測(cè)定荔枝核提取物中皂苷含量的方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種測(cè)定荔枝核提取物中皂苷含量的方法，其步驟如下：（1）制備對(duì)照品溶液；（2）制備供試品溶液；（3）精密吸取人參皂苷對(duì)照品溶液進(jìn)樣，測(cè)定峰面積，得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程；（4）精密吸取的供試品溶液進(jìn)樣，測(cè)定峰面積，根據(jù)上述標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品皂苷含量。本發(fā)明的方法基于高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測(cè)，該法專屬性好，重現(xiàn)性好，穩(wěn)定性強(qiáng)，從而使得對(duì)產(chǎn)品的質(zhì)量控制和用藥安全得到保證。
【專利說明】測(cè)定荔枝核提取物中皂苷含量的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于藥物質(zhì)量控制領(lǐng)域，特別涉及一種測(cè)定荔枝核提取物中皂苷含量的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]蒸枝核(LycheeSeed, Litchi Seed),為無患子科植物蒸枝(Litchi ChinensisSonn)的干燥成熟種子，別名荔仁、荔核、大荔核，收載于《中國藥典》2010版一部，性溫，味甘、微苦，具有行氣散結(jié)，祛寒止痛功效?！侗静菥V目》記載，荔枝核“止渴、益人顏色、食之止煩渴”(煩渴病，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)稱為糖尿病)。研究表明，荔枝核有降低血糖、調(diào)節(jié)血脂、提高抗氧化、抑制乙肝病毒表面抗原的作用。蒸枝核所含成分研究較為充分，主要成分有阜苷、黃酮及花色素類、植物留醇類、鞣質(zhì)及多酚類、脂肪酸、氨基酸、蛋白質(zhì)和多糖等。實(shí)驗(yàn)研究和臨床治療顯示荔枝核提取物能夠顯著降低血糖和血脂，有效治療糖尿病及代謝綜合征。充分利用本地豐富的荔枝核資源，開發(fā)成安全有效、質(zhì)量可控的治療糖尿病的藥物供臨床應(yīng)用，對(duì)改變因生活方式改變而引起的糖尿病患病率居高不下的趨勢(shì)，具有重要的社會(huì)意義和市場(chǎng)價(jià)值。
[0003]中國專利CN102048885公開了一種制備荔枝核提取物的提取工藝，通過該工藝獲得的提取物主要成分為荔枝核皂苷，含量達(dá)85%以上，其制備工藝為:將荔枝核粉碎為20目大小，取適量，加入3倍量的水浸潤10分鐘，稱取1%重量(以藥材計(jì))的纖維素酶、1%重量(以藥材計(jì))的果膠酶和1%重量(以藥材計(jì))的葡聚糖酶加入其中，混勻，控溫50°C酶解3小時(shí)后加入3倍量的70%乙醇，超聲提取40分鐘，濾過，濾液減壓回收乙醇及濃縮，濃縮液經(jīng)大孔樹脂吸附，再用70%乙醇洗脫，收集洗脫液，洗脫液減壓回收乙醇及濃縮得浸膏，將浸膏真空低溫干燥即得荔枝核提取物。該提取物可作為中間體加入適量制藥輔料后制成用于治療糖尿病的藥物。為保證藥物的安全、有效、穩(wěn)定，有必要對(duì)作為中間體的提取物的質(zhì)量進(jìn)行監(jiān)控。
[0004]目前，作為原料藥材的荔枝核為《中國藥典》收載的法定藥材，其中僅通過鑒別、浸出物等指標(biāo)進(jìn)行簡單的質(zhì)量控制，并無有效成分的含量測(cè)定項(xiàng)。荔枝核制劑僅有文獻(xiàn)報(bào)道采用高效液相色譜法，以原兒茶酸為對(duì)照測(cè)定荔枝核復(fù)方制劑“降糖片”中的原兒茶酸含量作為質(zhì)控指標(biāo)(郭宇潔等，降糖片中荔枝核提取工藝優(yōu)選和定量測(cè)定，《中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志》，2009年，第15卷，第8期:50-52)，原兒茶酸為黃酮類成分而非皂苷類成分，因此不具參考性。從現(xiàn)有文獻(xiàn)對(duì)荔枝核皂苷成分的含量測(cè)定方法分析，普遍是采用皂苷與香草醛-濃酸(高氯酸、硫酸、冰醋酸等)顯色后進(jìn)行紫外分光光度法進(jìn)行測(cè)定，其原理是強(qiáng)酸使皂苷的酚羥基脫水，再與香草醛縮合形成共軛體系而顯色(方歡樂等，荔枝核皂苷含量測(cè)定及提取工藝優(yōu)選研究，《亞太傳統(tǒng)醫(yī)藥》，2010年，第6卷(第3期):17-19.)。該方法原先用于測(cè)定人參皂苷等成分。但荔枝核提取物中除含有皂苷成分外，也含有多酚、原花青素等成分，這類成分也具有酚羥基結(jié)構(gòu)，因此也能與香草醛-濃酸反應(yīng)顯色，也有文獻(xiàn)報(bào)道采用該法測(cè)定荔枝核中原花青素的含量(丁麗，荔枝核化學(xué)成分的研究(天津科技大學(xué)碩士學(xué)位論文，2006年)，《中國優(yōu)秀碩士論文全文數(shù)據(jù)庫》)。因此采用該方法測(cè)定荔枝核提取物的皂苷含量，將會(huì)使測(cè)定值偏高，不能反映提取物中皂苷的真實(shí)含量，不利于提取物的質(zhì)量控制。因此，建立一種能準(zhǔn)確檢測(cè)荔枝核提取物皂苷含量的質(zhì)量檢測(cè)方法具有現(xiàn)實(shí)的意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是針對(duì)以上技術(shù)問題，提供一種專屬性好，重現(xiàn)性好，穩(wěn)定性強(qiáng)的測(cè)定中藥荔枝核提取物中皂苷含量的方法。
[0006]本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn):
[0007]—種測(cè)定荔枝核提取物中皂苷含量的方法，其步驟如下:
[0008](1)制備對(duì)照品溶液:取人參皂苷Rgl對(duì)照品，置于容量瓶，加入甲醇溶解，定容，搖勾，制成對(duì)照品溶液；
[0009](2)制備供試品溶液:取荔枝核提取物粉末1.0g，精密稱定，加50mL甲醇超聲提取30min,濾過，濾液回收甲醇至凈，殘洛加水10mL使溶解,轉(zhuǎn)移至分液漏斗中，用水飽和的正丁醇萃取3次，每次10mL，合并正丁醇萃取液，于水浴上蒸干，殘?jiān)陨V純甲醇溶解，轉(zhuǎn)移至10mL量瓶中，并以色譜純甲醇稀釋至刻度，搖勻，以0.2 μ m微孔濾膜濾過，續(xù)濾液作為供試品溶液；
[0010](3 )精密吸取人參皂苷對(duì)照品溶液0.5、1、3、5、10、20 μ L進(jìn)樣，測(cè)定峰面積；以不同的進(jìn)樣量C的對(duì)數(shù)值和峰面積積分值Α的對(duì)數(shù)值進(jìn)行回歸，得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程:A=l.8152C-1.3038，R2=0.9918 ；
[0011](4)精密吸取供試品溶液10μ L，進(jìn)樣，測(cè)定峰面積，根據(jù)上述標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品皂
苷含量。
[0012]根據(jù)本發(fā)明的方法，所述步驟(1)中的對(duì)照品溶液每毫升含人參皂苷Rgl0.10mg。
[0013]根據(jù)本發(fā)明的方法，，所述色譜條件為:色譜柱用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充齊U，規(guī)格為:4.6mmX 250mm, 5 μ m ;流動(dòng)相為甲醇-水(70:30)，流速為1.0mL/min,柱溫為30°C ;檢測(cè)器為蒸發(fā)光散射檢測(cè)器，漂移管溫度為90°C，氮?dú)饬魉贋?.0L/min。
[0014]經(jīng)本法測(cè)定，專利CN102048885中所公開的荔枝核提取物所含皂苷以浸膏干重計(jì)不少于0.8g/g。
[0015]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明基于高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測(cè)(HPLC-ELSD)，提供一種新的荔枝核皂苷的含量測(cè)定方法，該法專屬性好，重現(xiàn)性好，穩(wěn)定性強(qiáng)，從而使得對(duì)產(chǎn)品的質(zhì)量控制和用藥安全得到保證。
【具體實(shí)施方式】
[0016]實(shí)施例1
[0017]1、儀器:
[0018]AgilentllOO高效液相色譜儀(Agilent公司，美國),包括脫氣機(jī)，四元梯度泵，自動(dòng)進(jìn)樣器，柱溫箱和HP Chemstation工作站；Allteeh ELSD2000檢測(cè)器(Allteeh公司，美國)；AE240型電子分析天平(梅特勒一托利多儀器有限公司)；Buchi旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(Buchi公司，瑞士)；KQ3200B超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。
[0019]2、試藥:[0020]荔枝核提取物(按照專利CN102048885方法自制);人參皂苷Rgl對(duì)照品(中國食品藥品檢定研究院)；正丁醇(分析純)；甲醇(色譜純)。
[0021]3、色譜條件:
[0022]色譜柱為Agilent Zorbax Eclipse XDB_C18 柱，規(guī)格為:4.6mmX 250mm, 5 μ m;流動(dòng)相為甲醇-水(70:30)，流速為1.0mL/min，柱溫30°C ;檢測(cè)器為蒸發(fā)光散射檢測(cè)器，檢測(cè)參數(shù):漂移管溫度90°C，氮?dú)饬魉贋?.0L/min。
[0023]4、試驗(yàn)方法:
[0024]4.1對(duì)照品溶液的制備:
[0025]精密稱取人參皂苷Rgl對(duì)照品，置于容量瓶，加入甲醇溶解，定容，搖勻，制成每毫升含人參皂苷RgA 10mg的對(duì)照品溶液。
[0026]4.2供試品溶液的制備:
[0027]取荔枝核提取物粉末1.0g，精密稱定，加50mL甲醇超聲提取30min，濾過，濾液回收甲醇至凈，殘?jiān)铀?0mL使溶解，轉(zhuǎn)移至分液漏斗中，用水飽和的正丁醇萃取3次，每次10mL合并正丁醇萃取液，于水浴上蒸干，殘?jiān)陨V純甲醇溶解，轉(zhuǎn)移至10mL量瓶中，并以色譜純甲醇稀釋至刻度，搖勻，以0.2μπι微孔濾膜濾過，續(xù)濾液作為供試品溶液。
[0028]4.3標(biāo)準(zhǔn)曲線制備:
[0029]精密吸取人參皂苷對(duì)照品溶液0.5、l、3、5、10、20yL進(jìn)樣，測(cè)定峰面積。以不同的進(jìn)樣量C的對(duì)數(shù)值和峰面積積分值A(chǔ)的對(duì)數(shù)值進(jìn)行回歸，得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程:A=l.7835C-1.3736，R2=0.9918。
[0030]4.4精密度研究:
[0031 ] 精密吸取4.1項(xiàng)下對(duì)照品溶液10 μ L，注入液相色譜儀中，測(cè)定峰面積，重復(fù)進(jìn)樣6次，測(cè)得人參皂苷Rgl峰面積RSD為1.87%，表明儀器精密度良好。
[0032]4.5回收率實(shí)驗(yàn):
[0033]在已知皂苷含量的提取物溶液中定量加入對(duì)照品溶液，混勻，吸取10 μ L，按以上條件測(cè)定峰面積，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算皂苷對(duì)照品的量，計(jì)算回收率，回收率為99.3%。
[0034]4.6穩(wěn)定性研究:
[0035]分別在0，1，2，4，8小時(shí)精密吸取4.1項(xiàng)下對(duì)照品溶液10 μ L，注入液相色譜儀中，測(cè)定峰面積，峰面積RSD為2.13%，表明供試品溶液在8小時(shí)內(nèi)穩(wěn)定。
[0036]實(shí)施例2
[0037]1、儀器:
[0038]AgilentllOO高效液相色譜儀(Agilent公司，美國),包括脫氣機(jī)，四元梯度泵，自動(dòng)進(jìn)樣器，柱溫箱和HP Chemstation工作站；Allteeh ELSD2000檢測(cè)器(Allteeh公司，美國)；AE240型電子分析天平(梅特勒一托利多儀器有限公司)；Buchi旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(Buchi公司，瑞士)；KQ3200B超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。
[0039]2、試藥:
[0040]荔枝核提取物(按照專利CN102048885方法自制);人參皂苷Rgl對(duì)照品(中國食品藥品檢定研究院)；正丁醇(分析純)；甲醇(色譜純)。
[0041]3、色譜條件:
[0042]色譜柱為Agilent Zorbax Eclipse XDB_C18 柱，規(guī)格為:4.6mmX 250mm, 5 μ m;流動(dòng)相為甲醇-水(70:30)，流速為1.0mL/min，柱溫30°C ;檢測(cè)器為蒸發(fā)光散射檢測(cè)器，檢測(cè)參數(shù):漂移管溫度90°C，氮?dú)饬魉贋?.0L/min。
[0043]4、試驗(yàn)方法:
[0044]4.1對(duì)照品溶液的制備:
[0045]精密稱取人參皂苷Rgl對(duì)照品，置于容量瓶，加入甲醇溶解，定容，搖勻，制成每毫升含人參皂苷RgA 10mg的對(duì)照品溶液。
[0046]4.2供試品溶液的制備:
[0047]取荔枝核提取物粉末1.0g，精密稱定，加50mL甲醇超聲提取30min，濾過，濾液回收甲醇至凈，殘?jiān)铀?0mL使溶解，轉(zhuǎn)移至分液漏斗中，用水飽和的正丁醇萃取3次，每次10mL合并正丁醇萃取液，于水浴上蒸干，殘?jiān)陨V純甲醇溶解，轉(zhuǎn)移至10ml量瓶中，并以色譜純甲醇稀釋至刻度，搖勻，以0.2μπι微孔濾膜濾過，續(xù)濾液作為供試品溶液。
[0048]4.3標(biāo)準(zhǔn)曲線制備:
[0049]精密吸取人參皂苷對(duì)照品溶液0.5、l、3、5、10、20yL進(jìn)樣，測(cè)定峰面積。以不同的進(jìn)樣量C的對(duì)數(shù)值和峰面積積分值A(chǔ)的對(duì)數(shù)值進(jìn)行回歸，得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程:A=l.8152C-1.3038，R2=0.9918。
[0050]4.4樣品皂苷含量測(cè)定:
[0051]精密吸取4.2項(xiàng)下的供試品溶液10 μ L，進(jìn)樣，測(cè)定峰面積，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品皂苷含量。經(jīng)計(jì)算，提取物皂苷含量為0.809g/g。
【權(quán)利要求】
1.一種測(cè)定荔枝核提取物中皂苷含量的方法，其步驟如下:(1)制備對(duì)照品溶液:取人參皂苷Rgl對(duì)照品，置于容量瓶，加入甲醇溶解，定容，搖勻，制成對(duì)照品溶液；(2)制備供試品溶液:取荔枝核提取物粉末1.0g,精密稱定，加50mL甲醇超聲提取30min,濾過，濾液回收甲醇至凈，殘洛加水10mL使溶解,轉(zhuǎn)移至分液漏斗中，用水飽和的正丁醇萃取3次，每次10mL，合并正丁醇萃取液，于水浴上蒸干，殘?jiān)陨V純甲醇溶解，轉(zhuǎn)移至10mL量瓶中，并以色譜純甲醇稀釋至刻度，搖勻，以0.2 μ m微孔濾膜濾過，續(xù)濾液作為供試品溶液；(3)精密吸取人參皂苷對(duì)照品溶液0.5、1、3、5、10、20μL進(jìn)樣，測(cè)定峰面積；以不同的進(jìn)樣量C的對(duì)數(shù)值和峰面積積分值A(chǔ)的對(duì)數(shù)值進(jìn)行回歸，得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程:A=l.8152C-1.3038，R2=0.9918 ；(4)精密吸取的供試品溶液10μL，進(jìn)樣，測(cè)定峰面積，根據(jù)上述標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品皂苷含量。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:所述步驟(1)中的對(duì)照品溶液每毫升含人參皂苷RgA 10mg。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述色譜條件為:色譜柱用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，規(guī)格為:4.6mm X 250mm，5 μ m ;流動(dòng)相為甲醇-水(70:30 )，流速為.1.0mL/min，柱溫為30°C ;檢 測(cè)器為蒸發(fā)光散射檢測(cè)器，漂移管溫度為90°C，氮?dú)饬魉贋?2.0L/mino
【文檔編號(hào)】G01N30/06GK103698432SQ201310739692
【公開日】2014年4月2日 申請(qǐng)日期:2013年12月26日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月26日
【發(fā)明者】郭潔文, 鄧志軍, 屈喜玲 申請(qǐng)人:廣州市中醫(yī)醫(yī)院