：

檸檬酸緩沖液 100mmol/L

磷脂酶D 0.5KU/L

DAOS 1.2mmol/L

Triton X-305 solution 1ml/L

Emulgen 707 0.5ml/L

DTT（二硫蘇糖醇） 0.5mmol/L

HEDTA (羥乙基乙二胺三乙酸) 1mmol/L

抗壞血酸氧化酶 1KU/L

防腐劑 （納他霉素） 1g/L

R2的組分：

Bis-Tris Propane生物緩沖液 200mmol/L

4-氨基安替吡啉 0.75mmol/L

過(guò)氧化物酶 10KU/L

膽堿氧化酶 8KU/L

FAD 2mg/L

蔗糖 5g/L

防腐劑（納他霉素） 1g/L。

（3）配方3（一種關(guān)鍵原材料增加后的穩(wěn)定的氧化酶法的磷脂檢測(cè)試劑）：

R1的組分：

檸檬酸緩沖液 200mmol/L

磷脂酶D 2KU/L

DAOS 3.2mmol/L

Triton X-305 solution 3ml/L

Emulgen 707 2ml/L

DTT（二硫蘇糖醇） 2mmol/L

HEDTA (羥乙基乙二胺三乙酸) 5mmol/L

抗壞血酸氧化酶 5KU/L

防腐劑 （納他霉素） 5g/L

R2的組分：

Bis-Tris Propane生物緩沖液 200mmol/L

4-氨基安替吡啉 1.5mmol/L

過(guò)氧化物酶 15KU/L

膽堿氧化酶 12KU/L

FAD 5mg/L

蔗糖 10g/L

防腐劑（納他霉素） 5g/L。

（4）檢測(cè)方法：在使用時(shí)采用具有雙試劑功能的全自動(dòng)生化分析儀，本檢測(cè)試驗(yàn)采用日立7180全自動(dòng)分析儀，利用終點(diǎn)法進(jìn)行測(cè)定，檢測(cè)主波長(zhǎng)為600nm，利用速率法進(jìn)行測(cè)定。分別將R1和R2按照4:1的比例放置到對(duì)應(yīng)的試劑位上，在樣品盤的對(duì)應(yīng)位置放置好蒸餾水、標(biāo)準(zhǔn)品和樣本，操作步驟如表1。

表1

計(jì)算方法：磷脂含量（U/L）＝（?A測(cè)定÷?A標(biāo)準(zhǔn)）×C標(biāo)準(zhǔn)。

（5）干擾性試驗(yàn)：取新鮮混合血清，分成3等份，將每份再分成5等份，加入不同的干擾物質(zhì)，使其在血清中的濃度達(dá)到表2的要求，然后分別用配方1、配方2和配方3的試劑，同時(shí)測(cè)定對(duì)比血清中磷脂的含量。加入不同干擾物質(zhì)后各組的測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表2，相對(duì)偏差(%)=(干擾樣本的測(cè)定均值－無(wú)干擾物質(zhì)的樣本的測(cè)定均值)/無(wú)干擾物質(zhì)的測(cè)定均值×100%。

由表2可以看出，抗壞血酸、膽紅素、血紅蛋白和甘油三酯對(duì)配方2和配方3的測(cè)試結(jié)果沒(méi)有明顯干擾，而對(duì)配方1的影響較大，說(shuō)明本檢測(cè)試劑具有較強(qiáng)的抗干擾能力。

表2

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（6）試劑的穩(wěn)定性試驗(yàn)：

將配方1、配方2和配方3中的試劑，均勻分裝13組。每組的試劑量：R1為20mL，R2為5mL。放置到2-8℃冰箱中，每月的同一天取出一組試劑檢測(cè)磷脂質(zhì)控品（靶值為200mg/dL），檢測(cè)結(jié)果如圖1所示，配方2和配方3相差不大，試劑在2-8℃儲(chǔ)存條件下比配方1中的磷脂測(cè)定試劑盒更加穩(wěn)定。