相關申請的交叉參照本申請要求2014年10月30日提交的美國臨時申請?zhí)?2/072,747和2015年1月26日提交的美國臨時申請?zhí)?2/107,994的優(yōu)先權，其全文通過引用結合到本文中。關于聯(lián)邦政府贊助的研究或開發(fā)的聲明無。聯(lián)合研究協(xié)議的當事人名稱無。背景分析來自生物源的化合物的方法常常包括衍生化步驟，以在色譜分離后引進有利于檢測的熒光團。雖然存在不同的衍生化策略，但長處理時間是一個有效地采用一旦獲得的分析數(shù)據(jù)的嚴重因素。最近已開發(fā)出減少前置時間(leadtime)的試劑和相關方法，特別是關于具有胺或氨基的化合物的分析。然而伯胺和羥基之間的期望的反應選擇性常常不能實現(xiàn)。進而，標記化合物的得率則不能優(yōu)化。此外，現(xiàn)有技術方法頻繁地生成“過度標記的”化合物。而且，標記的(labeled)或加標簽的(tagged)化合物在高有機溶劑中的溶解性可能是低的，這阻礙下游固相提取程序(“spe”)，尤其是基于親水相互作用色譜的那些。同樣，現(xiàn)有技術分析通常需要化合物從生物源分離和/或在衍生化之前經歷洗滌步驟，這產生額外的步驟并減慢分析程序。因此，存在對分析化合物的方法的需求，其中衍生化步驟以高得率生產被選擇性地標記的加標簽化合物，且不引起生物樣品的降解或過度-標記，以在標記化合物的隨后的分析期間提供高的分辨率。發(fā)明概述一種分析糖基化生物分子的方法，其包括以下步驟：(a)生產去糖基化混合物，其中糖基化生物分子已通過天然或合成酶或化學技術去糖基化；(b)提供包含在極性非質子、非-親核有機溶劑中的標記試劑的試劑溶液；(c)在反應混合物中，以約2.5:約1的體積比混合去糖基化混合物與試劑溶液；和(d)檢測衍生的葡糖基胺。反應混合物含有相對于可修飾的胺的范圍從約10-約2000的量的摩爾過量的標記試劑，并可包括釋放的葡糖基胺、蛋白質性胺和衍生的葡糖基胺。所述步驟可有目的地進行，而不損耗蛋白質物質。然后衍生的葡糖基胺可用在線或離線spe和/或其它分離方法從反應混合物分離，或不從反應混合物分離。任選地，猝滅溶液可加入到反應混合物中，以致反應混合物的ph移至高于10。衍生的葡糖基胺的得率可以是反應混合物的約80-約100摩爾%的量。衍生的葡糖基胺然后從反應混合物分離并通過色譜檢測、熒光檢測、質譜(“ms”)或紫外光(“uv”)檢測和/或其組合檢測。在一些實施方案中，所述方法還可包括使糖基化生物分子與酶接觸以生產去糖基化混合物的步驟，或可通過其它酶或化學技術去糖基化。在另一方面，葡糖基胺的快速衍生的方法也在本文中描述。在一些實施方案中，葡糖基胺的快速衍生的方法包括以下步驟：(1)提供生物樣品；(2)合并生物樣品與肽n-糖苷酶f以生產去糖基化混合物；(3)提供包含與無水二甲基甲酰胺(dmf)合并的標記試劑的試劑溶液；和(4)混合去糖基化混合物與試劑溶液，以生產包含標記試劑、釋放的葡糖基胺、蛋白質性胺和衍生的葡糖基胺的反應混合物。所述反應混合物可具有相對于可修飾胺的約10-約1000的量的摩爾過量的標記試劑。對于一些實施方案，摩爾過量的其它范圍也在本文中描述。在所述方法中，有機溶劑在反應混合物中的濃度可以是約0-約50%。在一些實施方案中，有機溶劑在反應混合物中的范圍可以是約10-約40%。在一些示例性實施方案中，有機溶劑在反應混合物中的范圍可以是約20%-約30%體積。去糖基化混合物與試劑溶液以約9:1-約1:9的體積比混合。在示例性實施方案中，去糖基化混合物與試劑溶液以約2.5:約1的體積比混合，以產生具有約25-約30%的試劑溶液的反應混合物。在一些實施方案中，試劑溶液在反應混合物中的量是28.6%。試劑溶液可以是處于維持在約環(huán)境溫度或少于環(huán)境溫度-約4℃的溫度下。緩沖溶液可加入去糖基化混合物中。緩沖溶液可以是磷酸鈉或hepes?；蛘?，生物樣品可以在緩沖溶液，例如hepes中去糖基化，以用更少的步驟促進隨后的衍生化反應。任選地，猝滅溶液可加入到反應混合物中。猝滅溶液可包含乙二胺。乙二胺:水:乙腈的比例可以是約5:約5:約90體積。然后可在去糖基化混合物與試劑溶液混合后約2-約10分鐘，將猝滅溶液加入到反應混合物中。反應混合物的ph可移至約大于10。一般地，為制備供分析的糖基化生物分子，它可以被合成地或者天然地去糖基化。更特別地，為制備標記的n-聚糖，生物樣品可具有糖基化生物分子例如糖蛋白，其可以用肽n-糖苷酶f(pngasef)去糖基化，生產去糖基化混合物。標記試劑可以在無水二甲基甲酰胺(dmf)和/或其它極性非質子非-親核有機溶劑中合并，以生產試劑溶液。去糖基化混合物和試劑溶液隨后以約2.5:約1的體積比(2.5:1v/v/v)混合，以生產反應混合物，且葡糖基胺可以用標記試劑快速地標記。衍生的葡糖基胺可以經歷色譜分析、質譜、紫外光和/或熒光檢測。在此描述的快速標記葡糖基胺的方法可包括可選擇類型的分離和檢測方法。分離技術可包括，但不限于，親水相互作用色譜(“hilic”)、固相提取(“spe”)、毛細管電泳、高ph陰離子交換色譜或反相液相色譜。檢測方法可包括色譜檢測例如高壓液相色譜(“hplc”)、超高效液相色譜(uhplc)、超臨界流體色譜、紫外光(“uv”)檢測、熒光檢測、基質輔助激光解吸離子化質譜、電噴霧離子化質譜和/或脈沖安培檢測。附圖簡述圖1是顯示在此描述的方法的步驟的流程圖。圖2是顯示溫度對氨基-標記的基團的得率和對胺和緩激肽的羥基之間的反應選擇性的影響的圖。圖3a和3b各自是顯示有機溶劑(分別為dmso和dmf)和有機溶劑濃度對氨基-標記的基團的得率和對胺和緩激肽的羥基之間的反應選擇性的影響的圖。圖4a和4b是顯示緩沖液(分別為200mm硼酸鈉、200mm磷酸鈉)對氨基-標記的基團的得率的影響的圖。圖4c顯示當200mm硼酸鈉和200mm磷酸鈉緩沖液用于反應混合物中時，在羥基上修飾的葡糖基胺的%。圖5a和5b是顯示緩沖液濃度和離子強度對氨基-標記和羥基的得率和對胺和緩激肽的羥基之間的反應選擇性的影響的圖。圖5a顯示緩沖液濃度和離子強度對緩激肽的氨基-標記的基團的得率的影響。圖5b顯示緩沖液濃度和離子強度對緩激肽的羥基得率的影響。圖6是顯示反應時間對氨基-標記的基團的得率和對胺和緩激肽的羥基之間的反應選擇性的影響的圖。圖7a、7b、7c、7d和7e是顯示摩爾過量的加標簽試劑對氨基-標記的基團的得率和對過度-標記聚糖的水平的影響的色譜圖。這些圖證實必須如何優(yōu)化試劑對葡糖基胺的摩爾過量，以獲得高得率(大于80%)而不引入高(大于0.2摩爾%)水平的“過度標記的”物質。圖8a、8b和8c是顯示通過帶有熒光檢測的lc分析的自匯集的人igg釋放的熒光標記的n-葡糖基胺的結果和猝滅溶液組成對熒光背景水平的影響的色譜圖。圖8a顯示在反應后用加入的乙二胺猝滅后和在用1:14:85甲酸/水/acn洗滌液洗滌后的結果。圖8b顯示在反應后用加入的異丙胺猝滅后和用1:14:85甲酸/水/acn洗滌液洗滌后的結果。圖8c顯示在反應后用加入的己胺猝滅后和用1:14:85甲酸/水/acn洗滌液洗滌后的結果。圖9a、9b和9c是對標記的葡糖基胺獲得的熒光色譜圖，顯示在spe期間所用的不同洗滌液具有不同的作用。圖9a顯示用約15:約85體積(15:85(v/v))比例的dmf/acn洗滌后的色譜圖。圖9b顯示用約85%acn洗滌后的色譜圖。圖9c顯示用約1:約14:約85體積(1:14:85(v/v/v))比例的甲酸/水/acn洗滌后的色譜圖。圖10是使用在此描述的方法，如在實施例2中所述，對用標記試劑-1標記的匯集的人igg葡糖基胺獲得的熒光色譜圖。圖11a是使用在此描述的方法，如在實施例3中所述，對用標記試劑-1標記的西妥昔單抗葡糖基胺獲得的熒光色譜圖。圖11b是使用在此描述的方法，如在實施例3中所述，對應于圖11a的基礎峰強度色譜圖。圖12a是從hepes緩沖的反應的spe中產生的對標記試劑-1標記的抗桔霉素鼠igg1葡糖基胺獲得的hilic熒光色譜圖。圖12b是從磷酸鹽緩沖的反應的spe中產生的對標記試劑-1標記的抗桔霉素鼠igg1葡糖基胺獲得的hilic熒光色譜圖。圖13a是從標記后反應混合物的直接hilic分析產生的對標記試劑-1標記的抗桔霉素鼠igg1葡糖基胺獲得的hilic熒光色譜圖。圖13b是從標記后反應混合物的在線spe-hilic分析產生的對標記試劑-1標記的抗桔霉素鼠igg1葡糖基胺獲得的hilic熒光色譜圖。圖13c是從標記后反應混合物的高ph/低ph在線spe-hilic分析產生的對標記試劑-1標記的抗桔霉素鼠igg1葡糖基胺獲得的hilic熒光色譜圖。圖14a是rfms標記的來自抗桔霉素鼠igg1的n-聚糖的hilic-flr-ms。圖14b是iab標記的來自抗桔霉素鼠igg1的n-聚糖的hilic-flr-ms。圖14c顯示對rfms和iab標記聚糖的響應因子。圖15a是rfms標記的來自匯集的人igg的n-聚糖的hilic-flr-ms。圖15b是2ab標記的來自匯集的人igg的n-聚糖的hilic-flr-ms。圖15c顯示對rfms和2ab標記聚糖的響應因子。圖16a和16b顯示聚糖標記的相對性能。發(fā)明詳述本文提供分析生物樣品的化合物的新方法。為分析糖基化生物分子，分子經天然或通過合成處理去糖基化，然后在選擇的條件下接觸標記試劑，以優(yōu)化的得率和用最少的過度-標記生產衍生的葡糖基胺。無需首先分離樣品的生物分子，進行衍生化。色譜分析也可在獲得的衍生化混合物上直接進行，這樣的分析包括，但不限于，高壓液相色譜(“hplc”)、超高效液相色譜(uhplc)、質譜、超臨界流體色譜、紫外光(“uv”)和/或熒光(“flr”)檢測。然而，分離任選地包括如在此描述的spe離線和spe在線技術。在此描述的方法適合用于自動分析和處理系統(tǒng)例如由hewitsonetal.,在美國專利申請?zhí)?2/100,252中描述的那些，通過引用結合到本文中。為了廣泛種類的應用，包括但不限于蛋白質和肽鑒定和定量、細胞培養(yǎng)基的監(jiān)測和分析、和食物和飼料的營養(yǎng)含量，本文提供用于高壓液相色譜或檢測器的這些自動采樣和反應系統(tǒng)。自動采樣和反應系統(tǒng)可提供齊全可用的分析(turn-keyanalysis)，其可被優(yōu)化用于高壓液相色譜處理和檢測。公開的方法和系統(tǒng)可以與不同的類型的檢測器、tuv、pda或flr檢測器一起使用。自動采樣和反應系統(tǒng)也可用于應用特定的性能認定，提供相同的結果：不同工作日之間、不同設備之間、全世界的不同實驗室之間。此外，在此描述的方法適合用于各種生產和分配自動化的工作流系統(tǒng)和方案。在此描述的方法可以用于液體處理的自動化工作流系統(tǒng)和使用機器人技術的那些，以增加通過量并帶給實驗室提高的效率和安全性。自動化工作流系統(tǒng)常常用作生物制藥、研究和臨床診斷的平臺并包括，但不限于，數(shù)字分配器、dna提取、pcr設置、elisa、多道移液、移液平臺和相關的儀器，和被整合以在實驗室中產生高效工作流的軟件。在本方法中，葡糖基胺在其中蛋白質物質尚未從混合物中耗盡的條件下在溶液中標記。反應混合物的條件包括溫度、有機溶劑組成、有機溶劑濃度、緩沖液組成、ph、離子強度、摩爾過量的試劑，且時間被選擇和控制，以便可以實現(xiàn)伯胺和葡糖基胺的羥基之間的所需反應選擇性。在本文描述的方法中，用于用各種標記試劑(特別是快速加標簽的標記試劑)標記葡糖基胺或加標簽的條件被優(yōu)化。如在此所用的，短語“糖基化生物分子”意指并包括蛋白質、肽、聚糖、氨基酸、脂質、dna、rna和核酸。待分析的糖基化生物分子(有時也以單數(shù)或以復數(shù)稱為生物分子或化合物)可天然具有聚糖或可用伯胺、仲胺或叔胺生產聚糖。伯胺和仲胺可以單數(shù)或以復數(shù)存在。對于在此描述的標記試劑，伯胺和仲胺被認為是“可修飾的”胺。更特別地，胺是具有官能團的有機化合物，所述官能團含有帶有孤對電子的氮原子。一般地，胺是氨的衍生物，其中一個或多個氫原子已被取代基例如烷基或芳基替代。示例性的胺包括氨基酸、生物胺、三甲胺和苯胺。氨的無機衍生物在此也被稱為胺。此外，糖基化生物分子可在樣品內具有單一類型或具有多種類型的混合物。糖基化生物分子可包括，但不限于，胺(伯胺、仲胺等)、氨基酸、肽、蛋白質、聚胺、糖基化化合物、具有聚糖基團的化合物或糖蛋白等。更一般地，糖基化生物分子可意指糖已天然或者經合成處理被加入的任何分子。因此，糖基化生物分子、糖基化化合物或糖蛋白是已經歷共翻譯或翻譯后修飾并含有一個或多個附接于其的碳水化合物和聚糖基團的化合物或分子。這樣的糖基化化合物可以是天然存在的或合成產生的并包括蛋白質、脂質、氨基酸(甚至當作為肽和蛋白質中的殘基存在時)、抗體、肽或其它有機分子。n-聚糖(或n-連接的聚糖)可附接于天冬酰胺或精氨酸側鏈的酰胺或胺基的氮。在其它方面，o-連接的聚糖可附接于絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、羥基賴氨酸或羥基脯氨酸側鏈的羥基氧，或附接于脂質上的氧。在本文提出的方法的上下文中，糖基化化合物可以單數(shù)或以復數(shù)形式存在于樣品中。葡糖基胺或n-糖苷，是一類由胺與至碳水化合物的β-n-糖苷鍵組成的化合物，形成環(huán)狀半縮醛胺醚鍵(α-氨基醚)。換言之，葡糖基胺是具有附接于氨基的糖基基團的化合物。葡糖基胺(glycosylamine)可包括，但不限于，核苷例如腺苷，和具有胺基的糖苷例如n,n-二甲基-β-d-吡喃葡萄糖胺、葡糖胺(glucosylamine)、葡糖基-正丁胺、葡糖基-正己胺、葡糖基-正辛胺、葡糖基-正癸胺、葡糖基-正十二烷基胺、麥芽糖基-正十二烷基胺。而且，d-葡萄糖、d-半乳糖、乳糖、纖維二糖和麥芽糖在1當量碳酸氫銨的存在下，在用氨水溶液處理后，將全部產生相應的葡糖基胺、1-氨基-1-脫氧-d-葡萄糖、1-氨基-1-脫氧-d-半乳糖、1-氨基-1-脫氧乳糖、1-氨基-1-脫氧纖維二糖和1-氨基-1-脫氧麥芽糖。特定的糖基化模式已與健康和疾病的狀況相關，并且n-聚糖分析被多種工業(yè)，包括制藥生物技術生產越來越多地應用。許多基于蛋白質的生物藥品是糖基化蛋白質，而蛋白質糖基化中的不受控制的變化具有很大的監(jiān)管問題。例如，各個聚糖結構的相對量在過程開發(fā)期間需要被監(jiān)測以建立制備的生長和純化步驟的穩(wěn)定性。n-聚糖(一種形式的葡糖基胺)的熒光標記對檢測氨基酸的n-聚糖在生物樣品中的分布特性是有益的，因為它改進了檢測的靈敏性和選擇性以及聚糖的色譜表現(xiàn)。同樣地，廣泛種類的酶和化學技術可被用于蛋白質去糖基化和聚糖釋放。酶去糖基化技術利用糖苷酶，其可包括，但不限于，n-糖苷酶a(pngasea)、n-糖苷酶f(pngasef)、o-糖苷酶、神經氨酸酶、β1-4半乳糖苷酶和β-n-乙酰氨基葡糖苷酶。例如，如在本文詳細描述的，糖蛋白樣品可以用酶，肽n-糖苷酶f(pngasef)去糖基化，其從糖蛋白除去n-連接的寡糖，除了在還原端上含有α(1-3)-連接的巖藻糖的化合物之外。然而，n-糖苷酶a(pngasea)可除去全部n-聚糖。其它有用的酶包括內切糖苷酶或糖酰胺酶例如內切糖苷酶和n-聚糖酶。一旦酶去糖基化，n-聚糖作為葡糖基胺從天冬酰胺殘基釋放。為了從糖蛋白化學釋放n-聚糖，糖蛋白可以用無水肼于90℃處理數(shù)小時。為從糖蛋白釋放o-聚糖，糖蛋白用o-聚糖酶處理或用無水肼化學處理，特別是于60℃持續(xù)最多6小時?；蛘?，o-聚糖可通過采用用于還原性堿-催化的β-消除、非-還原性β-消除的堿性硼氫化物，或通過使用其它釋放劑例如三氟甲烷-硫酸或各種胺釋放。其它化學技術包括，但不限于，肼解作用(hydrazynolysis)和三氟甲烷磺酸(tfms)處理。而且，聚糖分析越來越多地應用于生物學研究和臨床分析。特定的糖基化模式已與健康和疾病狀態(tài)相關。而且，糖基化變化可調節(jié)蛋白質的生物學活性，如例如對重組免疫球蛋白的fc部分的糖基化所證實的。因此，分析來自糖蛋白的寡糖的方法往往聚焦于相關的和隨后衍生的聚糖的分析。然而，盡管這些方法允許獨立于載體糖蛋白而深入分析寡糖結構，但不提供關于聚糖的附著位點的信息。因此，蛋白質糖基化概況的特征鑒定具有很大的重要性，因為它對于各種調節(jié)目的和生物制藥藥物的生產都是需要的。釋放的聚糖池具有巨大的復雜性和結構的異質性，這需要有效的分離方法和高度靈敏性檢測方法。各個聚糖結構的相對量在過程開發(fā)期間需要被監(jiān)測以建立制備的生長和純化步驟的穩(wěn)定性。因此，本文提出制備標記葡糖基胺的方法。先前未描述的技術與標記試劑一起使用以快速生產分析備用的(analysis-ready)聚糖。這些技術包括用包含熒光部分、質子親和力/荷電標簽基團和n-羥基琥珀酰亞胺酯或氨基甲酸酯活性基團的標記試劑標記葡糖基胺，所述標記試劑例如如下面表1中的標記試劑-1、標記試劑-2、標記試劑-3、標記試劑-4所鑒定的。表1。可與在此描述的方法組合使用的其它標記試劑包括在美國專利申請?zhí)?4/458,760(題目為具有增強ms信號的聚糖和其它生物分子的快速熒光標記(rapidfluorescencetaggingofglyacnsandotherbiomoleculeswithenchancedmssignals)，未公布)中鑒定的那些標記試劑。見第2頁4行至4頁9行；11頁4行至25頁18行和29頁1行至30頁10行，通過引用結合到本文中。另外的標記試劑也可在以下專利中發(fā)現(xiàn)：美國專利號7,148,069(col.8,l.56-col.9,l.54和col.15,l.22-29)，通過引用結合到本文中；美國專利號7,494,815(col.7,l.19-col.11,l.24)，通過引用結合到本文中；美國專利號8,124,792(col.2,l.13-col.4,l.5和col.7,l.11-col.17,l.20)，通過引用結合到本文中；和美國專利號5,296,599(col.4,l.66-col.5,l.32和col.5,l.66-col.7,l.28)，通過引用結合到本文中。而且，所述方法可以是制備其它標記葡糖基胺，包括從備選的標記試劑衍生的那些的基礎。如在此描述的，這樣的標記試劑可具有可供選擇的反應性基團，例如異氰酸酯、異硫氰酸酯或亞胺酸酯/硫代亞胺酸酯(thioimidates)，和/或備選的官能團例如荷電標記以提高負離子模式質譜分析。選擇和控制標記反應的條件，包括溫度、有機溶劑組成、有機溶劑濃度、緩沖液組成、ph、離子強度、摩爾過量的試劑，和時間，以便實現(xiàn)伯胺和羥基之間的所需反應選擇性。進而，標記聚糖的得率被優(yōu)化，而所謂“過度標記的”聚糖(由>1個標記修飾的聚糖/葡糖基胺)的生成被最小化。包含含親水性胺的化合物(乙二胺)的猝滅溶液也可使用。這種猝滅溶液不僅控制允許葡糖基胺與標記試劑反應的時間，而且還將反應的ph移至升高的ph(>10)，這提高標記聚糖在高有機溶劑(即>50%乙腈)中的溶解性，從而有利于基于親水相互作用色譜(“hilic”)的下游spe程序。從糖蛋白釋放的聚糖在其中蛋白質物質尚未從混合物中有意耗盡的條件下在溶液中標記。示例性標記反應緊接下面顯示。為開發(fā)和優(yōu)化用nhs氨基甲酸酯試劑和/或nhs酯試劑標記葡糖基胺的方法的條件，使n-琥珀酰亞胺基n-甲基氨基甲酸酯，一種小的nhs氨基甲酸酯試劑(標記試劑-4)與單肽，緩激肽反應。這種肽被用作葡糖基胺的代用品，鑒于葡糖基胺分解為具有醛末端的還原糖，其在各獨立的實驗中不易被研究。tarentino,a.l.etal.,2-iminothiolane:areagentfortheintroductionofsulphydrylgroupsintooligosaccharidesderivedfromasparagine-linkedglyacns,glycobiology1993,3(3),279-85。緩激肽僅含有一個伯胺(其n-末端)以及一個羥基，因而是一種優(yōu)化用于葡糖基胺衍生化的標記得率和選擇性的有用的工具。緩激肽還含有兩個高堿性精氨酸殘基，使得當n-末端被標記時，有可能通過lc-ms測定反應產物，而無電離效率方面的重大偏差的問題。通過測量%修飾的緩激肽群體(用單胺修飾)以及在其羥基處修飾(單羥基修飾或兩個位點修飾)的緩激肽，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)了其中標記得率和對于超過羥基的胺的反應選擇性是最優(yōu)的反應條件。如圖2-5中所示，提供%修飾對比摩爾過量的試劑的許多圖示。此外，例舉了對于這種類型反應的最佳條件的發(fā)現(xiàn)，包括：如圖2中所示的溫度，如圖3中所示的有機溶劑組成，如圖3中所示的有機溶劑濃度，如圖4中所示的緩沖液組成，如圖4中所示的ph，和如圖5中所示的離子強度。簡言之，當：(1)溫度在環(huán)境至低于-環(huán)境溫度；(2)二甲基甲酰胺(dmf)被用作有機溶劑；(3)dmf占不超過20-30%的反應混合物；(4)采用在ph7.9和ph8.2之間的磷酸鈉溶液緩沖液，和(5)磷酸鹽濃度維持在≤50mm時，以最小水平的過量標記獲得高標記得率的衍生的化合物。過量標記少于約1摩爾%，更優(yōu)選約0.0-約0.5摩爾%，和在一些實施方案中約0.0-約0.2%。此外，緩沖液濃度可以是在約5mm-約1000mm之間，或在一些實施方案中為約5mm-約200mm或約5mm-約100mm或約5mm-50mm?？梢垣@得高產率的標記葡糖基胺，其具有超過可修飾胺的約10-約2000，或約30-約1000，或約40-約500；或約50-約300之間范圍的量的摩爾過量的標記試劑。而且，盡管在得率方面不必然有利，有機溶劑已顯示可用于一些標記試劑例如標記試劑-1的溶解。發(fā)明人還發(fā)現(xiàn)20-30%dmf足以提高溶解性，而不嚴重影響標記反應的得率和選擇性(圖3)。為此理由，包含20-30%dmf的反應混合物是優(yōu)選的。如圖3中提供的，對于二甲亞砜(dmso)和二甲基甲酰胺(dmf)的有機溶劑組成和濃度作為標記反應的共溶劑被測試。dmso和dmf二者是極性非質子溶劑并都有大的介電常數(shù)(>20)和大的偶極矩。其它極性非質子溶劑包括四氫呋喃(thf)和乙腈。具有高極性，這些溶劑溶解荷電物質，包括各種陰離子和親核試劑例如cn(-)和ho(-)。沒有氫鍵，親核試劑在溶液中是相對“自由的”且更具反應性的。因此，特別可用于本方法中的溶劑包括非-親核的、極性非質子溶劑。一般地，非質子溶劑的共同特征包括：(1)可接受氫鍵的溶劑，(2)溶劑沒有酸性氫中心(丙酮和酯不滿足這一標準)；和(3)溶劑溶解有機鹽。極性非質子溶劑是將溶解許多鹽，但缺乏酸性氫的溶劑。這種類型的溶劑常常具有中間介電常數(shù)和極性。然而，如上所注明的，某些極性非質子溶劑既具有高介電常數(shù)，又具有高偶極矩，另一個實例是乙腈(“mecn”)和hmpa(六甲基磷酰胺)。為限定最適反應時間和甚至更特別地，為限定反應在其結束前必須被允許繼續(xù)進行的時間，執(zhí)行基于緩激肽測定的時程研究。圖6顯示在通過加入二乙胺終止反應前，來自標記試劑-4與緩激肽反應不同時間長度的時程實驗的結果。如在圖6中所示，為獲得標記化合物與總伯胺濃度的最適摩爾比例，使用500-倍、400-倍、300-倍、200-倍和100-倍摩爾過量的濃度的標記試劑-1進行標記反應。這個時程顯示nhs氨基甲酸酯的反應在概述的條件下，在120秒后有效地完成。為了用葡糖基胺標記實施，因此優(yōu)選在進行另外的樣品處理之前，允許nhs氨基甲酸酯反應繼續(xù)進行2-10分鐘。因此，反應時間的范圍可在約10秒-約30分鐘之間，或在一些實施方案中，反應時間是約30秒-約10分鐘或優(yōu)選地，反應時間是在約2分鐘-約5分鐘之間。已采用上述方法來標記從幾種單克隆抗體，包括鼠igg和從鼠sp20細胞系表達的嵌合igg(西妥昔單抗)釋放的n-聚糖。為制備標記的n-聚糖，用肽n-糖苷酶f(pngasef)使糖蛋白樣品去糖基，接著與標記試劑于室溫下反應。標記試劑溶解于無水二甲基甲酰胺(dmf)中至127mm的濃度。去糖基化混合物和試劑溶液隨后以2.5:1體積比混合，以生產包含大約36mm標記試劑和4.8μm釋放的n-聚糖(以葡糖基胺的形式)的反應混合物。在這些條件下，葡糖基胺與源自樣品的任何其它胺物質(最重要的是前體糖蛋白的蛋白性胺)一起存在于反應混合物中。糖蛋白傾向于含有許多比n-聚糖位點更加蛋白質性的胺(即賴氨酸殘基)。因此，去糖基化混合物中最豐富的胺將是蛋白質性胺。發(fā)明人還發(fā)現(xiàn)，在速度和再現(xiàn)性方面，有意維持樣品中的蛋白質性胺是有利的。因此，較高濃度的標記試劑(即標記試劑-1)可加入到反應混合物中，且進而任何其它未說明的胺和親核試劑對標記的產率具有不重要的影響。結果，葡糖基胺的標記在樣品之間將是更可重現(xiàn)的。此外，標記試劑的量可以更容易對胺修飾的所需特征進行調整。例如，高得率的標記葡糖基胺可以更容易地獲得，伴有較少的生產過度-標記的聚糖物質的問題。作為備選，標記反應(有時在此也稱為“衍生化”或“衍生化步驟”)可以在從去糖基化混合物耗盡蛋白質物質后進行。igg樣品含有大約75種蛋白質性胺。因此，基于igg的、含有約4.8μm葡糖基胺(2個聚糖；每個重鏈上各一個)的釋放的聚糖混合物將含有至少180μm的總伯胺組合物。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)在這些條件下，生物樣品的所需修飾可通過實施約18-約180mm的標記試劑濃度獲得，該濃度代表超過總伯胺濃度的范圍為約100-約1000倍摩爾過量的試劑。為生產最佳標記得率和相對低水平的過度-標記聚糖(≤0.24%)，采用至少約200-倍摩爾過量的條件是優(yōu)選的(圖7)。一般地，允許標記反應繼續(xù)進行最少約5分鐘。然而標記反應可以較短的時間(即，數(shù)秒)發(fā)生。通過加入猝滅溶液，標記反應終止。猝滅溶液含有乙二胺/純水/乙腈的約5:5:90(v/v/v)混合物。通過加入猝滅溶液，通過加入顯著濃度的胺(>100mm)以清除剩余的、未反應的標記試劑來終止標記反應。猝滅溶液也將反應混合物的ph從約6.5-約9的ph移至大于10的ph。移動至堿性ph確保標記的葡糖基胺以及反應副產物(其可包括脲-連接的分子)保持可溶性。通過加入猝滅溶液提供的高ph使標記的質子親和力/荷電標簽基團去質子化，因此在高有機/低極性溶液中提高溶解性。這有利于依賴聚糖的極性的樣品制備程序，如當基于hilic的spe被用來從標記反應混合物富集標記的聚糖時的情況。yu,y.etal.,arapidsamplepreparationmethodformassspectrometriccharacterizationofn-linkedglyacns,rapidcommunmassspectrom2005,19(16),2331-6。如果溶液的ph不改變，反應副產物和標記葡糖基胺二者可共同沉淀，特別是當在衍生化步驟期間使用磷酸鹽緩沖液時。如在以下實施例ii中所述，猝滅溶液以約9:約1(9:1(v/v))的體積比被加入到標記反應混合物中。在該步驟后，終止標記反應，并使反應產物溶解于與hilicspe相容的溶液中。胺在猝滅溶液中的特性對該程序是重要的。胺應是明顯親水性的。乙二胺因此是猝滅溶液的優(yōu)選的胺。在其它方面，如通過圖8的數(shù)據(jù)所示的，其它疏水性胺例如異丙胺和己胺已被測試并發(fā)現(xiàn)當樣品經帶有熒光檢測的lc分析時，產生由于反應副產物所致的不需要的水平的背景。為分離衍生的葡糖基胺，親水性spe吸附劑，例如waterssep-pakaminopropyl、watersoasishlb，或watersoasiswax，可以被調節(jié)用于spe，此后用來處理猝滅的、acn-稀釋的樣品。waterssep-pakaminopropyl柱芯具有中等極性的、具有弱堿性表面的基于二氧化硅的鍵合相。該吸附劑可以被用作具有對酸性/堿性分析物的不同選擇性的極性吸附劑，或用作在低于ph8的含水介質中的弱陰離子交換劑。對于這種類型的柱芯的應用包括酚和酚類色素、石油餾分、糖和藥物和代謝物的提取。柱芯被設計附接于用于可靠的、正壓流的泵和注射器以加快樣品處理時間。柱芯還配有可拆卸的貯庫并在真空輔助流設備和某些自動系統(tǒng)上使用。spe可同樣地用小型化的96-孔格式化裝置執(zhí)行。裝載后，spe吸附劑可以經洗滌，以進一步促使反應副產物的移除。促進從反應副產物選擇性地富集標記葡糖基胺的條件已被發(fā)現(xiàn)。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)涉及1:14:85(v/v/v)甲酸/水/乙腈的spe洗滌步驟有效減少反應副產物，當檢測器飽和無效峰和傾斜基線時，其在獲得的樣品的lc色譜圖中得到證明?？捎糜谶@個方面的其它hilicspe洗滌溶劑包括0.3:14.7:85(v/v/v)磷酸/水/乙腈。有用的hilicspe洗滌溶劑可在酸組成中變化，例如，當有機溶劑組成是約50-約100%體積時，從約0.01至約10%變化，或當有機溶劑組成是約60-約98%體積時，從約0.05至約5%，或當有機溶劑組成是約70-約96%時，從約0.3至約3%變化，當有機溶劑組成是約80-約95%體積時，從約0.1至約3%變化。在spe期間已采用幾種洗滌條件。如在圖9a、9b和9c中所示，洗滌條件對標記葡糖基胺獲得的熒光色譜圖具有影響。1:14:85(v/v/v)甲酸/水/乙腈有效減少熒光背景并且還有效將荷載樣品的ph從高ph移至低ph，鑒于據(jù)報道高ph引起n-乙酰基葡糖胺殘留物差向異構化為n-乙?；事短前罚@是一個重要的考慮因素。liu,y.etal.,investigationofsamplepreparationartifactsformedduringtheenzymaticreleaseofn-linkedglyacnspriortoanalysisbycapillaryelectrophoresis,analchem.2009,81(16),6823-9。用酸性1:14:85(v/v/v)甲酸/水/乙腈洗滌溶液洗滌快速移動荷載樣品的ph也確?；诙趸璧膕pe吸附劑的溶解最小化。pettersson,s.w.etal.,chemicalstabilityofreversedphasehighperformanceliquidchromatographysilicaundersodiumhydroxideregenerationconditions,jchromatogra2007,1142(1),93-7。如在此描述的，高ph/低phhilicspe處理減少在標記葡糖基胺的分析期間遭遇的色譜背景。然而，色譜背景和hilic柱的無效時間附近的洗脫峰已被發(fā)現(xiàn)通過使用hepes(2-[4-(2-羥基乙基)哌嗪-1-基]乙磺酸)而非磷酸鹽來緩沖標記反應，進一步減少強度。這已導致具有較少強度的色譜背景的spe洗脫液。見圖12a和12b。hepes有利地改變了分布、溶解性，或試劑副產物的spe選擇性并可以這樣做而無需猝滅溶液。因此，hepes緩沖的溶液可以用于去糖基化和釋放的n-葡糖基胺的隨后的標記。此外，可以使用緩沖兩性離子化合物(像hepes)，并具有約7-約9之間的pka的為非-親核的其它緩沖液，包括，但不限于ada(n-(2-乙酰胺基)-2-亞氨基二乙酸)、bes(n,n-雙(2-羥基乙基)-2-氨基乙磺酸)、bicine(n,n-雙(2-羥基乙基)甘氨酸)、dipso(3-(n,n-雙[2-羥基乙基]氨基)-2-羥基丙烷磺酸)、epps(4-(2-羥基乙基)-1-哌嗪丙烷磺酸)、hepbs(n-(2-羥基乙基)哌嗪-n′-(4-丁烷磺酸))、mobs(4-(n-嗎啉代)丁烷磺酸)、mops(3-(n-嗎啉代)丙烷磺酸)、mopso(3-(n-嗎啉基)-2-羥基丙烷磺酸)、pipes(1,4-哌嗪二乙磺酸)、popso(哌嗪-n,n′-雙(2-羥基丙烷磺酸))。緩沖化合物為中性或陽性(而非陰性)的電離狀態(tài)可進一步減少色譜背景。因此，可使用陽離子的、非-親核緩沖化合物，例如叔胺：tea(三乙基氨)、bis-tris(2,2-雙(羥基甲基)-2,2′,2″-次氮基三乙醇)、bis-tris丙烷(1,3-雙[三(羥基甲基)甲基氨基]丙烷)。此外，在線spe可備選地用于替代離線spe。在線spe通常以一維捕集-洗脫色譜的形式執(zhí)行，其中所謂“捕集”柱經由流體切換機制與分析柱配對。捕集柱通常包含大顆粒吸附劑，以使高線性速度加載可以實現(xiàn)，同時在線spe的流出物轉向廢物。樣品被注射到捕集/在線spe柱上并洗掉基質成分和污染物。隨后，來自捕集柱的流出物被導向分析柱并展開梯度，以洗脫和分離樣品的成分。為幫助實現(xiàn)最佳的色譜，捕集柱的靜止相必須表現(xiàn)出比分析柱的靜止相更低的保持力。捕集和分析柱之間的這種匹配確保分析物再聚集于分析柱上。從而梯度洗脫使分離具有與通過直接注射分析物至分析柱上另外獲得的分辨力相匹配的分辨力。通常實施捕集-洗脫色譜用于反相分離，但不用于hilic分離。同樣，發(fā)明人已發(fā)現(xiàn)hilic靜止相保持力用于一種新的類型的分析物：聚糖，包括標記聚糖、葡糖基胺，或標記葡糖基胺。用于最佳在線spe/捕集-洗脫色譜的hilic吸附劑和靜止相也已被發(fā)現(xiàn)。特別是，發(fā)明人已發(fā)現(xiàn)聚合物的、親水親脂平衡(hlb)吸附劑(watersoasishlb)顯示出對于捕集靜止相的理想的聚糖保持力。特別地，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)在大約10:90水/乙腈的條件下，oasishlb保留聚糖。同時，聚糖開始從具有11-15%水的含水強度的oasishlb洗脫。這種hilic保持力是獨特的，因為當與通常用于聚糖hilic色譜的靜止相，例如酰胺-鍵合或多元醇(多羥基)鍵合靜止相的保持力比較時，要弱大約10%乙腈。oasishlb是不僅包含非極性部分，而且還包含重復親水性酰胺部分的聚合物吸附劑。這種結構為它提供了顯著的hilic保持力，其已被發(fā)現(xiàn)對捕集/在線spe柱是有利的。更特別地，對于葡糖基胺(聚糖)的在線spe，oasishlb捕集柱(即2.1x30mmwatersoasishlb,20μm粒徑)可以與用酰胺鍵合的有機二氧化硅顆粒(即2.1x50mm,watersglycanbehamide130?1.7μm)填充的分析柱配對。聚糖被荷載到在線spe/捕集柱上，同時流出物通過一些流體學機制被轉移到廢物中。標記葡糖基胺吸收到spe柱中的吸附劑并以用高有機流動相，例如88%acn以相對快速的流速洗滌。流動相組合物也可用添加劑例如12:88(v/v)的1%的強氨溶液/h2o:acn改變。來自oasishlbspe柱的流出物在洗滌步驟后可以被重新導向分析hilic柱。在洗滌步驟期間，衍生化副產物和樣品基質的其它成分被排出到廢物中。因此，洗滌經設計以防止干擾。此外，通過使用在線spe，洗滌溶液通常與吸附劑接觸只有很短的時間，進一步避免了基質干擾。在線spe還減少了分析師必須花費執(zhí)行手工樣品制備技術的時間量。然后，色譜條件例如在實施例2中描述的和適合聚糖的梯度洗脫的那些條件可被用來獲得分離和色譜圖。實施例1用于最大化標記得率和最小化過度-標記物質的條件的開發(fā)標記試劑(即標記試劑1-4)與10μm緩激肽反應。反應在不同的條件下進行；所有反應通過加入5m二乙胺hcl溶液(ph9.8)猝滅，以使最終的二乙胺濃度為大約800mm。獲得的反應產物通過lc-uv-ms，使用與waterssynaptg2-s組合的watersacquityuplch-classbio測定。將樣品以10μl的體積注入到acquityuplccshc18c18,130?,1.7μm,2.1x50mm柱中。于60℃的溫度下并以0.3ml/min的流速，使用包含在水中的0.1%tfa(v/v)，在acn中的0.1%tfa(v/v)，在acn中的0.1%fa(v/v)，和在acn中的0.1%fa(v/v)的流動相之間的四元梯度執(zhí)行分離。洗脫物質通過uv吸光度(10hz,214nm)和通過電噴霧離子化質譜(100-2000m/z,2hz)檢測。通過以上處理獲得的數(shù)據(jù)在圖2-6中呈現(xiàn)。watersacquityuplch-classbio是設計有非-不銹鋼材料的生物-惰性流路徑，以保持大的生物分子完整并通過色譜柱移動的色譜系統(tǒng)。它利用專門打算用于分析蛋白質、肽、核酸和聚糖的低于2-μm混合粒子化學。它具有流量通過針頭注射器(flow-through-needleinjector)和四元溶劑傳遞系統(tǒng)，提供運行多個色譜模式(包括，但不限于，反相(rp)、離子交換(ex)、尺寸排阻(sec)或親水性相互作用(hilic)色譜)的能力。這種色譜系統(tǒng)使用允許二元、三元或四元梯度操作與任選加入的用于待使用的額外溶劑的六端口溶劑選擇閥的多-溶劑共混。此外，這種系統(tǒng)允許用戶改變流動相調節(jié)劑和有機溶劑的濃度。代替手工制備溶劑混合物，這種系統(tǒng)使得純溶劑和濃縮儲備液按需要共混。當ph和離子強度由用戶指定時，它也提供自動調節(jié)和計算對所需條件需要的緩沖儲備液的比例。而且，系統(tǒng)減少體積并使頻帶展寬最小化以維持高效率的分離。它使用超低分散檢測器(ultra-low-dispersiondetectors)以維持能夠用于生物學應用的多個檢測需求的峰的完整性。此外，系統(tǒng)使用各種各樣的加熱器和多-柱管理器(柱切換)，以提供用于控制色譜選擇性和最高保留時間精度的低分散和精確的溫度管理。watersacquityuplch-classbio可與waterssynaptg2-si高清晰度質譜組合。waterssynaptg2-si是使用離子的碰撞截面(ccs)特性的高清晰度質譜系統(tǒng)，通過使用t-波離子遷移以提高生物分子分析的峰容量、特異性和靈敏性。waterssynaptg2-si裝配有較大的離子采樣孔口、增強真空泵配置和離子傳輸光學器件。這種二元-t-波、離軸設計將來自離子源的離子高效率轉移到四極ms分析儀，同時確保不需要的中性污染物被過濾掉。這增加了ms離子強度，同時使背景噪音最小化。與其它反相uplc柱比較，watersacquityuplccshc18(苯基-己基和氟代-苯基)柱提供替代的選擇性。這些柱使用15%碳負載，c18化學，具有2.1mm內徑、30mm長度、封端的，提供具有混合顆?；|的球形顆粒形狀，例如混合有機/無機顆粒。它們含有130?孔徑和低硅醇活性并能夠在從約ph1-約ph11的范圍內處理ph。實施例2從匯集的人igg和鼠igg1釋放的標記葡糖基胺的快速制備以類似的方式制備匯集的人igg(從血清)和鼠igg1的樣品。igg的凍干樣品在50mm磷酸鈉(ph7.9)中重新構成并與肽n-糖苷酶f(pngasef,newenglandbiolabs,p0705)混合。制備這種混合物以使igg濃度是大約1mg/ml和pngasef的活性濃度是大約25單位/μl。隨后，將這種混合物于37℃孵育1小時(產生鼠igg的fc區(qū)的完全去糖基化的條件)。在1小時孵育完成后，使去糖基化混合物冷卻至室溫，此后用等體積的50mm磷酸鈉(ph7.9)稀釋。同時，使標記試劑-1溶解于無水二甲基甲酰胺(dmf)中至127mm的濃度(假定標記試劑-1被純化為與nhs的1:1復合物)。去糖基化混合物和試劑溶液隨后以2.5:1體積比混合，以生產包含大約36mm標記試劑-1和4.8μm釋放的n-聚糖(和180μm的總伯胺濃度)和反應副產物(包括，但不限于，對應于標記試劑的胺水解產物和由這種胺和標記試劑產生的反應產物(即，脲連接的分子)的化合物)的反應混合物。反應被允許進行5分鐘，然后通過加入猝滅溶液(5:5:95(v/v/v)乙二胺/水/acn)終止。猝滅溶液以9:1的體積比加入到反應混合物中。此后，生成的猝滅的、acn-稀釋的樣品經歷spe，使用waterssep-pakaminopropylμelution板和真空驅動的spe。首先用水清潔各孔，然后用15:85(v/v)水/acn調節(jié)。隨后，將猝滅的acn-稀釋的樣品加載到各孔。吸附的樣品然后用包含1:14:85(v/v/v)甲酸/水/acn的溶液洗滌。最后，富集的、標記葡糖基胺使用包含100mm乙酸銨(ph7)、5%acn的洗脫劑從spe吸附劑洗脫。獲得的標記的葡糖基胺以spe洗脫液的形式直接分析，或者相反作為干燥(通過離心蒸發(fā))并重新構成的樣品分析。標記葡糖基胺的分析經由hilic分離和熒光和質譜檢測的組合(watersacquityuplch-classbiosystem與waterssynaptg2-s質譜配對)進行。用1.7μm酰胺-鍵合有機二氧化硅顆粒填充的2.1x50mm柱與包含50mm甲酸銨(ph4.5)的含水流動相(流動相a)和包含acn的流動相(流動相b)共同使用。含水樣品作為1μl體積注射并于60℃的溫度，根據(jù)梯度表2分離。標記的葡糖基胺使用熒光檢測器(5hz，激發(fā)λ=265nm，發(fā)射λ=425nm)和通過電噴霧離子化質譜(600-2500m/z,1hz)檢測。圖10呈現(xiàn)了代表從這種程序得到的樣品的色譜數(shù)據(jù)。表2時間(min)流速(ml/min)%a%b%c%d曲線初始0.4257500初始150.4524800615.50.2100000616.50.2100000617.70.2257500619.20.4257500621.70.42575006實施例3從西妥昔單抗釋放的標記葡糖基胺的快速制備采用在實施例2中所述類似的程序，除了采用獨特的去糖基化處理，從西妥昔單抗，一種從鼠sp20細胞表達的嵌合igg1制備標記葡糖基胺。圖11a和圖11b提供了代表從這種程序產生的西妥昔單抗樣品的色譜數(shù)據(jù)。實施例4圖13a、13b和13c提供用標記試劑-1標記的n-葡糖基胺(通過帶有watersoasishlb的在線spe純化，然后使用用酰胺-鍵合靜止相填充的分析柱分離)獲得的實施例hilic熒光色譜圖。可以使用對watersoasishlb的備選方案。由二氧化硅或有機二氧化硅基質顆粒構成的未鍵合或二醇-鍵合的吸附劑已被發(fā)現(xiàn)顯示出將使得它們?yōu)橛杏玫牟都o止相選擇的保持力。更特別地，圖13b是對通過具有50mm甲酸銨(ph4.5)的流動相a和acn的流動相b的在線spe純化的n-葡糖基胺獲得的色譜圖。而且，緊接下面的表3是其spe梯度表。圖13c是對通過具有50mm甲酸銨(于ph4.5)的流動相a，acn的流動相b和1%(v/v)氫氧化氨的流動相c的在線spe純化的n-葡糖基胺獲得的色譜圖。表4是其spe梯度表。表3表4如在此描述的，可以使用親水親脂平衡聚合物吸附劑的變體，包括，但不限于phenomenexstratax(一種具有用于分析物-吸附劑相互作用的多個保留模式的含有n-乙烯基吡咯烷酮的官能化聚合物吸附劑)、thermohyperseppep(用脲官能團修飾的多孔dvb材料填充的柱芯)、agilentsampliqopt(用酰胺修飾的二乙烯基苯聚合物樹脂填充)、watersoasiswax、watersoasiswcx、watersoasismax，和watersoasismcx。phenomenexstratax吸附劑是針對中性和芳族分析物的具有表面積800sq.m/g的基于聚合物的反相官能化吸附劑，提供在侵襲性的高有機洗滌條件下中性、酸性或堿性化合物的保留。這種吸附劑依賴于3種保留機制：π-π鍵合、氫鍵合(偶極-偶極相互作用)和疏水性相互作用。這種類型的吸附劑是耐ph的并可處理0-14的ph范圍。thermohypersepretainpep柱芯用脲官能團修飾的多孔聚苯乙烯dvb材料填充，所述材料可提供極性和非-極性分析物的回收。這些柱提供具有30-50μm粒徑和30mg床重量的吸附劑。watersoasis吸附劑是spe吸附劑的家族，目前以商品名oasis銷售。這些吸附劑在ph極端和在寬范圍的溶劑中是穩(wěn)定的。這些吸附劑具有良好的極性化合物的保留性，和相對疏水性保留能力為傳統(tǒng)的基于二氧化硅的spe吸附劑像c18的3倍。另外的提取產品包括產品例如watersoasishlb，一種用于酸性、中性和堿性化合物的通用吸附劑。oasishlb是從特定比例的兩個單體，親水性n-乙烯基吡咯烷酮和親脂性二乙烯基苯制得的親水-親脂-平衡的、水-可濕潤的、反相吸附劑。watersoasiswax柱芯是已被優(yōu)化用于強酸性化合物的高選擇性的聚合物反相、弱陰離子交換、水-可濕潤的混合-模式聚合物吸附劑。watersoasiswcx(弱陽離子交換)是由共聚物基質制得的混合-模式、水-可濕潤的spe吸附劑，其提供全部類型的分析物，尤其是強堿(pka>10)和季胺的保留性。保留機制是混合模式(離子交換和反相二者)。watersoasismax(混合-模式陰離子交換)是被優(yōu)化獲得用于提取具有陰離子交換基團的酸性化合物(pka<1)的較高選擇性和靈敏性的混合-模式聚合物吸附劑。這種吸附劑是水-可濕潤的。watersoasismcx(混合-模式陽離子交換)是優(yōu)化用于保留具有pka2-10的堿性化合物的混合-模式聚合物吸附劑。實施例5標記n-聚糖的hilic-熒光-esi-ms(ms/ms)分析為評價響應因子，標記的n-聚糖經由hilic分離結合熒光和質譜檢測，使用uhplc色譜儀(acquityuplch-classbio,waters,milford,ma)分析。使用用1.7μm酰胺-鍵合有機二氧化硅顆粒(acquityuplcglycanbehamide130?，waters,milford,ma)填充的2.1x50mm或者2.1x150mm柱以及包含50mm甲酸銨(ph4.4)的含水流動相和包含acn的另一種流動相。樣品作為1μl含水體積或10μlacn/dmf體積注射并于60℃根據(jù)梯度分離。標記n-聚糖使用熒光檢測器(5hz掃描率，gain=1,acquityuplcflr,waters,milford,ma)，使用激發(fā)和發(fā)射波長檢測。洗脫聚糖也通過陽離子模式電噴霧離子化質譜，使用離子遷移率能力qtof質譜儀檢測(synaptg2-s,waters,milford,ma)，用3.0kv的毛細管電壓，120℃的源溫度，350℃的去溶劑化溫度，和80v的樣品錐電壓操作。以1hz的頻率，大約20,000的分辨率，獲得在500-2500m/z的范圍內的質譜。下表5提出與在這個實施例中描述的聚糖標記相關的結構和縮寫，以及所用的試劑。表5。結果和討論高靈敏性熒光和ms檢測已評價rfms標記提供n-聚糖分析的靈敏性。特別是，rfms標記聚糖的響應因子已成為針對用備選的試劑標記的聚糖的響應因子的基準。最密切相關的、可市售獲得的對rfms的替代選擇是氨基苯甲酰胺或iab的nhs氨基甲酸酯類似物(cook,k.s.etal.,biologicals,40(2),109-17(2012)。圖14a和14b呈現(xiàn)對于等量的從鼠igg1單克隆抗體釋放的并用rfms和iab分別標記的n-聚糖的hilic熒光和基礎峰強度(bpi)ms色譜圖?；谟^察到的色譜峰面積，對于在igg概況中的最豐富的聚糖，巖藻糖基化雙分枝的fa2聚糖(oxford注釋)，確定了熒光和ms檢測的響應因子(圖14c)。harvey,d.etal,proteomics,9(15),3796-801(2009)；glycobase3.2http://glycobase.nibrt.ie(2015年1月6日訪問)。圖14a是rfms的hilic-flr-ms的結果和圖14b是來自抗桔霉素鼠igg1的iab標記的n-聚糖的結果。熒光(flr)色譜圖和基礎峰強度(bpi)ms色譜圖被顯示。使用用1.7μm酰胺鍵合有機二氧化硅(130?)靜止相填充的2.1x50mm柱分離標記聚糖(自0.4μg糖蛋白，1μl含水注射液)。如在圖14c中所示，對于rfms和iab標記聚糖的響應因子(作為每份從1μg抗桔霉素鼠igg1產生的n-聚糖樣品的fa2峰面積測量)。熒光(flr)和ms(基礎峰強度)響應因子被分別顯示。分析按一式兩份進行。發(fā)明人的對于fa2聚糖的結果表示rfms標記的聚糖比用iab標記的n-聚糖生產2倍的更高的熒光信號，且更令人吃驚地，接近800倍的更大的ms信號。以類似的方式，rfms標記也與常規(guī)的2-ab標記比較。為描繪這樣的比較，從具有rfms或者2-ab的匯集的人igg制備的n-聚糖通過以等效質量負載的hilic-flr-ms分析(分別為圖15a和15b)。圖15a描述rfms的hilic-flr-ms和圖15b描述來自匯集的人igg的2-ab標記n-聚糖。熒光(flr)色譜圖和基礎峰強度(bpi)ms色譜圖被顯示。使用用1.7μm酰胺-鍵合有機二氧化硅(130?)靜止相裝填的2.1x50mm柱，分離標記的聚糖(~14pmol總聚糖、1μl含水注射液)。fa2聚糖的量經由兩點外部校準(two-pointexternalcalibrations)，用定量標準(rfms衍生的丙胺和2-ab標記的三乙?；鶜と?校準。在圖15c中，用于rfms和2-ab標記的聚糖的響應因子(作為通過外部校準測定的每皮摩爾的fa2的fa2峰面積測量)。熒光(flr)和ms(基礎峰強度)響應因子被分別顯示。分析按一式兩份進行。鑒于快速標記和還原性胺化通過明顯不同的程序進行，外部校準使用定量標準建立，以測定從hilic柱荷載和洗脫的fa2聚糖的量。使用這些校準量的fa2聚糖計算的響應因子在圖15c中提供。與2-ab標記聚糖對比，rfms標記聚糖以優(yōu)越的靈敏性，特別是以14倍更高的熒光和160倍更大的ms信號被檢測。為總結以上的觀察結果，發(fā)明人已繪制了iab和2-ab的響應因子作為針對rfms的響應因子的百分比(圖16)。圖16顯示聚糖標記性能的相對百分比(%)。響應因子顯示為對比rfms標記n-聚糖的熒光和ms響應因子的百分比。比較結果從公布的n-聚糖的比較外推，其中已發(fā)現(xiàn)當與2-ab比較時，普魯卡因酰胺提供可比較的熒光和多達50倍的更大的esi-ms靈敏性。熒光和ms靈敏性的獲得在該圖中是明顯的，因為它描繪了歸一于rfms響應因子的iab和2-ab響應因子。在圖16中，也提供用另一個備選的標記試劑，普魯卡因酰胺的還原性胺化的相對性能。普魯卡因酰胺是氨基苯甲酰胺的化學類似物，其最近已顯示當它們通過hilic-esi(+)-ms分析時，提高還原性胺化的聚糖的離子化。先前的研究已顯示當與2-ab標記聚糖比較時，普魯卡因酰胺標記的聚糖獲得可比較的熒光信號，和10-50倍更大的ms信號，該觀察由發(fā)明人自身的2-ab和普魯卡因酰胺標記的n-聚糖分析證實。klapoetke,s.etal.,j.pharmbiomedanal53(3),315-24(2010)。與普魯卡因酰胺比較，rfms因此被預測提供，最小3-倍的ms靈敏性的增加。由于這兩種標記含有叔胺部分，提示rfms標記聚糖的優(yōu)越的電離作用源自比普魯卡因酰胺標記更疏水的rfms標記是合理的。確實，先前的研究已顯示對聚糖標記添加疏水性表面積導致增加的電噴霧電離。walker,s.h.etal,jamsocmassspectrom22(8),1309-17(2011)；bereman,m.s.etal.,chemcommun(camb)26(2),237-9(2010)。除了相對疏水性核心結構外，rfms標記還具有強堿性側鏈，因此是值得注意的。更值得注意的是，以上響應因子數(shù)據(jù)提示rfms標記提供對于n-聚糖的hilic色譜特性的前所未有的熒光和ms靈敏性。實施例6氨基酸的快速標記的預示方法在此描述的方法和試劑可被用來執(zhí)行氨基酸的快速標記。與適宜的緩沖劑和稀釋劑一起，可以進行氨基酸的柱前衍生化(pre-columnderivatization)和分析。為重新構成粉末形式的衍生試劑，在設置于55℃的加熱塊或其它裝置上加熱試劑和稀釋劑的小瓶。重新構成的試劑通常在乙腈中在10mm的范圍內。重新構成的試劑可于室溫下貯存通常至多1周。然而，可以利用備選的溶劑和溫度。為衍生氨基酸樣品，將60μl的硼酸鹽緩沖液加入到在6x50mm樣品管中重新構成的樣品中并渦流。然后加入20μl的重新構成的試劑并立即渦流數(shù)秒鐘。允許孵育混合物，通常于室溫下1-5分鐘。然后將試管中的內容物轉移至小瓶并用含有硅樹脂襯隔膜的蓋密封。將小瓶于55℃加熱10分鐘。如果緊密封閉并防止蒸發(fā)，氨基酸衍生物可于室溫下貯存至多1周。因此，雖然設計了葡糖基胺的制備，所述方法可應用于氨基酸標記(不管氨基酸殘基是游離的或是蛋白質和肽中的成分)。當前第1頁12